榄香烯对缺氧缺糖诱导的BV2细胞炎症反应的影响

Effects of elemene on inflammation under hypoxic and hypoglycemic conditions in BV2 cells

摘要

目的 探讨榄香烯对缺氧缺糖诱导的BV2细胞炎症反应的机制。 方法 将BV2细胞随机分为对照组，模型组和榄香烯低、中、高剂量组。对照组正常培养。模型组糖氧剥夺（oxygn deprivation，OGD）2 h，再灌注24 h。榄香烯低、中、高剂量组分别以10、20、40 μg·mL^-1榄香烯孵育并OGD/再灌注持续孵育。用溴化噻唑蓝（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）法检测细胞的活性，以乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）法检测BV2细胞的损伤情况，以免疫荧光法观察NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）表达的变化，以酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的表达情况。 结果 与对照组比较，模型组BV2细胞活性、LDH释放情况均明显降低（P<0.05）；与模型组比较，榄香烯低、中、高剂量组细胞活性均显著增加，LDH释放显著减少（P<0.05）。与对照组比较，模型组BV2细胞NLRP3炎症小体，IL-1β和TNF-α的表达水平均增加（P<0.05），经过榄香烯低、中、高剂量干预能明显抑制上述各指标的水平表达（P<0.05）。 结论 榄香烯能改善OGD诱导的BV2细胞损伤，部分是通过抑制NLRP3/IL-1β/TNF-α炎症通路发挥作用的。

Abstract

Objective To investigate the mechanism of elemene-induced inflammatory response in BV2 cells under hypoxic and glucose-deprived conditions. Methods BV2 cells were randomly divided into a control group， a model group， and 3 elemene dose groups （low， medium， and high）. The control group was cultured under normal conditions； the model group underwent 2 hours of oxygen deprivation （OGD） followed by 24 hours of reperfusion； the elemene low， medium， and high dose groups were incubated with elemene at concentrations of 10， 20， and 40 μg·mL^-1， respectively， and continued to undergo OGD/reperfusion. The cell viability was assessed using the methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide （MTT） method， the damage to BV2 cells was evaluated using the lactate dehydrogenase （LDH） method， the expression changes of NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3 （NLRP3） were observed using immunofluorescence， and the expression levels of interleukin-1β （IL-1β） and tumor necrosis factor-α （TNF-α） were measured using the enzyme linked immunosorbent assay （ELISA）. Results Compared with the control group， the BV2 cell activity and LDH release in the model group were significantly lower （P<0.05）. Compared to the model group， the cell activity in the low， medium， and high doses of elemene showed a significant increase， while the LDH release decreased significantly （P<0.05）. Compared with the control group， the BV2 cells in the model group exhibited increased expression of NLRP3 inflammasome， IL-1β， and TNF-α （P<0.05）. However， elemene at low， medium， and high doses significantly inhibited these increases （P<0.05）. Conclusion Elemene can improve OGD-induced BV2 cell damage， partly by inhibiting the NLRP3/IL-1β/TNF-α inflammatory pathway.

Graphical abstract

关键词

榄香烯 / 糖氧剥夺 / BV2细胞 / NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3 / 炎症因子

Key words

elemene / oxygen-glucose deprivation / BV2 cells / NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3（NLRP3） / inflammatory factors

