蓝靛果忍冬叶中木脂素类成分及其细胞毒作用的研究

Lignans of the leaves of Lonicera caerulea var. edulis and their cytotoxicity in HepG2 cells

摘要

目的 探究蓝靛果忍冬叶（Lonicera caerulea var. edulis）中的木脂素类成分及其细胞毒作用。 方法 利用正相柱色谱、反相柱色谱、Sephadex LH-20柱色谱、半制备高效液相色谱等现代色谱技术对蓝靛果忍冬叶的提取物进行分离和纯化，通过各种波谱技术结合理化性质鉴定化合物的结构，采用HepG2细胞模型评价这些化合物的细胞毒作用。 结果 从蓝靛果忍冬叶中共分离得到13个木脂素类化合物，分别鉴定为（+）-isolariciresinol （1）、glochidioboside（2）、liriodendrin（3）、4，9，9'-trihydroxy-3，3'，5-trimethoxy-4'，7-epoxy-8，5'-neolignan-9'-O-β-d-glucopyrano side（4）、（+）-isolarisiresinol-3α-O-β-d-glucopyranoside（5）、urolignoside（6）、sargentodoside B（7）、sargentodoside A（8）、erythro-7，9，9'-trihydroxy-3，3'- dimethoxy-8-O-4'- neolignan-4-O-β-d-glucopyranoside（9）、acernikol-4''-O-β-d-gluco pyranoside（10）、illiciumlignan O（11）、illiciumlignan N（12）、potentillalignan B（13）。分离得到的13个木脂素类化合物对HepG2细胞均无显著的细胞毒作用。 结论 这13个木脂素类化合物对HepG2细胞的毒性均较弱，且均为首次从该植物中分离得到。

Abstract

Objective To study the lignans constituents of the leaves of Lonicera caerulea var. edulis and their cytotoxicity in HepG2 cells. Methods The extract of the leaves of L. caerulea was purified by normal phase column chromatography， reverse phase column chromatography， Sephadex LH-20 chromatography， and semi-preparative high-performance liquid chromatography （HPLC）， etc. The structures of lignans were elucidated by detailed spectroscopic analysis based on physicochemical properties of the compounds. Methyl thiazolyl tetrazolium （MTT） method was used to evaluate their cytotoxicity in HepG2 cells. Results Thirteen lignans were isolated and identified as （+）-isolariciresinol （1）， glochidioboside （2），liriodendrin （3）， 4，9，9'-trihydroxy-3，3'，5-trimethoxy-4'，7-epoxy-8，5'-neolignan-9'-O-β-d-gluco pyranoside （4）， （+）-isolarisiresinol-3α-O-β-d-glucopy ranoside （5）， urolignoside（6）， sargentodoside B （7）， sargentodoside A （8）， erythro-7，9，9'-trihydroxy-3，3'-dimethoxy-8-O-4'-neolignan-4-O-β-d-glucopyranoside（9）， acernikol-4''-O-β-d-gluco pyranoside （10）， illiciumlignan O （11）， illiciumlignan N （12）， and potentillalignan B （13）. These thirteen compounds did not exhibit significantly cytotoxicity in HepG2 cells. Conclusion These thirteen lignans had weak cytotoxicity in HepG2 cells and these compounds were isolated from the plant for the first time.

关键词

民族药 / 药食两用 / 蓝靛果忍冬 / 木脂素 / 细胞毒

Key words

ethnic herbs / edible herbs / Lonicera caerulea / lignans / cytotoxicity

蓝靛果忍冬（Lonicera caerulea var. edulis）属于忍冬科忍冬属，作为一种药食两用的植物，其果实俗称蓝靛果、羊奶子^［1-2］等。该植物为落叶小灌木，抗寒能力强，国内主要分布在东北、西北、华北地区^［3］，国外多产于日本、俄罗斯等。蓝靛果忍冬的果实味酸稍苦，富含维生素、氨基酸等营养物质，是一种人们十分喜爱的浆果，又因其含有丰富的紫红色花青素而被用来制作饮料和果酱等。同时是一种鄂伦春族常用的民族药，蓝靛果忍冬的果实、花、叶、枝、皮均可入药，有清热败火，利湿解毒的作用^［4］，常外敷用于治疗疮痈等。作为药食两用的重要资源，蓝靛果忍冬具有巨大的经济、药用价值及进一步开发和利用的潜力。

国内外学者已对蓝靛果忍冬果实的化学成分进行了较深入的研究，但对其叶化学成分的研究却十分有限。本课题组前期对该植物叶的化学成分进行了初步的研究，从中分离鉴定了多种化学成分，结构类型包括三萜、生物碱、木脂素等^［5］，其中的木脂素类成分具有多种生物活性。为进一步阐明该民族药叶中的化学成分，本课题组主要对蓝靛果忍冬叶中的木脂素类成分进行分离纯化，并对这些化合物的细胞毒作用进行初步研究。

1 仪器与材料

1.1 仪器

PuriMaster 5000型半制备型高效液相色谱仪（上海科哲生物科技有限公司）；Megres C₁₈分析型色谱柱（5 μm，120 Å，250 mm×4.6 mm，江苏汉邦科技有限公司）；Megres C₁₈半制备型色谱柱（5 μm，120 Å，250 mm×10.0 mm，江苏汉邦科技有限公司）；AVANCE Ⅲ HD 600 MHz型核磁共振仪（德国Bruker公司）；WATERS Ⅰ-Class VION IMS QTof 质谱仪（美国WATERS公司）；IP-digi300/8plusFD-V3型旋光仪（InsMark）；全波长多功能酶标仪（SuPerMax 3100，上海科哲生物科技有限公司）。

