Toll样受体3对乳腺癌细胞耐紫杉醇的影响及其机制

Effect and mechanism of Toll-like receptor 3 on breast cancer cells resistant to paclitaxel

摘要

目的 探讨Toll样受体3（Toll-like receptor 3，TLR3）对乳腺癌细胞MDA-MB-231耐紫杉醇的影响及其作用机制。 方法 采用浓度递增诱导法建立耐紫杉醇MDA-MB-231乳腺癌细胞株，通过3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-5-（3-羧甲氧基苯基）-2-（4-磺酸苯基）-2H-四唑［3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-5-（3-carboxymethoxyphenyl）-2-（4-sulfophenyl）-2H-tetrazolium，MTS］试剂盒、细胞流式术和台盼蓝染色检测过表达TLR3对耐药细胞增殖和凋亡率的影响；用荧光显微镜观察过表达TLR3对耐药细胞摄取紫杉醇能力的影响；用实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）和蛋白免疫印记（Western Blotting）检测过表达TLR3对耐药细胞中下游基因表达的影响。 结果 成功构建的耐紫杉醇MDA-MB-231乳腺癌细胞株中TLR3表达水平显著降低；过表达TLR3可显著恢复紫杉醇对乳腺癌细胞增殖的抑制作用，并增强由紫杉醇诱导的细胞凋亡。机制研究发现，耐药细胞中抗凋亡基因p21的表达显著升高，而过表达TLR3可显著抑制p21的表达。 结论 乳腺癌细胞对紫杉醇的耐药性与TLR3表达下调有关，上调TLR3可通过抑制抗凋亡基因p21的表达，恢复紫杉醇对乳腺癌细胞增殖和存活的抑制作用，为逆转乳腺癌紫杉醇耐药提供潜在靶点和理论依据。

Abstract

Objective To investigate the effects of Toll-like receptor 3 （TLR3） on the resistance of MDA-MB-231 breast cancer cells to paclitaxel and its underlying mechanisms. Methods Paclitaxel-resistant cells were developed by treating MDA-MB-231 cells with gradually increasing dosages of paclitaxel. 3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-5-（3-carboxymethoxyphenyl）-2-（4-sulfophenyl）-2H-tetrazolium （MTS） kit， flow cytometry and Trypan blue staining were performed to determine the proliferation and apoptosis rate in paclitaxel-resistant cells with TLR3 over-expression. The uptake of paclitaxel by cells was determined using immunofluorescent microscopy. The expression of downstream targets of TLR3 was evaluated by real-time quantitative polymerase chain reaction （RT-qPCR） and Western blotting. Results A paclitaxel-resistant cell line was successfully established， and TLR3 expression was found to be decreased in these resistant cells. Over-expression of TLR3 in resistant cells restored the inhibitory effects of paclitaxel on cell proliferation and survival. Mechanistically， the expression of the anti-apoptotic gene p21 was significantly elevated， while over-expression of TLR3 could markedly suppress p21 expression. Conclusion The resistance of breast cancer cells to paclitaxel is associated with the downregulation of TLR3 expression. Enhancing TLR3 expression can restore the inhibitory effect of paclitaxel on breast cancer cells proliferation and survival by down-regulating p21 expression. These findings provides a potential therapeutic target and basis for reversing resistance to paclitaxel in breast cancer.

Graphical abstract

关键词

乳腺癌 / Toll样受体3 / 紫杉醇 / 增殖 / 凋亡 / p21

Key words

breast cancer / Toll-like receptor 3 / paclitaxel / proliferation / apoptosis / p21

乳腺癌是女性中常见的肿瘤。世界卫生组织（world health organization， WHO）统计数据显示，2020年全世界约有230万乳腺癌患者，占所有新发癌症的11.7%，超过肺癌患者（220万例，11.4%）^［1］，成为全球发病率最高的癌症。预测到2040年，全球每年新增乳腺癌病例超3万例，死亡病例超1万例^［2］。中国女性乳腺癌发生率和死亡率呈逐年上升趋势^［3］。

