鄂药挨姆末抗炎活性成分的研究

Study on the anti-inflammatory constituents of Oroqen herb Lonicera caerulea var. edulis

摘要

目的 探究鄂药挨姆末（Lonicera caerulea var.edulis）叶中的抗炎活性成分及其细胞毒作用。 方法 利用各种色谱技术对挨姆末叶的提取物进行分离和纯化，通过各种波谱技术结合理化性质鉴定化合物的结构，采用RAW264.7细胞模型评价这些化合物的抗炎活性和细胞毒作用。 结果 从挨姆末叶中共分离得到14个化合物，分别鉴定为原儿茶醛（1）、1-O-methyl-3，5-O-dicaffeoyl quinic acid methyl ester（2）、槲皮素-3-O-（6''-O-乙酰基）-β-d-葡萄糖苷（3）、绿原酸甲酯（4）、methyl-3、4-di-O-caffeoyl quinate（5）、dearabinosyl pneumonanthoside（6）、咖啡酸乙酯（7）、槲皮素-3-O-β-d-葡萄糖苷（8）、槲皮素-3-O-（-l-鼠李糖苷（9）、eucomegastigside B（10）、马钱子苷（11）、獐芽菜苷（12）、长寿花糖苷（13）、槲皮素-3-O-β-d-半乳糖基7-O-β-d-葡萄糖苷（14）。分离得到的14个化合物对RAW264.7细胞中一氧化氮的合成均有不同程度的抑制作用。 结论 除了化合物11~13外，其余11个化合物均为首次从该植物中分离得到。

Abstract

Objective To study the anti-inflammatory constituents of the leaves of Lonicera caerulea var. edulis and their cytotoxicity. Methods The extract of the leaves of L. caerulea was purified by various chromatographic methods. The structures were elucidated by detailed spectroscopic analysis based on physicochemical properties of the compounds. Inhibition on nitric oxide production in RAW264.7 cells was adopted to assay the anti-inflammatory activity of the isolated compounds and methyl thiazolyl tetrazolium （MTT） method was used to evaluate their cytotoxicity. Results Fourteen compounds were isolated and identified as dihydroxybenzaldehyde （1）， 1-O-methyl-3，5-O-dicaffeoyl quinic acid methyl ester （2）， quercetin-3-O-（6''-O-acetyl）-β-d-glucopyranoside （3）， methyl chlorogenate （4）， methyl-3，4-di-O-caffeoyl quinate （5）， dearabinosyl pneumonanthoside （6）， ethyl caffeate （7）， quercetin-3-O-β-d-glucopyranoside （8）， quercetin-3-O-α-l-rhamnopyranoside （9）， eucomegastigside B （10），loganin （11）， sweroside （12）， roseoside，（13）， and quercetin-3-O-β-d-galactopyranosyl-7-O-β-d-glucopyranoside （14）. These 14 compounds exhibited some anti-inflammatory activity by inhibiting NO production in RAW264.7 cells. Conclusion Apart from compounds 11-13， the other 11 compounds were isolated from the plant for the first time.

关键词

民族药 / 鄂药 / 挨姆末 / 抗炎 / 细胞毒

Key words

ethnic herbs / Oroqen herbs / Lonicera caerulea / anti-inflammation / cytotoxicity

鄂伦春民族药挨姆末（Lonicera caerulea var. edulis）为忍冬科忍冬属蓝靛果忍冬，别名羊奶子、黑瞎子果、狗奶子、甸果^［1-2］等。该植物为灌木，高0.5~1 m，主要分布在中国的东北、华北以及朝鲜、日本和俄罗斯的远东地区^［3］，果实为蓝黑色，富含花青素，是一种野生浆果，常用于制作果酒、饮料、果酱、果脯、果冻等。作为一种鄂伦春民族药，其果实、花、叶、枝、皮均可入药，有清热败火、利湿解毒的作用^［1］，常外敷用于治疗疮痈等^［3］。

目前对于挨姆末果实的化学成分已有较多研究^［4］，但对其叶中抗炎活性成分的研究还十分有限。本课题组前期对该植物叶的化学成分进行了初步的研究，从中分离鉴定了多种化学成分，结构类型包括三萜、生物碱、木脂素等^［5］。为进一步阐明该民族药中的抗炎成分，本课题组继续对挨姆末叶中的化学成分进行研究，并利用RAW264.7细胞筛选这些化合物的抗炎活性和细胞毒作用，以期从中发现高效低毒的抗炎先导化合物。

