山楂荷叶饮改善高脂血症的潜在活性成分及作用靶点

Potential active ingredients and mechanism of Shanzha Heye Decoction in improving hyperlipidemia

摘要

目的 研究山楂荷叶饮对高脂血症大鼠的作用并探讨其降脂的潜在活性成分及作用靶点。 方法 建立高脂血症大鼠模型，从血脂水平、体质量、肝脏系数、脂肪质量以及肝脏病理形态变化等方面评价山楂荷叶饮的降脂效果；采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight mass spectrometry，UHPLC-Q-TOF-MS）对山楂荷叶饮中的化学成分进行鉴定，筛选山楂荷叶饮中活性成分与高脂血症的交集靶点，采用STRING数据库对蛋白相互作用网络进行构建与分析，利用Auto Dock Tools软件对活性成分与关键靶点进行分子对接验证。 结果 山楂荷叶饮能显著降低高脂血症大鼠总胆固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglycerides，TG）和低密度脂蛋白（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）水平，降低体质量及肝脏指数、附睾脂肪和肾周脂肪质量，改善肝脏组织病理形态、红色脂滴沉积情况。从山楂荷叶饮中共检测鉴定出88个化合物，其中生物碱类27个、黄酮类33个、有机酸类19个、其他类9个。网络药理学分析发现，山楂荷叶饮中金丝桃苷、荷叶碱、槲皮素、乌药碱等10个关键成分可能通过调控10个核心靶点发挥对高脂血症的调节作用。分子对接结果显示，关键成分与核心靶点蛋白结合活性良好。 结论 山楂荷叶饮可通过改善血脂水平、减少肝脏脂肪堆积等发挥对高脂血症的治疗作用，为山楂荷叶饮降血脂成分和机制的研究及产品的开发提供参考。

Abstract

Objective To investigate the effect of Shanzha Heye Decoction in improving hyperlipidemia， and its potential active ingredients and mechanism. Methods The model of hyperlipidemia rats was established to evaluate the lipid-lowering effect of Shanzha Heye Decoction from the aspects of lipid level， body weight， liver coefficient， fat weight and liver pathological morphological changes. The chemical components of Shanzha Heye Decoction were analyzed by ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight mass spectrometry （UHPLC-Q-TOF-MS）. The intersection targets of active components in Shanzha Heye Decoction were screened， and the protein-protein interaction network was constructed and analyzed using STRING database. Finally， the molecular docking between the active ingredients and the target was verified by Auto Dock Tools. Results Shanzha Heye Decoction can significantly reduce the levels of total cholesterol （TC）， triglycerides （TG） and low-density lipoprotein cholesterol （LDL-C） in hyperlipidemia rats， reduce body weight， liver index， epididymal fat and perirenal fat weight， improve liver histopathologic morphology and red lipid droplet deposition. 88 chemical components were identified in Shanzha Heye Decoction， including 27 alkaloids， 33 flavonoids， 19 organic acids and 9 other categories. Through network pharmacological analysis， it was found that 10 key components such as hypericin and lotine in Shanzha Heye Decoction may play a role in improving hyperlipidemia by regulating 10 key targets. The results of molecular docking showed that the key components had good binding activity with the core target proteins. Conclusion Shanzha Heye Decoction can improve blood lipid level and reduce liver fat accumulation in hyperlipidemia rats. Its potential active ingredients are hypericin， lotus leaf， etc. The mechanism of action may be related to AMPK， PPAR and other signaling pathways.