脑缺血早期触发的炎症反应是加剧脑缺血病理损伤的关键因素，其中白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等细胞因子是炎症反应的重要介质^［1］，因此，抑制脑缺血后的炎症反应是防治缺血再灌注损伤的重要干预靶点。榄香烯乳注射液的主要成分提取自温郁金，因其广谱抗癌特性，在多种恶性肿瘤的临床治疗中应用广泛^［2］。既往研究发现，榄香烯可改善大鼠脑缺血再灌注慢性损伤，其作用机制可能与抑制皮层过度自噬和凋亡密切相关^［3］。另有研究发现，榄香烯可通过减轻皮层神经元凋亡和炎症水平而减轻小鼠全脑缺血再灌注损伤^［4］，但其抗凋亡和抗炎效应所涉及的信号通路机制仍未完全明确，亟待深入探究。小胶质细胞作为中枢神经系统的主要免疫防线，在脑缺血损伤修复过程中发挥关键作用^［5］。BV2细胞源自小鼠神经胶质细胞系，完整保留了小胶质细胞的生物学功能。本研究通过构建体外缺氧缺糖（oxygn deprivation，OGD）模型，研究榄香烯对小鼠小胶质瘤细胞株BV2活性的影响，并初步探讨相关炎症调控机制，以期为缺血性卒中的治疗提供新思路。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Forma Series Ⅱ Water Jacketed 3111型CO₂恒温培养箱（美国Thermo Scientific公司）；JC-1200MB型酶标仪（青岛精诚仪器仪表有限公司）；BX43型荧光显微镜［门季（上海）生物科技有限公司］

1.2 试药

榄香烯乳注射液（规格为0.1 g∶20 mL，批号H10960115），购自大连金港制药有限公司；Dulbecco改良培养基（Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM，批号SH30028.01B，苏州千舍生物科技有限公司）；磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS，批号BS9812，北京天润善达生物公司）；体积分数0.25%胰酶（批号25200058，美国Gibco公司）；溴化噻唑蓝（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）试剂盒（批号ab211091，美国Abcam公司）；乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）试剂盒（批号ml098829，上海酶联生物科技有限公司）；兔抗NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）抗体（批号A24294，武汉爱博泰克公司）；Hoechst33258［批号CC1120，百克赛斯生物科技（镇江）有限公司］；白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）酶联免疫吸附实验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（批号EKF57763）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA试剂盒（批号BGT-KET-13762），均购自加拿大Anogen公司；96孔细胞培养板（批号3688，美国Coring公司）。

1.3 细胞株

小鼠小胶质瘤细胞株BV2，购自中国科学院上海生科院细胞资源中心。

2 方法

2.1 细胞培养、OGD模型的建立和分组

BV2细胞的培养采用含有10%的灭活胎牛血清的高糖DMEM培养基，置于37 ℃，体积分数5%CO₂，相对湿度95%的环境中进行培养，隔日更换培养液。当单层细胞融合度为80%时，使用体积分数0.25%胰酶消化传代。取处于对数生长期的细胞接种于96培养板中，将BV2细胞分为对照组，模型组，榄香烯低、中、高剂量组（分别用10、20、40 μg·mL^-1榄香烯孵育），每组设置6个复孔。根据相关参考文献^［6］，模型组及各剂量处理组均使用无糖Earle’s平衡盐溶液对细胞冲洗3次，每孔加入100 μL Earle’s溶液后，置于37 ℃恒温培养箱内的密封缺氧系统中。随后迅速充入N₂与CO₂的混合气体，持续 5 min以置换空气，之后调低气体流速并开始计时，进行1 h的OGD处理。处理结束后，小心吸除无糖缓冲液，补加完全培养基，并继续在37 ℃培养箱中培养 24 h。对照组则采用含糖DMEM培养基冲洗细胞3次，并在无缺氧条件下孵育，其余操作均与模型组相同。

2.2 MTT法检测BV2细胞的活性

将处于对数生长期的BV2细胞消化，用完全培养基调节细胞密度至3×10⁵·mL^-1，接种于96孔细胞培养板内，每孔100 μL，于细胞培养箱内培养24 h，随后24 h进行OGD或复灌处理，加入含有MTT的DMEM，在细胞培养箱中孵育3 h，使用酶标仪测定在590 nm处的吸光度（A）值，计算细胞活性。细胞活性（%）=（模型组A值或实验组A值/对照组平均A值）×100%。MTT检测不同质量浓度榄香烯乳注射液对BV2细胞的影响，并选取榄香烯孵育最佳质量浓度进行后续实验。