1 仪器与材料

1.1 仪器

PuriMaster 5000型半制备型高效液相色谱仪（上海科哲生物科技有限公司）；Megres C₁₈分析型色谱柱（5 μm，120 Å，250 mm×4.6 mm）、Megres C₁₈半制备型色谱柱（5 μm，120 Å，250 mm×10.0 mm），均购自江苏汉邦科技有限公司；AVANCE Ⅲ HD 600 MHz型核磁共振仪（德国Bruker公司）；WATERS Ⅰ-Class VION IMS QTof质谱仪（美国WATERS公司）；SuPerMax 3100型全波长多功能酶标仪（上海科哲生物科技有限公司）。

1.2 试药

甲醇、氯仿、二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯和正丁醇等实验所用试剂均为分析纯，均购自天津市大茂化学试剂厂；LPS（上海懋康生物科技有限公司）；DMEM高糖培养基、胎牛血清均购自美国赛默飞有限公司；青链双抗（北京兰杰柯科技有限公司）；MTT（北京索莱宝科技有限公司）；胰蛋白酶等其他试剂均购自阿拉丁公司。

蓝靛果忍冬叶于2020年采集于黑龙江省北安市通北，经西安交通大学药学院张海龙教授鉴定为植物蓝靛果忍冬（Lonicera caerulea var. edulis）的干燥叶，凭证标本（编号：LCE20200915）现保存于西安交通大学药学院。

1.3 细胞

小鼠RAW264.7细胞，购于中科院上海细胞库。

2 方法与结果

2.1 提取与分离

取14.0 g酸不溶乙酸乙酯层（共19.6 g），利用硅胶柱，以二氯甲烷-甲醇［CH₂Cl₂-MeOH 1∶0（0∶1）］为流动相进行梯度洗脱，得到25个流份（EA-1至EA-25）。利用硅胶柱，以CH₂Cl₂-MeOH（体积比分别为45∶1、30∶1、15∶1、5∶1、0∶1）为流动相对EA-13进行分离，得到14个流份（EA-13-1至EA-13-14）。利用硅胶柱，以CH₂Cl₂-MeOH（体积比80∶1）为流动相对EA-13-3进行分离，得到10个流份（EA-13-3-1至EA-13-3-10）。利用HPLC，以MeOH-H₂O（体积比30∶70）为流动相对EA-13-3-5进行分离纯化，在t_R=20.32 min处得到化合物1（1.5 mg）。利用ODS柱，以MeOH-H₂O （体积比10∶90~100∶0）为流动相对EA-15进行分离，得到13个流份（EA-15-1至EA-15-13）。利用硅胶柱，以CH₂Cl₂-MeOH（体积比分别为30∶1、20∶1、10∶1、0∶1）为流动相对EA-15-8进行分离，得到16个流份（EA-15-8-1至EA-15-8-16）。利用Sephadex LH-20凝胶柱，以MeOH为流动相对EA-15-8-6进行分离，得化合物2 （56.3 mg）。利用HPLC，以MeOH-H₂O （体积比40∶60）为流动相对EA-15-8-12进行分离纯化，在t_R=45.62 min处得到化合物3 （8.6 mg）。利用Sephadex LH-20凝胶柱，以MeOH为流动相对EA-15-10进行分离纯化，得到化合物4 （8.3 mg）。利用Sephadex LH-20凝胶柱，以MeOH为流动相对EA-15-6进行分离，得到化合物5 （4.6 mg）。