Graphical abstract

关键词

山楂荷叶饮 / 高脂血症 / 超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱 / 网络药理学 / 分子对接

Key words

Shanzha Heye Decoction / hyperlipidemia / ultra-high performance liquid chromatography- quadrupole-time of flight mass spectrometry / network pharmacology / molecular docking

随着人们生活水平的提高，脂质代谢异常成为影响健康的重要因素，主要表现为血液中总胆固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglycerides，TG）和低密度脂蛋白（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）含量升高，高密度脂蛋白（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）含量降低。基于中医药理论、药食同源思想和配伍原则，以药食同源的食物或中药为原料的中药降脂保健食品已广泛用于改善脂质代谢异常^［1］。通过挖掘保健食品^［2-4］及相关中成药^［5-7］的用药规律，筛选得到的山楂-荷叶药对可用于辅助降血脂，其中荷叶具有清暑化湿、调脂的功效，山楂具有行气散瘀、化浊调脂的功效，两者均归肝、脾、胃经，配伍使用具有协同增效的作用，通过益气健脾、降浊化痰、散瘀通络发挥改善血脂的作用^［8］。临床药理研究发现，山楂可通过干预不同代谢途径，改善脂质代谢^［9］。有研究发现，通过灌胃山楂汁可显著降低高脂血症小鼠血清中TG和TC的水平，表明山楂汁可以有效预防高脂血症等相关疾病的发生^［10］。荷叶可抑制体内TG的积累，并将TG降解为游离脂肪酸和甘油，刺激脂肪分解，从而减少脂肪积累^［11］。由山楂、荷叶两味药材配伍组成的山楂荷叶饮具有活血化瘀、消导通滞的功效^［12］，山楂中主要含有黄酮类、三萜类、有机酸类、木脂素类、甾体及鞣质类等成分^［13-14］，荷叶的主要活性成分为黄酮类化合物、生物碱、挥发油、萜类、多糖、有机酸等^［15］。

中药复方的成分及作用机制复杂，借助液相色谱-质谱分析及网络药理学可以筛选发挥作用的活性成分、靶点和通路^［16］。本研究通过建立大鼠高脂血症模型验证山楂荷叶饮的降脂功效，并运用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight mass spectrometry，UHPLC-Q-TOF-MS）鉴定山楂荷叶饮的化学成分，借助网络药理学及分子对接方法探究山楂荷叶饮改善高脂血症的潜在活性成分及作用机制，为山楂荷叶饮产品的开发提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent 1290型超高效液相色谱仪-6550型串联四极杆-飞行时间质谱联用仪（美国Agilent公司）；AT201型电子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；3-18KS型离心机（美国Sigma公司）；KQ-300DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Milli-Q型超纯水系统（美国Millipore公司）；HW.SY11-KP2型恒温水浴锅（北京市长风仪器仪表公司）。

1.2 试药

对照品：金丝桃苷（批号J-012-180918）、异槲皮苷（批号RFS-Y07601904023）、紫云英苷（批号RFS-Z02001908027）、荷叶碱（批号H-042-180222）、N-去甲基荷叶碱（批号P-008-180917）、O-去甲基荷叶碱（批号RFS-Q12202105025），质量分数均>95%，均购自成都瑞芬思生物科技有限公司；辛伐他汀片（批号20230214，山东鑫齐药业有限公司）；乙腈（质谱级）、甲酸（质谱级），均购自美国Thermo Fisher Scientific公司；超纯水用Milli-Q纯水仪制得（美国Millipore公司）。

山楂（批号290352637319，山西湅淇源农业开发有限公司），经北京中医药大学中药学院王学勇教授鉴定为蔷薇科山楂属植物山楂Crataegus pinnatifida Bunge的成熟果实。荷叶（批号2306023，北京双桥饮片厂），经北京中医药大学中药学院王学勇教授鉴定为睡莲科莲属植物莲Nelumbo nucifera Gaertn.的干燥叶。

1.3 动物

清洁级雄性SD大鼠，体质量为（200±5） g，6周龄，购自维通利华（北京）实验动物技术有限公司，合格证号SYXK（京）2023-0011。按照饲养和使用指南进行操作，并经北京中医药大学实验动物伦理委员会审核、批准。实验期间动物昼夜节律正常，并保证其自由进食和饮水。高脂饲料（批号TP0800）、对照饲料（批号LAD0011），均购于南通特洛菲饲料科技公司。