1.2 试药

甲醇、氯仿、二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯和正丁醇等实验所用试剂均为分析纯，购自天津市大茂化学试剂厂；DMEM培养基和胰蛋白酶均购自美国Hyclone公司；FBS（美国Gibco公司）；MTT试剂（阿拉丁生化科技股份有限公司）。

蓝靛果忍冬叶于2020年采集于黑龙江省北安市通北，经西安交通大学药学院张海龙教授鉴定为植物蓝靛果忍冬（Lonicera caerulea var. edulis）的干燥叶，凭证标本（编号：LCE20200915）现保存于西安交通大学药学院。

1.3 细胞

人肝癌HepG2细胞，由西安交通大学第一附属医院泌尿外科提供。

2 方法与结果

2.1 提取与分离

取25.0 g酸不溶正丁醇层萃取物，用ODS柱，以MeOH-H₂O（体积比10∶90~100∶0）为流动相对其进行分离，得到14个流份（Bu-1至Bu-14）。利用硅胶柱，以CH₂Cl₂-MeOH（体积比分别为25∶1、15∶1、5∶1、0∶1）为流动相对Bu-8进行分离，得到9个流份（Bu-8-1至Bu-8-9）。利用硅胶柱，以CH₂Cl₂-MeOH（体积比分别为25∶1、15∶1、5∶1、0∶1）为流动相对Bu-8-4进行分离，得到9个流份（Bu-8-4-1至Bu-8-4-9）。利用重结晶从Bu-8-4-1中得到化合物1 （26.2 mg）。利用HPLC，以MeOH-H₂O（体积比35∶65）为流动相对Bu-8-4-6进行分离纯化，在t_R=41.42 min处得到化合物2 （5.8 mg）。用MeOH对Bu-8-4-7进行重结晶，得化合物3 （8.9 mg）。利用HPLC，以MeOH-H₂O（体积比33∶67）为流动相对Bu-8-7进行分离纯化，在t_R=62.10和80.82 min处分别得化合物4 （3.2 mg）和5（2.6 mg）。利用Sephadex LH-20凝胶柱，以MeOH为流动相对Bu-10进行分离，得到3个流份（Bu-10-1、Bu-10-2、Bu-10-3）。对Bu-10-2进行纯化后得化合物6 （3.5 mg）。利用ODS柱，以MeOH-H₂O（体积比10∶90~100∶0）为流动相对Bu-5进行分离，得到15个流份（Bu-5-1至Bu-5-15）。利用Sephadex LH-20凝胶柱，以MeOH为流动相对Bu-5-5进行分离，得化合物7 （4.3 mg）。

对碱性正丁醇层的9个流份（Bu-1至Bu-3，Bu-10至Bu-15）进行分离。利用ODS柱，以MeOH-H₂O （10∶90~100∶0）为流动相对Bu-10进行分离，得到12个流份（Bu-10-1至Bu-10-12）。利用硅胶柱，以CH₂Cl₂-MeOH（体积比分别为30∶1、20∶1、10∶1、0∶1）为流动相对Bu-10-8进行分离，得到9个流份（Bu-10-8-1至Bu-10-8-9）。利用硅胶柱，以CH₂Cl₂-MeOH（15∶1、5∶1、0∶1）为流动相对Bu-10-8-4进行分离，得到6个流份（Bu-10-8-4-1至Bu-10-8-4-6）。利用Sephadex LH-20凝胶柱，以MeOH为流动相对Bu-10-8-4-4进行分离，得到4个流份（Bu-10-8-4-4-1至Bu-10-8-4-4-4）。利用HPLC，以MeOH-H₂O （体积比22∶78）为流动相对Bu-10-8-4-4-2进行分离纯化，在t_R=28.50 min处得化合物8 （1.4 mg）。利用HPLC，以MeOH-H₂O（体积比26∶74）为流动相对Bu-10-8-4-3进行分离纯化，在t_R=51.25 min处得化合物9 （6.7 mg）。利用ODS柱，以MeOH-H₂O（体积比10∶90~100∶0）为流动相对Bu-10-8-6进行分离，得到8个流份（Bu-10-8-6-1至Bu-10-8-6-8）。Bu-10-8-6-3经PTLC （CH₂Cl₂-MeOH-H₂O 7∶2∶0.5）纯化后得化合物10 （3.8 mg）。利用Sephadex LH-20凝胶柱，以MeOH为流动相对Bu-10-8-6-5进行分离，得到4个流份（Bu-10-8-6-5-1至Bu-10-8-6-5-4）。利用HPLC，以MeOH-H₂O （体积比30∶70）为流动相对Bu-10-8-6-5-2进行分离纯化，在t_R=43.16 min处得化合物11 （8.1 mg）。Bu-10-8-6-5-3经PTLC（CH₂Cl₂-MeOH-H₂O 7∶2∶0.5）纯化后得化合物12 （11.3 mg）。利用ODS柱，以MeOH-H₂O （体积比10∶90~100∶0）为流动相对Bu-10-4进行分离，得到8个流份（Bu-10-4-1至Bu-10-4-8）。利用Sephadex LH-20凝胶柱，以MeOH为流动相对Bu-10-4-5进行分离，得到5个流份（Bu-10-4-5-1至Bu-10-4-5-5）。利用Sephadex LH-20凝胶柱，以MeOH为流动相对Bu-10-4-6进行分离，得到4个流份（Bu-10-4-6-1至Bu-10-4-6-4）。利用HPLC，以MeOH-H₂O（体积比25∶75）为流动相对Bu-10-4-6-3进行分离纯化，在t_R=39.63 min处得化合物13（3.6 mg）。