2.3 LDH法检测BV2细胞的损伤

各组BV2细胞孵育24 h，收集细胞上清液，根据LDH含量检测试剂盒说明书进行操作，测定490 nm处的A值。

2.4 免疫荧光法检测NLRP3蛋白的表达

将经多聚赖氨酸包被的盖玻片置于24孔细胞培养板，接种各组BV2细胞，待细胞贴壁后吸弃培养液，PBS缓冲液清洗2次，体积分数4%多聚甲醛固定30 min， PBS再次清洗2次。玻片用体积分数5%的BSA溶液在室温条件下封闭1 h后，加入NLRP3抗体（1∶500），4 ℃避光孵育过夜；次日用PBS清洗2次，加入荧光二抗（1∶500），室温避光孵育2 h， PBS清洗后，用含Hoechst33258的甘油封片，置于荧光显微镜下采集图像。

2.5 ELISA法检测IL-1β和TNF-α的水平

各组BV2细胞以1 000 g离心5 min，收集上清液，将样本置于-80 ℃的冰箱中保存，按照ELISA试剂盒说明书操作，检测IL-1β和TNF-α的水平。

2.6 统计学方法

所有统计分析均使用GraphPad Prism 9软件。使用Shapiro-Wilk检验评估数据是否符合正态分布，对于满足正态分布的计量资料用（\overline{x}±s）表示，组间比较使用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组BV2细胞活性和LDH释放量的比较

与对照组比较，模型组细胞活性显著降低和LDH释放显著增加（P<0.05）；与模型组比较，随着榄香烯质量浓度升高（10、20、40 μg·mL^-1），细胞活性显著提高（P<0.05），分别提高了7.1%，18.4%和20.7%；LDH释放量随着榄香烯质量浓度升高显著降低（P<0.05），分别下降了19.1%、37.4%、44.7%。后续实验选择20 μg·mL^-1榄香烯作为改善OGD诱导BV2细胞损伤的质量浓度。

3.2 各组BV2细胞NLRP3免疫荧光强度的比较

与对照组比较，模型组NLRP3荧光显著增强；与模型组比较，榄香烯中剂量组NLRP3荧光显著减弱。表明OGD诱导BV2细胞NLRP3表达增加，榄香烯可以抑制NLRP3的表达。见图2。

3.3 各组BV2细胞IL-1β和TNF-α表达情况的比较

与对照组比较，模型组细胞上清IL-1β和TNF-α表达均显著高于对照组（P<0.05）；与模型组比较，榄香烯中剂量组细胞的IL-1β和TNF-α水平均显著降低。上述研究结果表明，榄香烯能抑制OGD诱导的BV2细胞炎症，与IL-1β和TNF-α通路相关。

4 讨论

脑缺血再灌注损伤的病理机制复杂，涉及氧化应激、炎症反应等多种因素，其中缺血损伤区的炎症反应可诱发并参与其病理生理过程，诱导脑组织神经细胞损伤^［7］。药物若能有效抑制炎症反应、减少炎症因子释放，则可对脑缺血性损伤起到抑制作用。榄香烯能通过血脑屏障进入中枢神经系统，因此具有治疗中枢神经系统疾病的潜力^［8］。中医认为其具有行气破血、消积止痛的功效，作用机制呈现多靶点、多环节、多效应的特点^［9］。动物实验结果显示，榄香烯可减轻皮层神经元凋亡和炎症水平，对缺血性损伤有一定抑制作用^［4］；体外实验表明，榄香烯（10~40 mg·mL^-1）能有效改善由OGD诱导的BV2细胞活性，减少LDH释放。表明榄香烯除有抗癌作用外兼具神经保护作用^［10］。

小胶质细胞由卵黄囊造血祖细胞发育而来，在大脑发育中诱导神经前体死亡、吞噬及修剪突触调节神经功能^［11］。BV2细胞因可被脂多糖和干扰素γ等多种刺激物诱导为反应性炎症表型，故本实验选取其作为研究对象^［12］。