1.4 数据库与软件

中药系统药理学数据库和分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP，https：//tcmspw.com/ index.php），PubChem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、SwissTargetPrediction数据库（http：//www. swisstargetprediction.ch/）、人类孟德尔遗传数据库（online Mendelian inheritance in man，OMIM，http：//www.omim.org/）、GeneCards 数据库（https：//www. genecards.org/）、Drug-Bank数据库（https：//www.drugbank.com/）、治疗靶点数据库（therapeutic target database，TTD，http：//bidd.group/index.html/）、STRING数据库（https：//cn.string-db.org/）、DAVID 6.8数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）、蛋白结构数据库（protein data bank，PDB，http：//www.rcsb.org/）、Cytoscape 3.9.1软件；AutoDock Tools1.5.6 软件、ChemDraw Professional 15.1软件。

2 方法

2.1 山楂荷叶饮对高脂血症大鼠药效的评价

2.1.1 动物分组与给药

48只雄性大鼠，适应性饲养1周后，随机分为对照组与高脂饲料组，其中对照组12只，高脂饲料组36只。造模期间，对照组采用普通饲料喂养，高脂饲料组采用高脂饲料喂养，喂养2周后，眼眶采血，分离血清，测定血清TC、TG、LDL-C、HDL-C的水平，确定造模是否成功^［17-18］。造模成功后，将高脂饲料组大鼠按照随机数字表法分为模型组、辛伐他汀组、山楂荷叶饮给药组。按照体表面积公式换算，山楂荷叶饮组灌胃5.5 g·kg^-1山楂荷叶饮，辛伐他汀组灌胃4.2 mg·kg^-1辛伐他汀，对照组及模型组给予蒸馏水灌胃，连续给药4周。

2.1.2 大鼠血清血脂指标水平的测定

末次给药结束后，麻醉大鼠，腹主动脉取血，以3 500 r·min^-1离心15 min，取血清，采用全自动生化分析仪检测大鼠血清中TC、TG、LDL-C和HDL-C的水平。

2.1.3 大鼠体质量、肝脏、附睾脂肪及肾周脂肪质量的测定

末次给药结束后，称定大鼠体质量，麻醉大鼠，腹主动脉取血后，取各组大鼠的肝脏、肾周脂肪、附睾脂肪，称定质量，观察各组肝脏系数、脂肪质量的变化。

2.1.4 肝脏和脂肪组织形态的观察

取各组大鼠肝脏组织，用体积分数4%多聚甲醛固定液保存，进行苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色和油红O染色，置于显微镜下观察并采集图像。肾周脂肪、附睾脂肪称定质量后，附睾脂肪于体积分数4%多聚甲醛固定液中保存，进行HE染色，置于显微镜下观察脂肪形态变化并采集图像。

2.2 山楂荷叶饮化学成分的分析

2.2.1 样品制备

山楂汁的制备：选取成熟、饱满、新鲜的山楂果实，洗净，加入4倍量的水，95 ℃热水软化5 min。匀浆机高速趁热打浆10 min，50 ℃保温浸提2 h。纱布过滤，除去残渣，得新鲜山楂汁^［19］。

荷叶提取液的制备：选择优质干荷叶，粉碎，过80目筛，称取适量粉末，置于三角烧瓶中，加入30倍量的水，加热至90 ℃，恒温浸提1 h，过滤，即得荷叶提取液^［20］。

山楂荷叶饮溶液的制备：将山楂汁与荷叶提取液按7.5∶2的比例混合，得到山楂荷叶饮溶液。取溶液2 mL，经0.22 μm滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.2.2 混合对照品溶液的制备

取金丝桃苷、异槲皮苷、紫云英苷、荷叶碱、N-去甲基荷叶碱、O-去甲基荷叶碱对照品适量，称定质量，分别置于10 mL量瓶中，加体积分数60%甲醇定容至刻度线，得对照品储备液。分别吸取各对照品储备液适量，置于10 mL量瓶中，加体积分数60%甲醇溶液定容至刻度线，得质量浓度为30 μg·mL^-1的混合对照品溶液。