取25.0 g酸不溶正丁醇层萃取物，利用ODS柱，以MeOH-H₂O （体积比10∶90~100∶0）为流动相进行分离，得到14个流份（Bu-1至Bu-14）。利用硅胶柱，以CH₂Cl₂-MeOH （体积比分别为25∶1、15∶1、5∶1、0∶1）为流动相对Bu-8进行分离，得到9个流份（Bu-8-1至Bu-8-9）。利用硅胶柱，以CH₂Cl₂-MeOH（体积比25∶1、15∶1、5∶1、0∶1）为流动相对Bu-8-4进行分离，得到9个流份（Bu-8-4-1至Bu-8-4-9）。利用HPLC，以MeOH-H₂O （体积比35∶65）为流动相对Bu-8-4-3进行分离和纯化，在t_R=53.18 min处得化合物6（5.7 mg）。利用硅胶柱，以CH₂Cl₂-MeOH （体积比分别为30∶1、20∶1、10∶1、5∶1、0∶1）为流动相对Bu-9进行分离，得到14个流份（Bu-9-1至Bu-9-14）。利用HPLC，以MeOH-H₂O（体积比43∶57）为流动相对Bu-9-6进行分离纯化，在t_R=43.29 min处得化合物7 （2.6 mg）。利用ODS柱，以MeOH-H₂O （体积比35∶65~100∶0）为流动相对Bu-9-8进行分离，得到12个流份（Bu-9-8-1至Bu-9-8-12）。利用HPLC，以MeOH-H₂O （体积比45∶55）为流动相对Bu-9-8-6进行分离纯化，在t_R=37.53和46.15 min处分别得化合物8 （4.6 mg）和化合物9 （2.5 mg）。利用Sephadex LH-20凝胶柱，以MeOH为流动相对Bu-10进行分离，得到3个流份（Bu-10-1至Bu-10-3）。利用HPLC，以MeOH-H₂O（体积比40∶60）为流动相对Bu-10-3进行分离纯化，在t_R=45.10 min处得化合物10 （2.6 mg）。利用ODS柱，以MeOH-H₂O （体积比10∶90~100∶0）为流动相对Bu-5进行分离，得到15个流份（Bu-5-1至Bu-5-15）。利用硅胶柱，以CH₂Cl₂-MeOH （体积比10∶1）为流动相对Bu-5-4进行分离，得化合物11 （50.6 mg）。利用Sephadex LH-20凝胶柱，以MeOH为流动相对Bu-5-7进行分离，得到4个流份（Bu-5-7-1至Bu-5-7-4）。对Bu-5-7-4进行纯化后得化合物12 （45.3 mg）。Bu-5-7-2经PTLC （CH₂Cl₂-MeOH 8∶1）纯化后得到化合物13 （2.0 mg）。利用HPLC，以MeOH-H₂O（体积比36∶64）为流动相对Bu-5-8进行分离纯化，在t_R=35.43 min处得化合物14 （6.1 mg）。

2.2 结构鉴定

2.2.1 化合物1

黄色针晶，易溶于MeOH，质谱显示相对分子质量为138.1，分子式为C₇H₆O₃。¹H-NMR （600 MHz，CD₃OD）： δ_H 6.89 （1H，d，J=7.8 Hz，H-5），7.30 （2H，m，H-2，6），9.67 （1H，s，H-7）.¹³C-NMR （150 MHz，CD₃OD）：δ_C 124.6 （C-1），114.6（C-2），146.2 （C-3），152.5 （C-4），116.0（C-5），130.1 （C-6），191.3 （C-7）。将该数据与文献中的数据^［6］进行比对，确定该化合物为原儿茶醛。

2.2.2 化合物2

黄色粉末，易溶于MeOH，质谱显示相对分子质量为544.5，分子式为C₂₇H₂₈O₁₂。¹H-NMR （600 MHz， CD₃OD）： δ_H 7.62 （1H， d， J=15.6 Hz， H-3'）， 3.70 （3H， s， H₃-9）， 7.55 （1H， d， J=15.6 Hz， H-3''）， 6.35 （1H， d， J=15.6 Hz， H-2'）， 7.07 （2H， br s， H-5'， 5''）， 6.97 （2H， m， H-9'， 9''）， 6.80 （2H， t， J=7.2 Hz， H-8'， 8''）， 6.23 （1H， d， J=15.6 Hz， H-2''）， 5.41 （1H， m， H-5）， 5.33 （1H， m， H-3）， 4.00 （1H， m， H-4）， 3.35 （3H， s， H₃-7）， 2.33 （2H， m， H₂-6）， 2.18 （2H， m， H₂-2）. ¹³C-NMR （150 MHz， CD₃OD）： δ_C 175.7 （C-8）， 168.8 （C-1'）， 149.7 （C-7''）， 168.1 （C-1''）， 149.4 （C-7'）， 147.5 （C-3''）， 147.2 （C-3'）， 146.7 （C-6'）， 146.7 （C-6''）， 127.8 （C-4'）， 127.5 （C-4''）， 123.1 （C-9'）， 123.1 （C-9''）， 116.6 （C-8''）， 116.5 （C-8'）， 115.3 （C-2'）， 115.2 （C-5'）， 115.2 （C-5''）， 114.8 （C-2''）， 74.6 （C-1）， 72.1 （C-3）， 72.0 （C-5）， 69.7 （C-4）， 53.1 （C-9）， 49.9 （C-7）， 36.7 （C-6）， 35.6 （C-2）。将该数据与文献^［7］中的数据进行比对，确定该化合物为1-O-methyl-3，5-O-dicaffeoyl quinic acid methyl ester。