NOD样受体是中枢神经系统性疾病机制研究中的热门模式识别受体，其中NLRP3在炎症因子成熟和释放中起关键作用，参与介导IL-1β的产生^［13］。相关研究发现，脑缺血后NLRP3炎症体在小胶质细胞中的表达显著增加，并参与脑缺血神经损伤过程^［14］，抑制其表达是治疗脑缺血性损伤的重要靶点。本实验结果显示，榄香烯能显著减少由OGD诱导的BV2细胞NLRP3荧光表达，表明其改善BV2细胞活性与抑制NLRP3炎症体相关。

细胞因子作为低相对分子质量的糖蛋白，是免疫反应和炎症反应的基本介质。脑缺血损伤后早期即有IL-1β和TNF-α等炎症因子表达，且其水平与疾病严重程度呈正相关^［15-16］。体外研究发现，小胶质细胞可产生细胞因子，脑缺血时其表达量显著增加^［17-18］，而榄香烯具有抑制TNF-α的作用^［4］。本研究也证实榄香烯可显著抑制由OGD诱导的BV2细胞中IL-1β和TNF-α的表达，表明抑制炎症因子表达可能是榄香烯改善由OGD诱导的细胞损伤的另一重要机制。

综上所述，榄香烯可减轻OGD对BV2细胞的损伤，该保护作用可能与抑制OGD诱导的NLRP3炎症体及IL-1β、TNF-α表达增加相关，揭示其在OGD介导胶质细胞炎症反应中发挥重要作用，为脑缺血损伤的治疗提供新思路。

参考文献

[1] CHEN X， WU S， CHEN C， et al. Omega-3 polyunsaturated fatty acid supplementation attenuates microglial-induced inflammation by inhibiting the HMGB1/TLR4/NF-κB pathway following experimental traumatic brain injury［J］. J Neuroinflammation， 2017， 14（1）： 143-154.

[2] DAI Z J， TANG W， LU W F， et al. Antiproliferative and apoptotic effects of β-elemene on human hepatoma HepG2 cells［J］. Cancer Cell Int， 2013， 13（1）： 27-36.

[3] 郑月华， 韩雪， 汤磊磊. 榄香烯调节大鼠脑缺血再灌注慢性损伤的保护作用及相关机制［J］. 浙江医学， 2021， 43（19）： 2063-2067.

[4] ZHENG Yuehua， HAN Xue， TANG Leilei. Elemene protects rats from chronic cerebral injury induced by ischemia/reperfusion and its mechanisms［J］. Zhejiang Medical Journal， 2021， 43（19）： 2063-2067.

[5] 赵丽英， 郑蓓. 榄香烯乳对小鼠全脑缺血再灌注损伤的神经保护作用［J］. 中国药物应用与监测， 2020， 17（6）： 364-366.

[6] ZHAO Liying， ZHENG Bei. Neuroprotective effects of elemene on mice with global cerebral ischemia-reperfusion injury［J］. Chinese Journal of Drug Application and Monitoring， 2020， 17（6）： 364-366.

[7] XU X， ZHANG L， YE X， et al. Nrf2/ARE pathway inhibits ROS-induced NLRP3 inflammasome activation in BV2 cells after cerebral ischemia reperfusion［J］. Inflamm Res， 2018， 67（1）： 57-65.

[8] 吴飞飞， 郭明. 汉防己甲素对缺氧缺糖损伤BV2细胞炎症反应的影响［J］. 中国临床药理学杂志， 2020， 36（10）： 1350-1352.

[9] WU Feifei， GUO Ming. Effects of tetrandrine on inflammation caused by hypoxic and hypoglycemic in BV2 cells［J］. The Chinese Journal of Clinical Pharmacology， 2020， 36（10）： 1350-1352.