2.2.3 色谱与质谱条件

色谱条件：采用ZORBAX Eclipse Plus RRAD色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；以含体积分数0.1%甲酸的乙腈（A）-体积分数0.1%甲酸溶液（B）为流动相，梯度洗脱：0~3 min，95% B→90% B；3~16 min，90% B→60% B；16~20 min，60% B→10% B；20~25 min，10% B；流速为0.3 mL·min^-1；进样量为2 μL。

质谱条件：采用正负离子模式分别扫描，干燥气温度为150 ℃，干燥气流速为11 L·min^-1，喷雾气压力为35 psi；鞘气温度为250 ℃，鞘气流速为12 L·min^-1；喷嘴电压为1 000 V；毛细管电压为4 000 V（ESI⁺）/3 500 V（ESI^-）；MS扫描范围m/z 100~1 000；MS/MS扫描范围m/z 50~800，二级碰撞能量为10、20、40 V。

2.2.4 山楂荷叶饮化学成分的鉴定

化合物库的构建：基于中国知网（China national knowledge infrastructure，CNKI）数据库及相关文献查询山楂、荷叶单味药的化学成分，去除重复项后，构建化合物数据库。该化合物数据库中共包括139个山楂中的化学成分和187个荷叶中的化学成分的结构、化学式、精确相对分子质量等相关信息。

成分的识别：与自建的山楂、荷叶化合物库中各化合物的精确相对分子质量匹配，设置筛选标准（mass error<5 ppm），初步识别化合物。

化合物的鉴定：将识别出的化合物进行二级质谱碎片结构信息的解析，结合文献报道，推导结构并确定待核查化合物的名称和结构。对于同分异构体，根据保留时间和二级质谱碎片差异并结合相关文献进行判断和推测。

2.3 网络药理学分析

2.3.1 山楂荷叶饮活性成分的筛选及成分靶点与疾病靶点的预测

借助于TCMSP数据库，查找从山楂荷叶饮溶液中鉴定出的88个化合物的口服生物利用度（oral bioavailability，OB）和类药性（drug likeness，DL），将OB≥30%和DL≥0.18的成分作为潜在活性成分；对于OB<30%或DL<0.18的成分，若已有相关文献报道其可吸收入血或降脂药理活性确切，则也纳入山楂荷叶饮的潜在活性成分中，如紫云英苷（OB=14.03，DL=0.74），有文献证明其可促进胆固醇外排，改善脂质代谢^［21］，因此将其纳入潜在活性成分。将活性成分SMILES结构输入Swiss Target Prediction数据库预测成分靶点，合并去重后得到山楂荷叶饮活性成分靶点集。通过TTD数据库、OMIM数据库、Drug-Bank数据库、GeneCards数据库、PharmGkb数据库检索“hyperlipidemia”关键词，获取高脂血症相关疾病靶点，合并去掉重复项后得到疾病靶点。

2.3.2 蛋白质相互作用（protein protein interaction，PPI）网络的构建及关键基因的筛选

使用Venny 2.1软件，取山楂荷叶饮潜在活性成分预测靶点与高脂血症预测靶点的交集，获得山楂荷叶饮改善高脂血症的相关作用靶点及共有靶点。导入筛选好的山楂荷叶饮活性成分靶点以及高脂血症靶点，借助Cytoscape3.9.1软件中的Merge功能，构建“药物-活性成分-靶点”网络拓扑图。将交集靶点导入String数据库，评分条件设定为置信度>0.7，获得靶点间相互作用关系并导入Cytoscape 3.9.1软件，构建PPI网络，运用Cytoscape软件中的CytoNCA插件计算节点BC、CC、DC、EC、LAC、NC数值。每次筛选均选择每项数值大于中位值的节点，最终确定PPI网络中的核心靶点。