2.2.3 化合物3

黄色油状物，易溶于MeOH，质谱显示相对分子质量为506.4，分子式为C₂₃H₂₂O₁₃。¹H-NMR （600 MHz， CD₃OD）： δ_H 4.04 （1H， dd， J=11.4， 5.4 Hz， H-6''b）， 7.62 （1H， s， H-2'）， 6.21 （1H， s， H-6）， 7.58 （1H， d， J=8.4 Hz， H-6'）， 5.14 （1H， d， J=7.8 Hz， H-1''）， 6.84 （1H， d， J=8.4 Hz， H-5'）， 3.50~3.33 （4H， m， H-2''， 3''， 4''， 5''）， 6.40 （1H， s， H-8）， 1.84 （3H， s， Me von OAc）， 4.18 （1H， dd， J=12.0， 2.4 Hz， H-6''a）. ¹³C-NMR （150 MHz， CD₃OD）： δ_C 179.4 （C-4）， 172.7 （-COO-）， 166.3 （C-7）， 163.0 （C-5）， 159.4 （C-2）， 158.5 （C-9）， 149.8 （C-4'）， 145.9 （C-3'）， 135.4 （C-3）， 123.3 （C-6'）， 123.1 （C-1'）， 117.4 （C-2'）， 115.8 （C-5'）， 105.5 （C-10）， 104.3 （C-1''）， 100.0 （C-6）， 94.8 （C-8）， 77.9 （C-3''）， 75.6 （C-2''）， 75.5 （C-5''）， 71.3 （C-4''）， 64.2 （C-6''）， 20.5 （CH₃-）。将该数据与文献^［8］中的数据进行比对，确定该化合物为槲皮素-3-O-（6''-O-乙酰基）-β-d-葡萄糖苷。

2.2.4 化合物4

白色粉末，易溶于MeOH，质谱显示相对分子质量为368.3，分子式为C₁₇H₂₀O₉。¹H-NMR （600 MHz， CD₃OD）： δ_H 2.23~2.13 （3H， m， H₂-6， H-2a）， 7.52 （1H， d， J=16.2 Hz， H-7'）， 7.04 （1H， d， J=2.4 Hz， H-2'）， 5.27 （1H， m， H-3）， 6.95 （1H， dd， J=7.8， 1.8 Hz， H-6'）， 6.78 （1H， d， J=8.4 Hz， H-5'）， 6.21 （1H， d， J=16.2 Hz， H-8'）， 4.13 （1H， m， H-5）， 3.73 （1H， m， H-4）， 3.69 （3H， s， H₃-8）， 2.01 （1H， m， H-2b）. ¹³C-NMR （150 MHz， CD₃OD）： δ_C 175.4 （C-7）， 168.3 （C-9'）， 149.7 （C-4'）， 147.2 （C-7）， 146.9 （C-3'）， 127.6 （C-1'）， 123.0 （C-6'）， 116.5 （C-5'）， 115.1 （C-2'）， 115.0 （C-8'）， 75.8 （C-1）， 72.5 （C-4）， 72.1 （C-3）， 70.3 （C-5）， 53.0 （C-8）， 38.0 （C-6）， 37.7 （C-2）。将该数据与文献^［9］中的数据进行比对，确定该化合物为绿原酸甲酯。