2.2 结构鉴定

化合物1：白色粉末，易溶于MeOH，［α］{}_{\mathrm{D}}^{\mathrm{25}} +36.0° （c 0.12， MeOH），质谱显示相对分子质量为360.2，分子式为C₂₀H₂₄O₆。¹H-NMR （600 MHz， CD₃OD）： δ_H 6.74 （1H， d， J=7.8 Hz， H-5）， 3.40 （1H， dd， J=10.8， 3.6 Hz， H-9b）， 6.67 （1H， d， J=2.4 Hz， H-2）， 6.18 （1H， s， H-5'）， 6.66 （1H， s， H-2'）， 3.81 （3H， s， 3'-OCH₃）， 3.81 （1H， overlapped， H-7）， 3.78 （3H， s， 3-OCH₃）， 6.62 （1H， dd， J=7.8， 1.8 Hz， H-6）， 3.67 （3H， m， H-9a， H₂-9'）， 2.78 （2H， d， J=7.8 Hz， H₂-7'）， 2.00 （1H， m， H-8'）， 1.76 （1H， m， H-8）. ¹³C-NMR （150 MHz， CD₃OD）： δ_C 149.0 （C-3）， 138.6 （C-1）， 147.2 （C-3'）， 129.0 （C-1'）， 145.9 （C-4）， 145.3 （C-4'）， 134.2 （C-6'）， 123.2 （C-6）， 117.3 （C-5'）， 116.0 （C-5）， 113.7 （C-2）， 112.3 （C-2'）， 65.9 （C-9'）， 62.2 （C-9）， 56.4 （3'-OCH₃）， 56.3 （3-OCH₃）， 48.0 （C-7）， 48.0 （C-8）， 39.9 （C-8'）， 33.6 （C-7'）。将核磁数据与文献中的数据^［6］进行比对，确定该化合物为（+）-isolariciresinol。

化合物2：白色粉末，易溶于MeOH，［α］{}_{\mathrm{D}}^{\mathrm{25}} -16.2° （c 0.10， MeOH），质谱显示相对分子质量为522.2，分子式为C₂₆H₃₄O₁₁。¹H-NMR （600 MHz， CD₃OD）： δ_H 5.49 （1H， d， J=6.0 Hz， H-7）， 6.95 （1H， d， J= 1.8 Hz， H-2）， 6.76 （3H， overlapped， H-2'， 5， 6'）， 4.26 （1H， d， J=7.8 Hz， H-1''）， 2.68 （2H， m， H₂-7'）， 6.82 （1H， dd， J=8.4， 1.8 Hz， H-6）， 3.93 （1H， m， H-9'a）， 3.87 （1H， m， H-6''b）， 3.86 （3H， s， 3'-OCH₃）， 3.84 （1H， m， H-9a）， 3.82 （3H， s， 3-OCH₃）， 3.75 （1H， dd， J=10.8， 7.2 Hz， H-9b）， 3.67 （1H， dd， J=11.4， 5.4 Hz， H-6''a ）， 3.54 （1H， m， H-9'b）， 3.47 （1H， dd， J=12.0， 6.0 Hz， H-8）， 3.35 （1H， m， H-5''）， 3.28 （1H， d， J=9.0 Hz， H-4''）， 3.25 （1H， m， H-3''）， 3.20 （1H， dd， J=9.6， 7.8 Hz， H-2''）， 1.91 （2H， m， H₂-8'）. ¹³C-NMR （150 MHz， CD₃OD）： δ_C 149.1 （C-3）， 147.6 （C-4）， 147.5 （C-4'）， 145.2 （C-3'）， 136.9 （C-1'）， 134.7 （C-1）， 129.8 （C-5'）， 119.7 （C-6）， 118.0 （C-6'）， 116.1 （C-5）， 114.2 （C-2'）， 110.5 （C-2）， 104.5 （C-1''）， 89.0 （C-7）， 78.1 （C-3''）， 77.9 （C-5''）， 75.2 （C-2''）， 71.7 （C-4''）， 70.0 （C-9'）， 65.0 （C-9）， 62.8 （C-6''）， 56.8 （C-4'）， 56.3 （C-3'）， 55.5 （C-8）， 33.0 （C-7'）， 32.9 （C-8'）。将该数据与文献^［7］中的数据进行比对，确定该化合物为glochidioboside。

化合物3：白色针晶，易溶于H₂O，质谱显示相对分子质量为742.3，分子式为C₃₄H₄₆O₁₈。¹H-NMR （600 MHz， D₂O）： δ_H 6.80 （4H， s， H-2'， 2''， 6'， 6''）， 5.02 （2H， dd， J=7.2， 1.8 Hz， H-1'''， 1''''）， 4.90 （2H， d， J=4.2 Hz， H-2， 6）， 4.34 （2H， dd， J=9.6， 6.6 Hz， H-4a， 8a）， 3.99 （2H， dd， J=9.0， 3.0 Hz， H-4b， 8b）， 3.87 （12H， s， 3'， 3''， 5'， 5''-OCH₃）， 3.80 （2H， dd， J=12.6， 2.4 Hz， H-6'''b， 6''''b）， 3.69 （2H， dd， J=12.0， 5.4 Hz， H-6'''a， 6''''a）， 3.54 （4H， m， H-4'''， 4''''， 5'''， 5''''）， 3.46 （2H， m， H-1， 5）， 3.32 （4H， m， H-2'''， 2''''， 3'''， 3''''）. ¹³C-NMR （150 MHz， D₂O）： δ_C 152.3 （C-3'， 3''， 5'， 5''）， 137.9 （C-4'， 4''）， 132.9 （C-1'， 1''）， 103.8 （C-2'， 2''， 6'， 6''）， 102.8 （C-1'''， 1''''）， 85.7 （C-2， 6）， 76.3 （C-5'''， 5''''）， 75.6 （C-3'''， 3''''）， 73.6 （C-2'''， 2''''）， 71.6 （C-4， 8）， 69.3 （C-4'''， 4''''）， 60.5 （C-6'''， 6''''）， 56.2 （3'， 3''， 5'， 5''-OCH₃）， 53.2 （C-1， 5）。该化合物的核磁数据与文献^［8］中的数据进行比对，确定该化合物为liriodendrin。