2.3.3 通路富集分析

将核心靶点导入DAVID 6.8数据库进行基因本体（gene ontology，GO）生物过程富集分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析，运用微生信平台实现数据的可视化。

2.4 分子对接

采用AutoDock Tools 1.5.6软件对degree值居前10位的核心靶点和核心成分进行分子对接验证。将筛选出的活性成分与核心靶点依次进行分子对接。运用PubChem数据库查找并下载活性成分的3D结构文件，采用Open Babel GUI软件将3D结构文件转化，在PDB数据库下载核心靶点蛋白的晶体3D结构文件，进一步使用Autodock Tools 1.5.6进行加氢、除水、去除蛋白自身携带小分子的操作，导出用于分子对接的核心靶点蛋白。将核心靶点相关的晶体结构及核心成分的3D结构导入AutoDock Tools 1.5.6软件，运用Autodock vina进行分子对接，获得对接结合能（binding energy）、氢键（hydrogen bond）信息，在微生信平台（http：//www.bioinformatics.com.cn/）网站进行核心成分与核心靶点间结合能的热图绘制，使用PyMOL 2.5.4软件制作活性成分与核心靶点的结合模式图，将分子对接结果可视化。

2.5 统计学方法

用SPSS 19.0软件对数据进行处理。计量资料用（\overline{x}±s）表示，检验多样本计量资料用多因素方差分析，分析两两样本用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 山楂荷叶饮对高脂血症的改善作用

3.1.1 高脂血症模型大鼠的建立

造模2周后，高脂饲料组血清TC、TG、LDL-C水平均显著高于对照组（P<0.01），表明高脂血症模型造模成功。见表1。

3.1.2 山楂荷叶饮对血脂水平的影响

与对照组比较，模型组的血清TC、TG、LDL-C水平显著升高（P<0.01）；与模型组比较，辛伐他汀组和山楂荷叶饮组的血清TC、TG、LDL-C水平均显著降低（P<0.01），且山楂荷叶饮组的血清TC、LDL-C水平均显著低于辛伐他汀组（P<0.05）。见图1。

3.1.3 山楂荷叶饮对体质量、肝脏指数及肾周脂肪、附睾脂肪质量的影响

与对照组比较，模型组的体质量显著增加（P<0.01）；与模型组比较，辛伐他汀组和山楂荷叶饮组的体质量显著降低（P<0.01）。与对照组比较，模型组的体质量显著提高（P<0.01）；与模型组比较，山楂荷叶饮组和辛伐他汀组血脂异常大鼠体质量显著降低（P<0.01）。与对照组比较，模型组的附睾脂肪质量、肾周脂肪质量和肝脏指数均显著增加（P<0.01）；与模型组比较，山楂荷叶饮组的附睾脂肪质量、肾周脂肪质量和肝脏指数显著降低（P<0.05）。见图2和表2。

3.1.4 肝脏形态学的分析

对照组肝脏组织被膜由均匀、富含弹性纤维的致密结缔组织构成，肝小叶结构清晰，肝细胞圆润、饱满，肝板排列规则、整齐，肝窦无明显扩张或挤压，未见炎性改变。与对照组比较，模型组肝脏组织被膜未见明显异常，肝小叶结构不清，肝细胞索排列紊乱，肝窦狭窄，大量的肝细胞脂肪变性，胞质中可见大小不一的圆形空泡；较多血管周围纤维组织增生，伴有散在的炎性细胞浸润；红色脂滴增多。与模型组比较，山楂荷叶饮组肝细胞微泡性脂肪变性减少，胞质中的微小圆形空泡减少，炎性细胞浸润减少；红色脂滴减少。各组附睾脂肪组织细胞形态完好，对照组脂肪细胞大小均一，排列紧密；与对照组比较，模型组脂肪细胞明显变大；与模型组比较，山楂荷叶饮组和辛伐他汀组脂肪细胞明显减小。见图3。