三阴乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是侵袭性较高的乳腺癌亚型，占15%~20%，具有高异质性、预后差、发病早、易复发和转移等特点^［4-5］。TNBC的临床治疗以化疗为主，可用药物包括紫杉醇、顺铂、蒽环类药物和他莫昔芬，但致癌因素异质性和耐药性限制了其应用。紫杉醇是治疗TNBC的一线化疗药物，但在治疗中常出现耐药性，降低其临床疗效^［6-7］。因此，阐明TNBC对紫杉醇耐药性的新机制和靶点具有重要临床意义^［8］。

Toll样受体是固有免疫受体，主要表达于免疫细胞，通过感应外源病原微生物刺激激活免疫系统杀伤病原体^［9］。相关研究结果显示，乳腺癌细胞表达Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）并参与其发生和发展，成为治疗的新靶点^［10-11］。TLR3作为Toll样受体家族成员，在TNBC中高表达且与患者预后相关^［12］。本研究探究TLR3在介导TNBC细胞耐紫杉醇过程中的作用和机制，以期为临床治疗提供新靶点和药物。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Sanyo MCO-15AC型细胞培养箱（三洋电器股份有限公司）；Infinite 200 PRO型酶标仪（奥地利Tecan公司）；Criterion型电泳仪、GelDoc Go型凝胶成像系统，均购自美国Bio-Rad公司；湘仪L-550型台式低速大容量离心机（南京晓晓仪器设备有限公司）；Axio Scope A1型免疫荧光显微镜（德国Zeiss公司）。

1.2 试药

MTS检测试剂盒（批号ST1009，上海尚宝生物科技有限公司）；Dulbecco’s改良培养基（Dulbecco’s modified eagle medium， DMEM）（批号M200PRF500）、胎牛血清（批号26010074）、磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）（批号10010023），均购自美国Gibco公司；体积分数0.25%胰酶细胞消化液（批号C0201）、细胞凋亡检测试剂盒（批号C1062S）、体积分数4%多聚甲醛固定液（批号P0099）、Tris缓冲盐溶液-吐温（Tris buffered saline-Tween，TBST）缓冲溶液（批号ST673）、台盼蓝染液（批号ST798），均购自上海碧云天生物技术股份有限公司；异硫氰酸荧光素标记的紫杉醇（fluorescein isothiocyanate-paclitaxel，FITC-PTX）（批号Q-0124379，西安齐岳生物科技有限公司）；兔抗p21抗体（批号sc-397）、鼠抗3-磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体（批号sc-47724），均购自美国Santa Cruz公司；兔抗TLR3抗体（批号7074S，美国CST公司）；核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）逆转录试剂盒（批号AT101-02）、实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）试剂盒（批号AQ101-01），均购自北京全式金生物科技有限公司；TLR3过表达腺病毒（批号YKO-H707，广州源井生物科技有限公司）。

1.3 细胞

人乳腺癌细胞株MDA-MB-231，由南京市第二医院临床科研中心提供。

2 方法

2.1 细胞培养

MDA-MB-231细胞使用含体积分数10%血清及质量浓度1%青链霉素DMEM完全培养基，在37 ℃、含5% CO₂的培养箱中培养。当细胞密度达90%以上时进行传代，先用PBS洗涤细胞3次，再用体积分数0.25%胰酶消化30 s，之后用完全培养基终止消化，最后轻轻吹打混匀并转移至培养瓶中。

2.2 耐药细胞株的构建

采用梯度浓度法构建耐紫杉醇的MDA-MB-231细胞株（MDA-MB-231/paclitaxel细胞）。取处于对数生长期的MDA-MB-231细胞，以每孔1×10⁵个的细胞数量铺板于96孔板中，加入梯度稀释为40、60、100、120、150 nmol·L^-1的紫杉醇处理12 h。通过MTS测定细胞的IC₅₀值为100.30 nmol·L^-1，将20 nmol·L^-1作为初始处理浓度，待细胞密度达到40%~50%时，将培养基替换为不含药的培养基继续培养细胞至密度达到80%~90%，重复该步骤5次。待细胞能够在该浓度稳定生长后，提高浓度重复上述处理，最终获得能在100 nmol·L^-1紫杉醇中稳定生长的细胞，即为耐药细胞株。使用MTS法在490 nm处测定耐药细胞株在100、200、500、800、1 000 nmol·L^-1梯度浓度紫杉醇中各孔的吸光度（absorbance，A）值，计算细胞存活率，通过GraphPad Prism 6.0计算半数抑制浓度（median inhibition concentration，IC₅₀）值，进而计算细胞株耐药指数（resistance index，RI）。细胞相对存活率（%）=（给药组A值/对照组A值）×100%，RI=耐药细胞IC₅₀/亲代细胞IC₅₀。