化合物4：白色粉末，易溶于MeOH，质谱显示相对分子质量为552.2，分子式为C₂₇H₃₆O₁₂。¹H-NMR （600 MHz， CD₃OD）： δ_H 6.74 （3H， s， H-2， 2'， 6）， 6.71 （1H， s， H-6'）， 5.56 （1H， d， J=6.0 Hz， H-7）， 3.89~3.86 （1H， m， H-9a）， 3.88 （3H， s， 3'-OCH₃）， 3.82 （6H， s， 3， 5-OCH₃）， 3.79~3.74 （2H， overlaped， H-6''a， 9b）， 3.66 （1H， m， H-6''b）， 3.56 （2H， t， J=6.6 Hz， H-9'）， 3.49~3.44 （2H， m， H-5''， 8）， 3.40 （2H， m， H-3''， 4''）， 3.19 （1H， m， H-2''）， 2.63 （2H， t， J=7.2 Hz， H₂-7'）， 1.82 （2H， m， H₂-8'）. ¹³C-NMR （150 MHz， CD₃OD）： δ_C 154.4 （C-3， 5）， 147.4 （C-4'）， 145.3 （C-3'）， 140.3 （C-1）， 137.2 （C-1'）， 135.6 （C-4）， 129.4 （C-5'）， 117.9 （C-6'）， 114.2 （C-2'）， 104.4 （C-2）， 104.4 （C-6）， 88.5 （C-7）， 78.3 （C-5''）， 77.8 （C-3''）， 75.7 （C-2''）， 71.3 （C-4''）， 65.1 （C-9）， 62.6 （C-6''）， 62.2 （C-9'）， 57.0 （3， 5-OCH₃）， 56.8 （3'-OCH₃）， 55.8 （C-8）， 35.8 （C-8'）， 32.9 （C-7'）。将氢谱和碳谱数据与文献^［9］中的数据进行比对，确定该化合物为4， 9， 9'-trihydroxy-3， 3'， 5-trimethoxy-4'， 7-epoxy-8， 5'-neolignan-9'-O-β-d-glucopyranoside。

化合物5：白色粉末，易溶于MeOH，［α］{}_{\mathrm{D}}^{\mathrm{25}} +33.2° （c 0.22， MeOH），质谱显示相对分子质量为522.2，分子式为C₂₆H₃₄O₁₁。¹H-NMR （600 MHz， CD₃OD）： δ_H 6.78 （1H，d， J=2.4 Hz， H-2'）， 6.73 （1H， d， J= 8.4 Hz， H-5'）， 6.64 （2H， m， H-6'， 8）， 6.18 （1H， s， H-5）， 4.12 （1H， d， J=7.8 Hz， H-1''）， 4.07 （1H， m， H-4）， 3.83 （1H， dd， J=12.0， 2.4 Hz， H-3ab）， 3.81 （3H， s， 3'-OCH₃）， 3.80 （3H， s， 7-OCH₃）， 3.77 （1H， dd， J=11.4， 3.6 Hz， H-3aa）， 3.72 （1H， dd， J=10.8， 6.0 Hz， H-6''a）， 3.65 （1H， dd， J=12.0， 6.0 Hz， H-6''b）， 3.34 （1H， dd， J=9.0， 5.4 Hz， H-4''）， 3.29~3.18 （4H， m， H₂-2a， H-2''， 3''）， 2.82 （2H， m， H₂-1）， 2.09 （1H， m， H-2）， 1.86 （1H， m， H-3）. ¹³C-NMR （150 MHz， CD₃OD）： δ_C 149.0 （C-3'）， 147.2 （C-7）， 146.1 （C-6）， 145.3 （C-4'）， 138.5 （C-1'）， 134.4 （C-10）， 129.0 （C-9）， 123.1 （C-6'）， 117.4 （C-5）， 116.1 （C-5'）， 114.3 （C-2'）， 112.4 （C-8）， 105.2 （C-1''）， 78.1 （C-3''）， 77.9 （C-5''）， 75.2 （C-2''）， 71.7 （C-4''）， 69.5 （C-3a）， 65.2 （C-2a）， 62.8 （C-6''）， 56.5 （C-7）， 56.4 （C-3'）， 47.9 （C-4）， 45.9 （C-3）， 39.5 （C-2）， 33.9 （C-1）。该数据与文献^［10］中的化合物数据一致，故鉴定该化合物为（+）-isolarisiresinol-3α-O-β-d-glucopyranoside。

化合物6：白色粉末，易溶于MeOH，质谱显示相对分子质量为522.2，分子式为C₂₆H₃₄O₁₁。¹H-NMR （600 MHz， CD₃OD）： δ_H 7.14 （1H， d， J=8.4 Hz， H-5）， 5.55 （1H， d， J=5.4 Hz， H-7）， 7.03 （1H， s， H-2）， 6.73 （1H， s， H-6'）， 6.72 （1H， s， H-2'）， 4.89 （1H， d， J=7.2 Hz， H-1''）， 3.86 （3H， s， 3'-OCH₃）， 6.93 （1H， dd， J=8.4， 1.8 Hz， H-6）， 3.83 （3H， s， 3-OCH₃）， 3.75 （1H， dd， J=10.8， 7.2 Hz， H-9a）， 3.68 （1H， m， H-6''a）， 3.57 （2H， t， J=6.0 Hz， H-9'）， 3.50~3.43 （3H， m， H-6''b， 8， 9b）， 3.39 （2H， m， H-4''， 5''）， 2.63 （2H， m， H-7'）， 1.81 （2H， m， H-8'）. ¹³C-NMR （150 MHz， CD₃OD）： δ_C 150.9 （C-3）， 147.6 （C-4）， 147.5 （C-4'）， 145.3 （C-3'）， 138.3 （C-1）， 137.1 （C-1'）， 129.6 （C-5'）， 119.4 （C-5）， 118.0 （C-6）， 117.9 （C-6'）， 114.1 （C-2'）， 111.1 （C-2）， 102.8 （C-1''）， 88.4 （C-7）， 78.2 （C-3''）， 77.8 （C-5''）， 74.9 （C-2''）， 71.3 （C-4''）， 65.1 （C-9）， 62.5 （C-6''）， 62.2 （C-9'）， 56.8 （3-OCH₃）， 56.7 （3'-OCH₃）， 55.7 （C-8）， 35.8 （C-7'）， 32.9 （C-8'）。该数据与文献^［11］中的化合物数据一致，确定该化合物为urolignoside。