[10] 杨雨晨， 陈晶， 马力天， 等. 中药提取物榄香烯在镇痛作用中的研究进展［J］. 世界中医药， 2023， 18（23）： 3449-3456.

[11] YANG Yuchen， CHEN Jing， MA Litian， et al. Research progress on analgesic effect of elemene， a traditional Chinese medicine extract［J］. World Chinese Medicine， 2023， 18（23）： 3449-3456.

[12] 李联平. β-榄香烯对吉非替尼在体外血脑屏障模型中转运的影响［D］. 北京： 中国人民解放军医学院， 2014.

[13] BAO F， QIU J， ZHANG H. Potential role of β-elemene on histone H1 in the H22 ascites hepatoma cell line［J］. Mol Med Rep， 2012， 6（1）： 185-190.

[14] 丁可， 徐庆， 余伟冰， 等. HAIC联合动脉灌注榄香烯注射液治疗进展期肝癌临床研究［J］. 海南医学， 2024， 35（16）： 2301-2304.

[15] DING Ke， XU Qing， YU Weibing， et al. Clinical study of hepatic arterial infusion chemotherapy combined with arterial infusion of elemene injection in the treatment of advanced liver cancer［J］. Hainan Medical Journal， 2024， 35（16）： 2301-2304.

[16] CUNNINGHAM C L， MARTÍNEZ-CERDEÑO V， NOCTOR S C. Microglia regulate the number of neural precursor cells in the developing cerebral cortex［J］. J Neurosci， 2013， 33（10）： 4216-4233.

[17] PAN M L， AHMAD PUZI N N， OOI Y Y， et al. Response profiles of BV2 microglia to IFN-γ and LPS Co-stimulation and priming［J］. Biomedicines， 2023， 11（10）： 2648.

[18] AMINZADEH M， ROGHANI M， SARFALLAH A， et al. TRPM2 dependence of ROS-induced NLRP3 activation in Alzheimer’s disease［J］. Int Immunopharmacol， 2018， 54： 78-85.

[19] QIU J， WANG M， ZHANG J， et al. The neuroprotection of Sinomenine against ischemic stroke in mice by suppressing NLRP3 inflammasome via AMPK signaling［J］. Int Immunopharmacol， 2016， 40： 492-500.

[20] VILA N， CASTILLO J， DÁVALOS A， et al. Proinflammatory cytokines and early neurological worsening in ischemic stroke［J］. Stroke， 2000， 31（10）： 2325-2329.

[21] 冯鹏超， 周利飞， 靳文艳. 生物活性脂类淫羊藿苷和卡里丁通过调节炎症基因和可塑性相关基因蛋白1促进脑卒中神经功能恢复的机制［J］. 西北药学杂志， 2025， 40（2）： 87-94.

[22] FENG Pengchao， ZHOU Lifei， JIN Wenyan. Mechanism of bioactive lipids icariin and caridin on promoting neurofunctional recovery via regulating inflammatory genes and plasticity related gene 1 after stroke［J］. Northwest Pharmaceutical Journal， 2025， 40（2）： 87-94.

[23] ALBORNOZ E A， WOODRUFF T M， GORDON R. Inflammasomes in CNS diseases［J］. Exp Suppl， 2018， 108： 41-60.

[24] 江万清， 张宗芳， 陈增华. 黄芪多糖通过NF-κB/IRF-3/IRF-7轴对自身免疫性炎性肌病大鼠免疫功能及炎性症状作用的研究［J］. 西北药学杂志， 2024， 39（5）： 83-88.

[25] JIANG Wanqing， ZHANG Zongfang， CHEN Zenghua. Study on the effect of Astragalus polysaccharides on the immune function and inflammatory symptoms in rats with autoimmune inflammatory myopathy through NF-κB/IRF-3/IRF-7 axis［J］. Northwest Pharmaceutical Journal， 2024， 39（5）： 83-88.

基金资助

湖州市科学技术局项目(2020GY46)

浙江省卫生健康委委托研究课题(201901385)