2.2.5 化合物5

黄色粉末，易溶于DMSO，质谱显示相对分子质量为530.5，分子式为C₂₆H₂₆O₁₂。¹H-NMR （600 MHz， DMSO-d₆）： δ_H 7.50 （1H， d， J=16.2 Hz， H-3''）， 7.41 （1H， d， J=16.2 Hz， H-3'）， 7.03 （2H， dd， J=10.2， 2.4 Hz， H-5'， 5''）， 6.98 （2H， m， H-9'， 9''）， 6.75 （2H， m， H-8'， 8''）， 6.12 （1H， d， J=15.6 Hz， H-2'）， 5.25 （1H， m， H-3）， 4.96 （1H， m， H-4）， 6.26 （1H， d， J=15.6 Hz， H-2''）， 4.13 （1H， m， H-5）， 3.59 （3H， s， H₃-8）， 2.24 （2H， m， H₂-2）， 1.98 （1H， m， H-6a）， 1.88 （1H， m， H-6b）. ¹³C-NMR （150 MHz， DMSO-d₆）： δ_C 173.4 （C-7）， 165.9 （C-1''）， 165.2 （C-1'）， 148.7 （C-7''）， 148.6 （C-7'）， 145.8 （C-3''）， 145.7 （C-3'）， 145.6 （C-6''）， 145.6 （C-6'）， 125.4 （C-4''）， 125.2 （C-4'）， 121.5 （C-9''）， 121.4 （C-9'）， 115.8 （C-8''）， 115.8 （C-8'）， 114.9 （C-5''）， 114.7 （C-5'）， 113.8 （C-2''）， 113.2 （C-2'）， 73.0 （C-1）， 71.9 （C-4）， 67.8 （C-3）， 65.2 （C-5）， 52.0 （C-8）， 37.7 （C-2）， 36.0 （C-6）。将该数据与文献^［10］中的数据进行比对，确定该化合物为methyl-3，4-di-O-caffeoyl quinate。

2.2.6 化合物6

黄色油状物，易溶于MeOH，质谱显示相对分子质量为370.4，分子式为C₁₉H₃₀O₇。¹H-NMR （600 MHz， CD₃OD）： δ_H 5.88 （1H， br s， H-4）， 5.78 （1H， dd， J=15.0， 6.6 Hz， H-8）， 5.65 （1H， dd， J=15.6， 9.6 Hz， H-7）， 4.40 （1H， m， H-9）， 4.35 （1H， d， J=7.8 Hz， H-1'）， 3.82 （1H， dd， J=12.0， 2.4 Hz， H-6'a）， 3.66 （1H， dd， J=12.0， 5.4 Hz， H-6'b）， 3.34 （1H， t， J=9.0 Hz， H-3'）， 3.29 （1H， m， H-4'）， 3.21 （1H， m， H-5'）， 3.17 （1H， m， H-2'）， 1.03 （3H， s， H-11）， 2.68 （1H， d， J=9.0 Hz， H-6）， 2.43 （1H， d， J=16.8 Hz， H-2a）， 1.01 （3H， s， H-12）， 2.05 （1H， d， J=16.8 Hz， H-2b）， 1.94 （3H， d， J=1.8 Hz， H-13）， 1.29 （3H， d， J=6.6 Hz， H-10）. ¹³C-NMR （150 MHz， CD₃OD）： δ_C 202.1 （C-3）， 165.9 （C-5）， 138.2 （C-8）， 128.8 （C-7）， 126.1 （C-4）， 102.4 （C-1'）， 78.1 （C-3'）， 78.0 （C-5'）， 75.3 （C-2'）， 71.5 （C-4'）， 62.7 （C-6'）， 56.8 （C-6）， 48.3 （C-2）， 37.1 （C-1）， 28.0 （C-12）， 27.6 （C-11）， 23.8 （C-13）， 21.0 （C-10）。将该数据与文献^［11］中的数据进行比对，确定该化合物为dearabinosyl pneumonanthoside。

2.2.7 化合物7

褐色粉末，易溶于MeOH，质谱显示相对分子质量为208.2，分子式为C₁₁H₁₂O₄。¹H-NMR （600 MHz， CD₃OD）： δ_H 4.21 （2H， dd， J=13.8， 6.6 Hz， H-1'）， 6.23 （1H， d， J=15.6 Hz， H-8）， 7.53 （1H， d， J=15.6 Hz， H-7）， 1.31 （3H， t， J=7.2 Hz， H-2'）， 6.93 （1H， d， J=7.8 Hz， H-6）， 7.03 （1H， s， H-2）， 6.76 （1H， d， J=7.8 Hz， H-5）. ¹³C-NMR （150 MHz， CD₃OD）： δ_C 169.2 （C⁃9）， 149.6 （C⁃4）， 146.7 （C⁃1， 3）， 127.6 （C⁃2）， 122.9 （C⁃5）， 116.6 （C⁃6）， 115.3 （C⁃7）， 115.1 （C⁃8）， 61.3 （ C⁃1'）， 14.6 （C⁃2'）_。将该数据与文献^［12］中的数据进行比对，确定该化合物为咖啡酸乙酯。