化合物7：白色粉末，易溶于MeOH，质谱显示相对分子质量为522.2，分子式为C₂₆H₃₄O₁₁。¹H-NMR （600 MHz， CD₃OD）： δ_H 6.75 （2H， overlapped， H-4， 5'）， 6.69 （1H， d， J=1.8 Hz， H-2'）， 6.64 （1H， dd， J=8.4， 2.4 Hz， H-6'）， 6.42 （1H， s， H-1）， 4.62 （1H， d， J=7.2 Hz， H-1''）， 3.83 （3H， s， 4'-OCH₃）， 3.82 （1H， overlapped， H-8）， 3.79 （3H， s， 3'-OCH₃）， 2.83 （2H， d， J=7.8 Hz， H₂-5）， 2.04 （1H， m， H-6）， 1.81 （1H， m， H-7）. ¹³C-NMR （150 MHz， CD₃OD）： δ_C 149.1 （C-3'）， 148.6 （C-4'）， 146.1 （C-2）， 145.8 （C-3）， 138.1 （C-1'）， 134.4 （C-10）， 132.0 （C-9）， 123.3 （C-6'）， 118.5 （C-1）， 116.1 （C-5'）， 113.7 （C-2'）， 113.2 （C-4）， 102.2 （C-1''）， 77.8 （C-5''）， 77.6 （C-3''）， 74.6 （C-2''）， 70.3 （C-4''）， 65.7 （C-6a）， 62.0 （C-7a）， 61.3 （C-6''）， 56.7 （3'-OCH₃）， 56.4 （4'-OCH₃）， 48.1 （C-8）， 47.5 （C-7）， 39.8 （C-6）， 33.6 （C-5）。将谱图数据与文献^［12］中的数据进行比对，基本一致，故鉴定该化合物为sargentodoside B。

化合物8：白色粉末，易溶于MeOH，质谱显示相对分子质量为522.2，分子式为C₂₆H₃₄O₁₁。¹H-NMR （600 MHz， CD₃OD）： δ_H 4.66 （1H， d， J=7.8 Hz， H-1''）， 6.80 （1H， s， H-4）， 4.28 （1H， d， J=3.6 Hz， H-8）， 6.72 （1H， s， H-1）， 2.98 （1H， dd， J= 17.4， 4.2 Hz， H-5a）， 6.69 （1H， d， J=1.8 Hz， H-2'）， 3.76 （3H， s， 3'-OCH₃）， 6.65 （1H， d， J=8.4 Hz， H-5'）， 6.43 （1H， dd， J=7.8， 1.8 Hz， H-6'）， 3.85 （3H， s， 3-OCH₃）， 2.67 （1H， m， H-5b）， 2.06 （2H， m， H-6， 7）。将核磁数据与文献^［12］中的数据进行比对，确定该化合物为sargentodoside A。

化合物9：白色粉末，易溶于MeOH，质谱显示相对分子质量为540.2，分子式为C₂₆H₃₆O₁₂。¹H-NMR （600 MHz， CD₃OD）： δ_H 7.10 （2H， m， H-2， 5）， 6.95 （1H， dd， J=7.8， 1.8 Hz， H-6）， 6.81 （2H， m， H-2'， 5'）， 6.66 （1H， d， J=8.4 Hz， H-6'）， 4.29 （1H， m， H-8）， 3.82 （3H， s， 3'-OCH₃）， 3.78 （3H， s， 3-OCH₃）， 3.55 （2H， t， J=6.6 Hz， H₂-9'）， 2.60 （2H， t， J=7.8 Hz， H₂-7'）， 1.79 （2H， m， H₂-8'）. ¹³C-NMR （150 MHz， CD₃OD）： δ_C 151.8 （C-3'）， 150.5 （C-3）， 147.3 （C-4）， 147.1 （C-4'）， 138.1 （C-1'）， 137.7 （C-1）， 121.8 （C-6'）， 121.0 （C-6）， 119.4 （C-5'）， 117.5 （C-5）， 114.0 （C-2'）， 112.6 （C-2）， 103.0 （C-1''）， 86.3 （C-8）， 78.2 （C-5''）， 77.8 （C-3''）， 74.9 （C-2''）， 73.8 （C-7）， 71.3 （C-4''）， 62.5 （C-6''）， 62.2 （C-9'）， 62.0 （C-9）， 56.6 （3'-OCH₃）， 56.5 （3-OCH₃）， 35.5 （C-8'）， 32.7 （C-7'）。将谱图数据与文献^［13］中的数据进行比对，确定化合物为erythro-7，9，9'-trihydroxy-3，3'-dimethoxy-8-O-4'-neolignan-4-O-β-d-glucopyranoside。