2.3 细胞分组

对照组：野生型MDA-MB-231细胞；耐药组：MDA-MB-231/paclitaxel细胞；耐药+TLR3 过表达（over-expression，OE）组：实验中用感染复数（multiplicity of infection，MOI）为1×10⁸的TLR3过表达腺病毒感染MDA-MB-231/paclitaxel细胞，得到过表达TLR3的耐药MDA-MB-231细胞。

2.4 细胞计数

取处于对数生长期的细胞消化后计数，按每孔1×10⁵个的细胞数量接种于96孔板，加入紫杉醇后置于37 ℃、含体积分数5% CO₂培养箱中培养24 h。消化细胞并用完全培养基重悬，使用血球计数板于显微镜下对细胞进行计数。

2.5 Western Blotting法检测蛋白质的表达水平

将处理后的细胞用PBS洗涤3次，加入放射免疫沉淀法裂解缓冲液（radio immunoprecipitation assay lysis buffer，RIPA）于冰上裂解30 min。把裂解后的细胞转移至1.5 mL 的EP管中，以13 000 r·min^-1离心15 min，取上清并用二辛可酸（bicinchoninic acid assay，BCA）法检测蛋白浓度。取30 μg蛋白样并加入上样缓冲液，100 ℃变性5 min。使用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）在120 V恒压条件下电泳120 min，在冰上于300 mA条件下将蛋白转至硝酸纤维素（nitrocellulose，NC）膜120 min，用质量分数5%脱脂奶粉室温封闭120 min后，转入4 ℃冰箱，加入TLR3（1∶5 000）、p21（1∶1 000）、GAPDH（1∶1 000）一抗孵育过夜。用TBST洗涤条带后，加入对应二抗室温孵育120 min，再次用TBST洗涤后，使用化学发光法显色并成像。

2.6 免疫荧光法检测细胞摄取紫杉醇的情况

分别取处于对数生长期的耐药组和耐药+TLR3 OE组的细胞，以每孔1×10⁶个的密度接种于含有DMEM培养基的6孔板中，每组设置3个副孔，然后置于37 ℃、含体积分数5% CO₂的培养箱中培养24 h，随后加入终浓度为100 nmol·L^-1的FITC-PTX，避光继续培养120 min，用PBS洗涤细胞去除多余药物，用体积分数4%多聚甲醛固定20 min后，使用Hoechst溶液染细胞核，再用PBS洗涤细胞，最后用荧光显微镜检测荧光信号（FITC激发波长为480 nm，发射波长为520 nm）。

2.7 MTS检测细胞的活力

取处于对数生长期的细胞消化后计数，按每孔1×10⁵个细胞的密度接种于96孔板，加入紫杉醇，置于37 ℃、含体积分数5% CO₂的培养箱中培养48 h。加入20 μL MTS试剂，继续培养4 h后，用酶标仪检测上清在490 nm处的吸光度。

2.8 流式细胞术检测细胞的凋亡情况

取处于对数生长期的细胞消化后计数，按每孔1×10⁶个细胞的密度进行铺板，每组设置4个副孔，加入100 nmol·L^-1紫杉醇，于37 ℃培养24 h，吸弃上清液，用胰蛋白酶消化细胞后，用PBS洗涤3次，按试剂盒说明书对细胞进行处理后上机检测。

2.9 台盼蓝染色检测细胞存活情况

取处于对数生长期的细胞，按每孔1×10⁶个细胞的密度进行铺板，每组设置4个副孔，加入100 nmol·L^-1紫杉醇，在37 ℃培养48 h，吸弃上清液，用胰蛋白酶消化细胞后，按1∶1体积比取适量细胞和台盼蓝染液，混合均匀后镜下进行细胞计数。