2.2.8 化合物8

黄色粉末，易溶于MeOH，质谱显示相对分子质量为464.4，分子式为C₂₁H₂₀O₁₂。¹H-NMR （600 MHz， CD₃OD）： δ_H 3.43 （1H， t， J=9.0 Hz， H-4''）， 6.18 （1H， d， J=1.8 Hz， H-6）， 7.71 （1H， d， J=1.8 Hz， H-2'）， 3.35 （1H， t， J=10.2 Hz， H-2''）， 6.86 （1H， d， J=9.0 Hz， H-5'）， 5.22 （1H， d， J = 7.8 Hz， H-1''）， 7.58 （1H， dd， J=8.4， 1.8 Hz， H-6'）， 6.36 （1H， s， H-8）， 3.71 （1H， dd， J=12.0， 2.4 Hz， H-6''a）， 3.58 （1H， dd， J=11.4， 4.8 Hz， H-6''b）， 3.48 （1H， m， H-3''）， 3.22 （1H， m， H-5''）. ¹³C-NMR （150 MHz， CD₃OD）： δ_C 179.3 （C-4）， 167.5 （C-7）， 162.9 （C-5）， 158.8 （C-9）， 158.6 （C-2）， 149.9 （C-4'）， 145.9 （C-3'）， 135.6 （C-3）， 123.2 （C-6'）， 123.1 （C-1'）， 117.5 （C-5'）， 116.0 （C-2'）， 105.3 （C-10）， 104.4 （C-1''）， 100.4 （C-6）， 95.0 （C-8）， 78.4 （C-5''）， 78.1 （C-3''）， 75.7 （C-2''）， 71.2 （C-4''）， 62.5 （C-6''）。将该数据与文献^［13］中的数据进行比对，确定该化合物为槲皮素-3-O-β-d-葡萄糖苷。

2.2.9 化合物9

黄色粉末，易溶于DMSO，质谱显示相对分子质量为448.4，分子式为C₂₁H₂₀O₁₁。¹H-NMR （600 MHz， DMSO-d₆）： δ_H 7.25 （1H， s， H-2'）， 7.22 （1H， d， J=9.0 Hz， H-6'）， 6.79 （1H， d， J=7.8 Hz， H-5'）， 6.16 （1H， s， H-8）， 5.99 （1H， s， H-6）， 5.25 （1H， s， H-1''）， 0.81 （3H， d， J=6.0 Hz， H₃-6''）. ¹³C-NMR （150 MHz， DMSO-d₆）： δ_C 179.4 （C-4）， 165.8（C-7）， 163.1 （C-5）， 159.1 （C-2）， 158.1 （C-9）， 149.5 （C-4'）， 146.6 （C-3'）， 136.3（C-3）， 122.6 （C-1'）， 122.5 （C-6'）， 116.7 （C-2'）， 116.5 （C-5'）， 105.7 （C-10）， 103.3 （C-1''）， 99.5 （C-6）， 94.6 （C-8）， 73.6 （C-4''）， 72.3（C-3''）， 72.2 （C-2''）， 71.7 （C-5''）， 17.6 （C-6''）。将该数据与文献^［14］中的数据进行比对，确定该化合物为槲皮素-3-O-α-l-鼠李糖苷。