化合物10：无色粉末，易溶于MeOH，质谱显示相对分子质量为748.3，分子式为C₃₇H₄₈O₁₆。¹H-NMR （600 MHz， CD₃OD）： δ_H 3.88 （3H， s， 7-OCH₃）， 7.09 （1H， d， J=8.4 Hz， H-5''）， 6.89 （1H， dd， J=8.4， 1.8 Hz， H-6''）， 4.91 （1H， d， J=5.4 Hz， H-7''）， 6.74 （1H， s， H-6）， 5.55 （1H， d， J=5.4 Hz， H-2）， 3.86 （1H， m， H-3aa）， 4.27 （1H， m， H-8''）， 6.72 （1H， s， H-4）， 3.90 （1H， m， H-9''a）， 3.84 （1H， overlapped， H-6'''b）， 6.69 （2H， s， H-2'， 6'）， 7.02 （1H， d， J=2.4 Hz， H-2''）， 3.83 （3H， s， 3''-OCH₃）， 3.77 （6H， s， 3'， 5'-OCH₃）， 3.76 （1H， m， H-3ab）， 3.63 （1H， m， H-6'''a）， 3.59 （1H， m， H-9''b）， 3.57 （2H， m， H₂-5c）， 2.63 （2H， t， J=7.8 Hz， H₂-5a）， 1.82 （2H， m， H₂-5b）. ¹³C-NMR （150 MHz， CD₃OD）： δ_C 154.5 （C-3'， 5'）， 150.3 （C-3''）， 147.4 （C-7a）， 147.1 （C-4''）， 145.3 （C-7）， 139.7 （C-1'）， 137.3 （C-5）， 137.2 （C-1''）， 136.1 （C-4'）， 129.5 （C-4a）， 121.0 （C-6''）， 118.0 （C-4）， 117.2 （C-5''）， 114.2 （C-6）， 112.2 （C-2''）， 103.8 （C-2'）， 103.7 （C-6'）， 102.7 （C-1'''）， 88.5 （C-2）， 86.9 （C-8''）， 78.2 （C-3'''）， 77.8 （C-5'''）， 74.9 （C-2'''）， 73.8 （C-7''）， 71.3 （C-4'''）， 65.1 （C-3a）， 62.5 （C-6'''）， 62.2 （C-5c）， 61.7 （C-9''）， 56.8 （7-OCH₃）， 56.6 （3'， 3''， 5'-OCH₃）， 55.8 （C-3）， 35.8 （C-5b）， 32.9 （C-5a）。将以上数据与文献^［14］中的数据进行比对，基本一致，故鉴定该化合物为acernikol-4″-O-β-d-glucopyranoside。

化合物11：白色粉末，易溶于MeOH，质谱显示相对分子质量为748.3，分子式为C₃₇H₄₈O₁₆。¹H-NMR （600 MHz， CD₃OD）： δ_H 7.12 （1H， d， J=8.4 Hz， H-5''）， 7.05 （1H， s， H-2''）， 6.92 （1H， dd， J=9.0， 1.8 Hz， H-6''）， 6.74 （1H， s， H-6）， 6.71 （3H， m， H-2， 2'， 6'）， 5.55 （1H， m， H-7'）， 4.94 （1H， d， J=5.4 Hz， H-7''）， 4.24 （1H， m， H-8''）， 3.90 （1H， m， H-9''a）， 3.88 （3H， s， 5-OCH₃）， 3.85 （2H， m， H-6'''b， 9'a）， 3.83 （3H， s， 3''-OCH₃）， 3.78 （6H， s， 3'， 5'-OCH₃）， 3.75 （1H， m， H-9'b）， 3.69 （1H， m， H-6'''a）， 3.57 （3H， m， H-9''b， H₂-9）， 3.51~3.44 （3H， m， H-2'''， 5'''， 8'）， 3.40 （2H， m， H-3'''， 4'''）， 2.63 （2H， t， J=7.2 Hz， H₂-7）， 1.81 （2H， m， H₂-8）. ¹³C-NMR （150 MHz， CD₃OD）： δ_C 154.6 （C-3'， 5'）， 150.4 （C-3''）， 147.4 （C-4）， 147.2 （C-4''）， 145.3 （C-5）， 139.7 （C-1'）， 137.5 （C-1''）， 137.2 （C-1）， 136.1 （C-4'）， 129.5 （C-3）， 120.7 （C-6''）， 118.0 （C-2）， 117.5 （C-5''）， 114.2 （C-6）， 112.4 （C-2''）， 103.9 （C-2'， 6'）， 102.9 （C-1'''）， 88.6 （C-7'）， 87.2 （C-8''）， 78.2 （C-3'''）， 77.8 （C-5'''）， 74.9 （C-2'''）， 73.8 （C-7''）， 71.3 （C-4'''）， 65.1 （C-9'）， 62.5 （C-6'''）， 62.2 （C-9）， 61.5 （C-9''）， 57.5 （5-OCH₃）， 56.8 （3'-OCH₃）， 56.7 （5'-OCH₃）， 56.6 （3''-OCH₃）， 55.7 （C-8'）， 35.8 （C-8）， 32.9 （C-7）。将以上数据与文献^［15］中的数据进行比对，基本一致，确定该化合物为illiciumlignan O。

化合物12：黄色油状物，易溶于MeOH，质谱显示相对分子质量为748.3，分子式为C₃₇H₄₈O₁₆。¹H-NMR （600 MHz， CD₃OD）： δ_H 7.09 （1H， d， J= 7.8 Hz， H-5''）， 7.05 （1H， d， J=1.8 Hz， H-2''）， 6.89 （1H， dd， J=8.4， 1.8 Hz， H-6''）， 6.74 （1H， s， H-6）， 6.72 （1H， s， H-2）， 6.70 （2H， s， H-2'， 6'）， 5.53 （1H， d， J=6.0 Hz， H-7'）， 4.92 （1H， d， J=5.4 Hz， H-7''）， 4.27 （1H， m， H-8''）， 3.89 （1H， m， H-9''a）， 3.87 （3H， s， 5-OCH₃）， 3.86 （1H， m， H-9'a）， 3.84 （1H， m， H-6'''b）， 3.84 （3H， s， 3''-OCH₃）， 3.78 （6H， s， 3'， 5'-OCH₃）， 3.76 （1H， m， H-9'b）， 3.64 （1H， m， H-6'''a）， 3.57 （3H， m， H-9''b， H₂-9）， 3.50~3.44 （3H， m， H-2'''， 5'''， 8'）， 3.39~3.35 （2H， m， H-3'''， 4'''）， 2.63 （2H， t， J=7.2 Hz， H₂-7）， 1.81 （2H， m， H₂-8）。将该数据与文献^［15］中的数据进行比对，基本一致，确定该化合物为illiciumlignan N。