3.2 山楂荷叶饮化学成分的分析

采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术，分别在正、负离子模式下对山楂荷叶饮溶液中的化学成分进行表征，其总离子流图（total ion chromatogram，TIC）见图4。基于自建的山楂、荷叶化合物数据库（山楂中139个化合物、荷叶中187个化合物），初步筛查，从山楂荷叶饮溶液中共识别出88个化合物，并进一步利用二级质谱信息（如碎片离子峰、关键产物离子及碎片裂解规律等）鉴定化合物的名称及结构。共从山楂荷叶饮溶液中鉴定得到88个化合物，其中包括生物碱类27个、黄酮类33个、有机酸类19个、其他类9个。其中60个化合物在正离子模式下鉴定得到，28个化合物在负离子模式下鉴定得到。将鉴定的化合物按保留时间先后顺序排列，详细信息见表3。

3.3 山楂荷叶饮网络药理学分析

基于山楂荷叶饮成分鉴定结果，根据成分的口服生物利用度、类药性、是否吸收入血、是否具有降脂药效筛选潜在活性成分。通过数据库筛选及整理预测活性成分相关靶点与高脂血症疾病靶点，将两者取交集得到共有靶点。建立“成分-靶点”拓扑网络，并根据活性成分与靶点之间的相关度及重要性，以degree值为指标，筛选得到山楂荷叶饮改善高脂血症的关键成分及作用的核心靶点。通过对核心靶点进行富集分析预测山楂荷叶饮改善高脂血症的关键通路及作用机制。

3.3.1 山楂荷叶饮活性成分及疾病靶点

针对从山楂荷叶饮中鉴定的88个化合物，根据化合物的OB≥30%和DL≥0.18筛选出12个潜在活性成分，根据化合物是否吸收入血、是否具有降脂活性，筛选出24个潜在活性成分，合并相同化合物，共筛选到26个潜在活性成分。活性成分经SwissTargetPrediction 数据库预测得到401个潜在的作用靶点。从Drug Bank、GeneCards、TTD、OMIM、DisGeNET数据库合并去重后筛选得到高脂血症相关靶点1 336个，将山楂荷叶饮活性成分靶点与高脂血症的相关靶点取交集并绘制韦恩图，得到65个共有潜在靶点。

3.3.2 PPI 网络的构建及核心靶点的筛选

构建65个交集靶点的PPI网络，使用Cytoscape软件中的CytoNCA插件计算得到的大于中位值的节点数值（即DC>11.26，EC>0.1，LAC>4.78，BC>64.28，CC>0.50，NC>7.05），最终确定PPI网络中的12个核心靶点。进一步查阅文献验证各靶点与脂质代谢的相关性，舍去与脂质代谢无关的单氨氧化酶、多药耐药性蛋白2个靶点，最终确定山楂荷叶饮改善高脂血症的10个核心靶点。见图5。

3.3.3 山楂荷叶饮“活性成分-共有靶点”网络的构建及关键成分的确定

借助Cytoscape3.9.1软件中的Merge功能，构建山楂荷叶饮的“26个活性成分-65个共有靶点”网络拓扑图，见图6。运用Cytoscape软件中的CytoNCA插件计算节点degree数值，根据成分在网络中与靶点的相关性，取degree数值排名前10的成分作为关键活性成分，构建10个关键成分与相关靶点的网络拓扑图，见图7。

3.3.4 功能注释及通路富集分析

将10个关键核心靶点导入DAVID 6.8数据库进行GO富集分析和KEGG通路富集分析。GO富集分析根据FDR≤0.05筛选得到80个GO条目，包括生物学过程（bioprogress，BP）条目52个，如胆固醇储存负调节等；细胞组分（cell components，CC）条目8个，如细胞外空间等；分子功能（molicular function，MF）条目20个，如RNA聚合酶Ⅱ转录因子活性等。取各项前10条条目导入微生信平台进行可视化展示。KEGG通路富集分析根据FDR≤0.05筛选得到11条通路，主要包括脂肪细胞中脂肪分解的调节、胰岛素抵抗、肿瘤坏死因子信号通路、内分泌抵抗、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路等，取前20条信号通路进行可视化分析。见图8。