2.10 RT-qPCR检测p21的表达水平

取处于对数生长期的细胞，消化重悬后转移至1.5 mL离心管中，以13 000 r·min^-1离心5 min后，吸弃上清，用PBS洗涤细胞后，加入1 mL总RNA提取试剂（total RNA extractor， TRIzol）裂解细胞，振荡3~5 min，室温静置10 min，加入250 μL氯仿，摇匀后静置2~3 min，4 ℃下以12 000 r·min^-1离心15 min，将上清液转移至1.5 mL EP管中，加入等体积异丙醇，在-20 ℃下放置15 min，随后在4 ℃下以13 000 r·min^-1离心10 min，用体积分数75%乙醇洗涤沉淀2次，以13 000 r·min^-1离心1 min，弃上清，风干乙醇后加入ddH₂O重悬RNA并检测浓度。使用逆转录试剂盒和RT-qPCR试剂盒进行逆转录和RT-qPCR检测。

2.11 统计学方法

采用SPSS 23.0软件对数据进行处理。计量资料用（\overline{x}±s）表示，两组间比较用t检验，多组比较用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 耐紫杉醇MDA-MB-231细胞株模型的构建

采用梯度浓度法构建耐紫杉醇的乳腺癌细胞株，用MTS法检测MDA-MB-231细胞和MDA-MB-231/paclitaxel细胞在不同浓度紫杉醇作用下的细胞活性。结果显示，耐药组的IC₅₀值为684.6 nmol·L^-1，RI为6.82，表明耐药细胞株构建成功。见图1。

3.2 对照组和耐药组TLR3表达情况的比较

为探究TLR3对乳腺癌细胞耐紫杉醇的影响，比较TLR3在对照组和耐药组细胞中的表达水平。结果显示，耐药组细胞TLR3的表达水平显著降低，表明TLR3表达降低可能参与调控乳腺癌细胞对紫杉醇的耐药性。见图2。

3.3 TLR3过表达对细胞摄取紫杉醇的影响

为排除TLR3通过影响细胞对紫杉醇的摄取而发挥作用，利用荧光素标记的紫杉醇检测不同组细胞对紫杉醇的摄取能力。结果显示，耐药组与耐药+TLR3 OE组细胞对紫杉醇的摄取能力比较，差异无统计学意义。表明TLR3不是通过影响细胞摄取紫杉醇来调节耐药性的。见图3。

3.4 TLR3过表达对耐紫杉醇乳腺癌细胞增殖的影响

为探究TLR3对乳腺癌细胞耐紫杉醇的影响，在耐药细胞中过表达TLR3并检测紫杉醇对其增殖的影响。细胞计数结果显示，经紫杉醇处理后，与对照组比较，耐药组细胞的数量显著增加；而在耐药组细胞过表达TLR3则可恢复紫杉醇对细胞增殖的抑制作用。这与MTS检测结果一致，即耐药组细胞活性显著增加，而过表达TLR3能逆转这一现象。这些结果表明，过表达TLR3可恢复紫杉醇对耐药乳腺癌细胞增殖的抑制作用。见图4。

3.5 TLR3过表达对耐紫杉醇乳腺癌细胞凋亡的影响

通过流式细胞术和台盼蓝染色检测TLR3过表达对耐紫杉醇乳腺癌细胞凋亡的影响。流式检测结果显示，与对照组细胞相比，耐药组细胞凋亡显著减少，而在耐药细胞中过表达TLR3则促进其凋亡。台盼蓝染色检测结果与流式细胞术检测结果相符。因此，过表达TLR3可恢复紫杉醇对耐药乳腺癌细胞存活的抑制作用。见图5。

3.6 过表达TLR3对抗调亡基因p21表达的影响

p21参与肿瘤细胞的耐药过程，通过Western Blotting检测过表达TLR3对p21表达的影响。qPCR结果显示，与对照组比较，耐药组细胞p21表达显著增加，而给耐药细胞过表达TLR3则抑制其表达。蛋白检测结果与qPCR结果一致。因此，MDA-MB-231细胞TLR3表达降低促进抗调亡蛋白p21表达，从而增强细胞对紫杉醇的耐药性。见图6。

4 讨论

紫杉醇作为临床治疗TNBC的一线化疗药物，虽对部分患者具有较好的治疗效果，但仍有30%~50%的患者会发生耐药^［8］。乳腺癌治疗过程中对化疗药物产生耐药性是临床治疗的难题，阐明其耐药机制并筛选关键调控分子对临床治疗具有重要意义。本研究通过体外构建耐紫杉醇的MDA-MB-231细胞株，发现耐药株中免疫受体TLR3的表达显著下调。功能学研究结果表明，在耐药株中过表达TLR3可恢复紫杉醇对细胞增殖和存活的抑制作用，其机制与抗凋亡蛋白p21的表达下调有关。