化合物13：棕色油状物，易溶于MeOH，质谱显示相对分子质量为508.2，分子式为C₂₅H₃₂O₁₁。¹H-NMR （600 MHz， CD₃OD）： δ_H 6.97 （1H， d， J=1.8 Hz， H-2）， 6.94 （1H， s， H-3'）， 6.85 （1H， dd， J=8.4， 2.4 Hz， H-6）， 6.82 （1H， s， H-6'）， 6.77 （1H， d， J=7.8 Hz， H-5）， 5.53 （1H， d， J=6.6 Hz， H-7）， 4.98 （1H， d， J=7.8 Hz， H-1''）， 3.90~3.84 （2H， overlapped， H-6''a， 9a）， 3.83 （3H， s， H₃-10）， 3.78 （1H， dd， J=10.8， 6.6 Hz， H-9b）， 3.69 （1H， dd， J=11.4， 5.4 Hz， H-6''b）， 3.57 （2H， t， J=6.6 Hz， H₂-9'）， 3.51 （1H， m， H-8）， 3.46~3.35 （4H， m， H-2''， 3''， 4''， 5''）， 2.63 （2H， t， J=7.2 Hz， H₂-7'）， 1.82 （2H， m， H₂-8'）. ¹³C-NMR （150 MHz， CD₃OD）： δ_C 149.2 （C-3）， 147.7 （C-4）， 147.5 （C-5'）， 142.5 （C-2'）， 137.0 （C-1'）， 134.3 （C-1）， 130.5 （C-4'）， 119.9 （C-6）， 119.6 （C-6'）， 118.1 （C-3'）， 116.2 （C-5）， 110.6 （C-2）， 102.9 （C-1''）， 89.4 （C-7）， 78.2 （C-5''）， 77.8 （C-3''）， 75.0 （C-2''）， 71.4 （C-4''）， 64.7 （C-9）， 62.6 （C-6''）， 62.2 （C-9'）， 56.4 （C-10）， 55.2 （C-8）， 35.6 （C-8'）， 32.7 （C-7'）。将该数据与文献^［16］中的数据进行比对，基本一致，确定该化合物为potentillalignan B。

2.3 细胞毒作用研究

将HepG2细胞悬液接种于96孔板中，细胞密度为2×10⁵个·孔^-1，置于37 ℃培养箱中5% CO₂的条件下培养24 h后，将终浓度分别为10、30、100 mol·L^-1的单体化合物加入培养基中，每组样品设置3个复孔，继续培养24 h后，向每孔中加入5 mg·mL^-1的MTT溶液（20 μL），继续培养4 h后吸去培养液，向每孔中加入150 μL DMSO，在恒温振荡器上振荡以溶解紫色结晶，测定490 nm处的吸光度值，计算细胞增值抑制率。

活性测定结果表明，上述13个化合物对HepG2细胞的细胞毒作用均较弱。见表1。

3 讨论

鄂伦春族原为我国北方的游牧民族，虽人数较少，但在特殊的地理环境下长期与疾病进行斗争，积累了丰富的医药学知识和经验。该少数民族有自己的语言，但没有本民族文字，随着定居、汉化及生活方式的改变，这些医药学知识和经验面临失传的风险，应尽快加以整理和研究。近年来，本课题组对几种鄂伦春族的民族药进行了一系列研究^［17-22］，阐明了其主要化学成分和药理活性，为这些民族药的民间应用提供了科学依据，也为继承和发扬鄂伦春族民族药奠定了基础。

蓝靛果忍冬作为一种鄂伦春族民族药，传统药用部位较多，同时蓝靛果忍冬的果实也是一种公认的食品，在美国、加拿大以及欧洲各国均被列入具有保健功能的食品范围，已有较多研究，但目前对其叶的化学成分和药理作用尚不清楚。本研究在前期研究的基础上进一步对蓝靛果忍冬叶中的木脂素类成分进行深入研究，基本阐明了其所含木脂素的结构类型，也证明了其对肝癌HepG2细胞的毒性较弱，该结果为下一步进行其他生物活性测试和深入研究奠定了基础。

参考文献

[1] 张欢，郭玉岩，苏发丽，等.蓝靛果的化学成分与功能活性研究进展［J］.现代中药研究与实践，2022，36（4）：93-98.

[2] ZHANG Huan， GUO Yuyan， SU Fali， et al. Research progress on chemical constituents and functional activities of Lonicera caerulea L. var. edulis turcz. ex herd［J］. Research and Practice on Chinese Medicines，2022，36（4）：93-98.

[3] 李梦莎，周琳，王化，等.蓝靛果花色苷的分离纯化及抗氧化能力［J］.经济林研究，2022，40（1）：142-149.

[4] LI Mengsha， ZHOU Lin， WANG Hua， et al. Separation and purification and antioxidant activity of anthocyanin from Lonicera caerulea ［J］. Non-wood Forest Research，2022，40（1）：142-149.

[5] 张龄予，侯苏芯，张文尉，等.蓝靛果的化学成分及其提取分离研究进展［J］.应用化学，2022，39（11）：1629-1640.