2.2.10 化合物10

黄色油状物，易溶于MeOH，质谱显示相对分子质量为502.6，分子式为C₂₄H₃₈O₁₁。¹H-NMR （600 MHz， CD₃OD）： δ_H 3.86 （1H， dd， J=12.6， 3.0 Hz， H-5''a）， 5.89 （1H， s， H-4）， 5.65 （1H， dd， J=15.6， 9.0 Hz， H-8）， 4.39 （1H， m， H-9）， 3.80 （1H， m， H-4''）， 4.35 （1H， d， J=7.8 Hz， H-1'）， 1.29 （3H， d， J=6.6 Hz， H₃-10）， 4.27 （1H， d， J=7.2 Hz， H-1''）， 2.43 （1H， d， J=16.8 Hz， H-2a）， 5.76 （1H， dd， J=15.6， 6.6 Hz， H-7）， 1.04 （3H， s， H₃-12）， 4.05 （1H， dd， J=11.4， 1.8 Hz， H-6'a）， 1.01 （3H， s， H₃-11）， 3.70 （1H， m， H-6'b）， 3.59 （1H， m， H-3''）， 3.52 （2H， m， H-2''， 5''b）， 3.38~3.32 （3H， m， H-3'， 4'， 5'）， 3.18 （1H， t， J=7.8 Hz， H-2'）， 2.05 （1H， d， J=16.8 Hz， H-2b）， 1.94 （3H， d， J=1.8 Hz， H₃-13）， 2.69 （1H， d， J=9.0 Hz， H-6）. ¹³C-NMR （150 MHz， CD₃OD）： δ_C 202.1 （C-3）， 166.0 （C-5）， 138.1 （C-8）， 129.0 （C-7）， 126.2 （C-4）， 105.2 （C-1''）， 102.6 （C-1'）， 77.9 （C-3'）， 77.1 （C-9）， 76.8 （C-5'）， 75.2 （C-2'）， 74.2 （C-2''）， 72.3 （C-3''）， 71.4 （C-4'）， 69.5 （C-6'）， 69.3 （C-4''）， 66.7 （C-5''）， 56.7 （C-6）， 48.3 （C-2）， 37.2 （C-1）， 28.1 （C-12）， 27.6 （C-11）， 23.8 （C-13）， 21.1 （C-10）。将该数据与文献^［15］中的数据进行比对，确定该化合物为eucomegastigside B。

2.2.11 化合物11

无色针晶，易溶于H₂O，质谱显示相对分子质量为390.4，分子式为C₁₇H₂₆O₁₀。¹H-NMR （600 MHz， D₂O）： δ_H 1.75 （1H， m， H-6a）， 7.42 （1H， s， H-3）， 3.92 （1H， dd， J=12.6， 2.4 Hz， H-6'a）， 5.40 （1H， d， J=3.6 Hz， H-1）， 1.91 （1H， m， H-8）， 4.14 （1H， m，H-7）， 3.73 （3H， s， H₃-12）， 3.49 （2H， m， H-5'， 6'b）， 2.18 （1H， m， H-9）， 2.12 （1H， m， H-6b）， 3.39 （1H， t， J=9.6 Hz， H-3'）， 3.28 （1H，m， H-2'）， 3.07 （1H， dd， J=16.2， 8.4 Hz， H-5）， 1.06 （3H， d， J=7.2 Hz， H₃-10）. ¹³C-NMR （150 MHz， D₂O）： δ_C 170.1 （C-11）， 150.8 （C-3）， 113.1 （C-4）， 98.5 （C-1'）， 96.6 （C-1）， 76.3 （C-5'）， 75.6 （C-3'）， 74.3 （C-7）， 72.6 （C-2'）， 69.5 （C-4'）， 60.6 （C-6'）， 51.7 （C-12）， 44.9 （C-9）， 40.2 （C-6）， 40.0 （C-8）， 29.7 （C-5）， 11.9 （C-10）。将该数据与文献^［16］中的数据进行比对，确定该化合物为马钱子苷。

2.2.12 化合物12

白色粉末，易溶于MeOH，质谱显示相对分子质量为358.3，分子式为C₁₆H₂₂O₉。¹H-NMR （600 MHz， CD₃OD）： δ_H 3.28 （1H， m， H-2'）， 7.60 （1H， d， J=2.4 Hz， H-3）， 5.33~5.27 （2H， m， H₂-10）， 4.69 （1H， d， J=7.8 Hz， H-1'）， 5.58~5.52 （2H， m， H-1， 8），4.46 （1H， m， H-7a）， 4.37 （1H， m， H-7b）， 3.35 （2H， s， H-3'， 5'）， 3.90 （1H， dd， J=12.0， 1.2 Hz， H-6'a）， 3.67 （1H， dd， J=12.0， 6.0 Hz， H-6'b）， 1.78 （1H， m， H-6a）， 3.38 （1H， t， J=9.0 Hz， H-5）， 2.71 （1H， m， H-9）， 1.71 （1H， m， H-6b）. ¹³C-NMR （150 MHz， CD₃OD）： δ_C 168.5 （C-11）， 153.9 （C-3）， 133.3 （C-8）， 120.8 （C-10）， 106.0 （C-4）， 99.7 （C-1'）， 97.9 （C-1）， 78.3 （C-3'）， 77.8 （C-5'）， 74.7 （C-2'）， 71.5 （C-4'）， 69.7 （C-7）， 62.6 （C-6'）， 43.8 （C-9）， 28.4 （C-5）， 25.9 （C-6）。将该数据与文献^［17］中的数据进行比对，确定该化合物为獐芽菜苷。