TLR3属于Toll样受体家族成员，主要表达于树突状细胞、巨噬细胞、B细胞等免疫细胞，能够识别病原微生物来源的双链RNA，进而激活相关免疫信号通路^［13］。现有研究结果显示，TLR3直接参与多种肿瘤的发生和发展。例如，在肝癌患者中，TLR3表达水平与其存活率呈正相关，肝癌细胞TLR3表达降低可促进其细胞存活和恶性转化^［14］。TLR3也参与乳腺癌的功能调控，TLR3激动剂处理可诱导乳腺癌细胞凋亡^［15］。且TLR3激动剂和靶向肿瘤细胞的化合物联合使用可通过激活肿瘤免疫微环境显著增强抗肿瘤药物的疗效^［16］。临床研究结果显示，三阴性乳腺癌组织中TLR3的表达显著低于正常组织，且TLR3高表达患者的临床预后更佳^［12］。SHAALAN A等^［17］研究结果显示，TLR3激活剂Poly（I：C）可通过半胱天冬酶依赖途径直接诱导肿瘤细胞凋亡。上述研究的结果表明，TLR3与乳腺癌的发生和发展密切相关，但其是否参与乳腺癌细胞化疗耐药的调控尚未明确。本研究结果显示，TNBC细胞对紫杉醇的耐药性与TLR3表达降低相关，上调TLR3的表达可显著逆转细胞株的耐药表型，本研究还聚焦于TLR3在乳腺癌细胞耐紫杉醇过程中的作用，而乳腺癌细胞表达的TLR3是否参与对其他化疗药物的耐药调控，是值得进一步探索的研究方向。

p21作为细胞周期调控蛋白，可通过结合细胞周期蛋白A（Cyclins A）/细胞周期蛋白依赖性激酶2（cyclin-dependent kinase 2，CDK2）、Cyclins E/CDK2、Cyclins D1/CDK4和Cyclins D2/CDK4等复合物，抑制视网膜母细胞瘤蛋白（retinoblastoma protein，pRB）磷酸化及E2启动子结合因子（E2 promoter binding factor，E2F）活化，从而阻断DNA复制并阻滞细胞周期进展^［18-19］。除调控细胞周期外，p21也参与细胞凋亡的调节。例如，在结直肠癌中，p21上调与其抗调亡能力增强有关，抑制p21表达可显著增强抗肿瘤药物的杀伤能力^［20］。在肺癌中，长链非编码RNA可通过调控p21表达影响细胞增殖和抗凋亡能力^［21］。在乳腺癌中，p21过表达可降低细胞对放疗的敏感性并抑制凋亡。由此可见，p21的抗凋亡作用与多种肿瘤细胞对化疗药物的耐药性密切相关。2016年一项关于前列腺癌的研究发现，癌细胞内的p38/p53/p21信号通路的激活可增强其对化疗药物的耐药性^［22］。在乳腺癌细胞中，由p21介导的抗凋亡也参与耐药性的形成^［23］。综上所述，由p21介导的抗凋亡是肿瘤耐药形成的重要机制之一。

本研究结果显示，由TLR3介导的乳腺癌细胞对紫杉醇的耐药性是通过上调p21表达实现的。然而，TLR3调控p21表达的具体分子机制尚未完全阐明。2019年的两项研究发现，表观遗传酶EZH2可在表观遗传水平调控p21的转录^［24-25］，推测TLR3可能通过由EZH2介导的表观遗传修饰调控p21的表达，其具体信号传递分子及调控网络值得深入研究。

综上所述，本研究发现耐紫杉醇的TNBC细胞中TLR3的表达显著降低，过表达TLR3可通过下调抗凋亡蛋白p21的表达，恢复细胞对紫杉醇的敏感性，抑制细胞增殖并促进细胞凋亡。本研究揭示了TNBC化疗耐药的新机制，为临床干预提供了潜在的治疗靶点。

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基金资助

国家自然科学基金项目(81803357)

黑龙江省省属高等学校基本科研业务费科研项目(2019-KYYWF-1226)