[6] ZHANG Lingyu， HOU Suxin， ZHANG Wenwei， et al. Research progress on chemical constituents and extraction and separation of Lonicera edulis ［J］. Chinese Journal of Applied Chemistry，2022，39（11）：1629-1640.

[7] 苏雅，裴毅，王柏茗，等.蓝靛果忍冬研究现状综述［J］.天津农林科技，2020，（4）：41-43.

[8] SU Ya， PEI Yi， WANG Baiming， et al. A review of the current research status of Lonicera japonica and Lonicera japonica ［J］. Science and Technology of Tianjin Agriculture and Forestry，2020，（4）：41-43.

[9] 刘杏，王欣，于春萍，等.鄂药挨姆末的化学成分及细胞毒作用研究［J］.西北药学杂志，2024，39（2）：1-5.

[10] LIU Xing， WANG Xin， YU Chunping， et al. Chemical constituents of Lonicera caerulea var.edulis and their cytotoxicity in HepG2 cells［J］. Northwest Pharmaceutical Journal，2024，39（2）：1-5.

[11] LI X Z， YAN Y M， ZHUANG X C， et al. Compounds from Codonopsis pilosula produced in Xundian of Yunnan province［J］. Nat Prod Res Dev，2017，29：1858-1866.

[12] DONG L P， NI W， DONG J Y， et al. A new neolignan glycoside from the leaves of acer truncatum［J］. Molecules，2006，11（12）：1009-1014.

[13] KINJO J， FUKUI K， HIGUCHI H， et al. The studies of the leguminous plants.Part 23. The first isolation of lignan tri-and tetra-glycosides［J］. Chem Pharm Bull （Tokyo），1991，39（6）：1623-1625.

[14] SHU J， LIANG F， ZHU G， et al. Lignan glycosides from the rhizomes of Smilax trinervula and their biological activities［J］. Phytochem Lett，2017，20：1-8.

[15] CHU H B， ZENG G Z， ZHU M J， et al. Chemical constituents of Pedicularis densispica Franch［J］. Chem Inform，2011，42（42）：641-646.

[16] KUANG H X， XIA Y G， YANG B Y， et al. Lignan constituents from Chloranthus japonicus Siebold［J］. Arch Pharm Res，2009，32（3）：329-334.

[17] ZENG X， WANG H， GONG Z， et al. Antimicrobial and cytotoxic phenolics and phenolic glycosides from Sargentodoxa cuneata ［J］. Fitoterapia，2015，101：153-161.

[18] MATSUDA N， KIKUCHI M. ChemInform abstract：Studies on the constituents of Lonicera species. part 10.Neolignan glycosides from the leaves of Lonicera gracilipes var. Glandulosa Maxim［J］. Chem Inform，1997，28（11）：199711226.

[19] 王芷，杨学东，査海燕，等.蝉翼藤根中木质素苷及蔗糖酯成分研究［J］.中国中药杂志，2017，42（12）：2318-2322.

[20] WANG Zhi， YANG Xuedong， Haiyan CHA， et al.Lignan glycosides and sucrose esters from roots of Securidaca inappendiculata ［J］. China Journal of Chinese Materia Medica，2017，42（12）：2318-2322.

[21] MA S J， LI H B， LI T，et al. Illiciumlignans G-O from the leaves of Illicium dunnianum and their anti-inflammatory activities［J］. RSC Adv，2021，11（49）：30725-30733.

[22] WANG W， MA X J， SU Y F， et al. Two new neolignans and one new benzyl benzoate glycoside from Potentilla discolor ［J］. Phytochem Lett，2020，39：25-29.

[23] 李英刚，王博博，杨晶，等.鄂药合叶子的化学成分及其抗炎和细胞毒活性研究［J］.西北药学杂志，2022，37（1）：1-5.

[24] LI Yinggang， WANG Bobo， YANG Jing， et al. Studies on the chemical constituents and their anti-inflammatory and cytotoxic activity of Filipendula palmate ［J］. Northwest Pharmaceutical Journal，2022，37（1）：1-5.

[25] 杨敏飞，张昌龙，刘杏，等.鄂药坎库拉的化学成分研究［J］.西北药学杂志，2021，36（3）：349-352.

[26] YANG Minfei， ZHANG Changlong， LIU Xing， et al. Study on the chemical constituents of Heracleum dissectum Ledeb［J］. Northwest Pharmaceutical Journal，2021，36（3）：349-352.

[27] GAO Y， WANG B， YANG J， et al. Chemical investigation and anti-inflammatory activities of the aerial part of Filipendula palmata［J］. J Ethnopharmacol，2022，287：114959.

[28] HUO Y， GAO Y， MI J， et al. Isolation and simultaneous quantification of nine triterpenoids from Rosa davurica pall［J］. J Chromatogr Sci，2017，55（2）：130-136.

[29] MI J， PENG Y J， ZHANG H M， et al. A new benzofuran derivative glycoside and a new coumarin glycoside from Roots of Heracleum dissectum Ledeb［J］. Medicinal Chemistry Research，2018，27（2）：470-475.

[30] ZHANG H， SU Y， WANG X， et al. Antidiabetic activity and chemical constituents of the aerial parts of Heracleum dissectum Ledeb［J］. Food Chem，2017，214：572-579.

基金资助

国家自然科学基金项目(81673564)

国家自然科学基金项目(81102382)

陕西省自然科学基金重点项目(2019JZ-01)

陕西省中医药管理局项目(2023-ZDYJSY-009)

陕西省中医药管理局项目(2021-ZZ-JC002)

西安市科技局医学研究重点项目(24YXYJ0018)

西安市科技局医学研究重点项目(24YXYJ0021)

西安市卫健委中医药科研项目(SJZZ202403)