3.4 分子对接验证

筛选除去无高分辨率蛋白的核心靶点（TNF、APP），将筛选出的10个关键活性成分与剩余8个核心靶点依次进行分子对接，结合能≤-5.0 kJ·mol^-1表明两者之间结合活性良好，成分与靶点之间的相互作用强。山楂荷叶饮的核心成分与高脂血症的核心靶点的结合能热图见图10。由图10可见，PPARD、MMP9、EGFR、CCL2与各成分均具有良好的结合活性，其中N-去甲基荷叶碱可与PPARD、MMP9、PPARA、ESR1、EGFR结合，与PPARD结合能最低为-9.5 kJ·mol^-1，作用位点是苏氨酸280；木犀草素可与MMP9、PPARD、HMGCR、EGFR结合，与MMP9结合能为-9.9 kJ·mol^-1，作用位点是蛋氨酸247、丙氨酸189；香木叶素可与MMP9、CCL2、EGFR结合，与MMP9结合能最低为-10.2 kJ·mol^-1，作用位点是蛋氨酸247、丙氨酸189、酪氨酸245；乌药碱可与PPARA、MMP9、PPARD结合，与PPARA结合能最低为-8.2 kJ·mol^-1，作用位点是酪氨酸334、蛋氨酸220。分子对接模式见图10。

4 讨论

本研究通过动物实验明确山楂荷叶饮具有较好的降血脂作用，同时借助UHPLC-Q-TOF-MS方法鉴定得到山楂荷叶饮中的主要化学成分为黄酮类、生物碱类、有机酸类化合物，在此基础上，结合网络药理学和分子对接技术预测山楂荷叶饮可能通过作用于TNF、ESR1、EGFR、MMP9、PPARA、CCL2、HMGCR、PPARD、APP、NR3C1等靶点，调节PPAR、AMPK及脂肪细胞中脂肪分解的调节等通路发挥降脂作用，其活性成分主要为槲皮素、荷叶碱、山柰酚、乌药碱、N-去甲基荷叶碱、O-去甲基荷叶碱、香木叶素、亚美罂粟碱、桑色素、木犀草素等，为阐明山楂荷叶饮的降脂药效物质基础及进一步临床应用和机制研究提供实验依据。

研究结果显示，山楂荷叶饮对于高脂血症大鼠血清中TC、LDL-C水平的改善效果显著优于辛伐他汀。一方面是因为山楂荷叶饮中的槲皮素等黄酮类成分和荷叶碱等生物碱类成分不仅可以作用于HMGCR靶点，抑制胆固醇的合成，还可以作用于PPAR、AMPK等脂质代谢、能量代谢通路，广泛调节机体内脂质代谢过程，对高脂血症起到多方面、多角度的治疗作用^［32-33］。而他汀类药物本质是HMGCR的竞争性抑制剂，通过诱导肝脏中LDL受体的表达，提高血浆中LDL的分解代谢，从而起到降低血浆中胆固醇浓度的作用，达到改善高脂血症的治疗效果^［34］。另一方面，他汀类药物在临床用药过程中还经常出现横纹肌溶解、肝毒性等不良反应^［35］，影响其疗效。此外，不同于传统中药汤剂以炮制饮片为原料，本研究采用山楂鲜果为原料，其含有丰富的山楂果胶^［36］，山楂果胶可抑制饮食中胆固醇的吸收并促进其排泄^［37］，而果胶是一种天然杂多糖，易受到加工方法（如自然风干、冻干等）的影响，引起结构和功能的改变^［38］，采用鲜果浸提可以最大程度保留鲜果中果胶及粗纤维等物质，增强其降脂效果，还可以增加产品果香味，提升口感，为高脂血症保健食品的开发奠定基础。

本研究通过网络药理学共筛出10个山楂荷叶饮改善血脂水平作用的关键核心靶点，包括HMGCR、PPARα、PPARD等，通过网络分析发现，山楂荷叶饮降脂的主要信号通路有AMPK、PPAR信号通路及脂肪细胞中脂肪分解的调节以及胰岛素抵抗等。相关研究发现，HMGCR是胆固醇生物合成过程中的限速酶^［39］，抑制其活性可降低胆固醇合成速率。PPARα是多种脂肪酸氧化系统相关基因的关键调节因子，在脂质代谢、细胞炎症等过程中发挥重要作用^［39］。AMPK通路是一种重要的能量传递通路，其激活会引起一系列的代谢途径的启动和抑制，包括葡萄糖代谢、脂肪酸合成、脂肪酸氧化、胆固醇合成等^［40］。由此推论，山楂荷叶饮可能通过抑制胆固醇合成限速酶HMGCR基因的表达，抑制胆固醇的合成，同时通过调控AMPK及PPAR通路相关基因促进脂质分解代谢，从而改善血脂水平。已有研究发现，山楂给药可以抑制脂肪酸合成酶和HMGCR基因的表达，从而抑制肝脏胆固醇和脂肪酸的合成，降低肝脏中TC、TG的含量^［32］，还会使与脂肪酸氧化相关的调控基因PPARα表达升高^［41］；荷叶水提取物可通过改善大鼠脂肪组织PPAR-γ和瘦素的表达，促进脂肪的动员和分解，改善肥胖大鼠的血脂水平^［42］。同时，荷叶碱能调节HepG2细胞的Adiponectin表达，上调AMPK和PPARα的表达，下调SREBP-1c和ACC的表达，发挥调节脂质代谢的作用^［43］。

本研究通过筛选得到了山楂荷叶饮治疗高脂血症的10个关键活性成分如荷叶碱、N-去甲基荷叶碱、槲皮素等，且分子对接结果显示关键成分与靶点之间的结合活性良好，相互作用强，表明山楂荷叶饮中的活性成分可能直接作用于已知的高脂血症靶点，同时MMP9、PPARD、EGFR靶点与相关活性成分的结合作用强，可成为山楂荷叶饮降脂作用潜在靶点。据相关文献报道，荷叶碱可以通过抑制脂质合成蛋白SCAP、SREBP-1c、SREBP2等和促进脂质分解蛋白CPT-1a、CD36、ACC、ATGL等对高脂小鼠肝脏脂质蓄积起抑制作用^［33］。N-去甲基荷叶碱对前脂肪细胞具有增殖抑制和分化抑制作用，且可以显著诱导前脂肪细胞凋亡^［43］。槲皮素可逆转由油酸诱导的Hep G2细胞脂肪肝状态中TG的增加，脂质过氧化增加以及炎性细胞因子TNF-α和IL-8水平的显著升高^［44］。以上研究结果可与本研究筛选得到的降脂关键活性成分结果相印证，由此推测荷叶碱、N-去甲基荷叶碱、槲皮素等生物碱类及黄酮类成分为山楂荷叶饮降脂关键活性成分。

综上所述，本研究在对山楂荷叶饮降脂药效确认和化学成分表征的基础上，发现其改善高脂血症作用的主要活性成分可能为槲皮素、山柰酚、香木叶素、桑色素、木犀草素等黄酮类和荷叶碱、乌药碱、N-去甲基荷叶碱、O-去甲基荷叶碱、亚美罂粟碱等生物碱类成分，这些活性成分作用于MMP9、PPARD、EGFR等核心靶点，通过调控AMPK、PPAR信号通路及脂肪细胞中脂肪分解以及胰岛素抵抗等信号通路，以延缓高脂血症的发生发展。

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基金资助

北京中医药大学-优莎纳联合研究中心（BURC）