2.2.13 化合物13

白色粉末，易溶于MeOH，质谱显示相对分子质量为386.4，分子式为C₁₉H₃₀O₈。¹H-NMR （600 MHz， CD₃OD）： δ_H 5.87~5.85 （3H， m， H-4， 7， 8）， 1.92 （3H， d， J=1.8 Hz， H₃-13）， 4.42 （1H， m， H-9）， 2.52 （1H， d， J=16.8 Hz， H-2a）， 4.34 （1H， d， J=7.8 Hz， H-1'）， 2.15 （1H， d， J= 16.8 Hz， H-2b）， 1.30 （3H， m， H₃-10）， 1.04 （6H， d， J=3.0 Hz， H₃-11， 12）. ¹³C-NMR （150 MHz， CD₃OD）： δ_C 75.3 （C-2'）， 201.2 （C-3）， 135.3 （C-8）， 167.3 （C-5）， 131.5 （C-7）， 102.7 （C-1'）， 80.0 （C-6）， 127.2 （C-4）， 78.1 （C-9）， 78.1 （C-3'）， 77.3 （C-5'）， 71.7 （C-4'）， 62.8 （C-6'）， 50.7 （C-2）， 42.4 （C-1）， 24.7 （C-12）， 23.4 （C-11）， 21.2 （C-10）， 19.5 （C-13）。将该数据与文献^［18］中的数据进行比对，确定该化合物为长寿花糖苷。

2.2.14 化合物14

黄色粉末，易溶于DMSO，质谱显示相对分子质量为626.5，分子式为C₂₇H₃₀O₁₇。¹H-NMR （600 MHz， DMSO-d₆）： δ_H 12.65 （1H， s， 5-OH）， 9.79 （1H， s， 3'-OH）， 7.60 （1H， d， J= 2.4 Hz， H-6'）， 6.75 （1H， d， J=2.4 Hz， H-8）， 7.57 （1H， dd， J=8.4， 2.4 Hz， H-2'）， 6.86 （1H， d， J=8.4 Hz， H-5'）， 9.22 （1H， s， 4'-OH）， 6.43 （1H， d， J = 2.4 Hz， H-6）， 5.49 （1H， d， J=7.8 Hz， Gal-1''）， 5.40 （1H， d， J=4.8 Hz， Glc-1'''）. ¹³C-NMR （150 MHz， DMSO-d₆）： δ_C 177.6 （C-4）， 162.8 （C-5）， 160.9 （C-7）， 156.8 （C-2）， 156.0 （C-9）， 148.6 （C-4'）， 144.8 （C-3'）， 133.6 （C-3）， 121.7 （C-6'）， 121.1 （C-1'）， 116.5 （C-5'）， 115.2 （C-2'）， 105.6 （C-10）， 100.7 （C-1''）， 99.7 （C-6）， 99.3 （C-1'''）， 94.3 （C-8）， 77.6 （C-5'''）， 76.5 （C-3'''）， 76.4 （C-5''）， 74.1 （C-2'''）， 73.1 （C-3''）， 70.0 （C-2''）， 69.6 （C-4'''）， 61.0 （C-6'''）， 60.6 （C-6''）。将该数据与文献^［19］中的数据进行比对，确定该化合物为槲皮素-3-O-β-d-半乳糖基-7-O-β-d-葡萄糖苷。

2.3 体外抗炎活性的研究

在96孔板中加入RAW264.7细胞悬液100 μL（2×10⁴个·孔^-1），在37 ℃、5% CO₂培养箱中培养24 h。待细胞贴壁后，弃去培养基，给药组加入100 μL含有终浓度为100 mol·L^-1样品的新鲜培养基，对照组和正常组加入100 μL DMEM完全培养基，每组设3个复孔，培养1 h后向每孔中加入20 μL LPS（10 g·mL^-1），继续培养24 h，吸取50 μL细胞上清液，加入50 μL Griess试剂A液，在37 ℃下振荡孵育10 min，再加入50 μL Griess试剂B液，继续振荡孵育20 min，测定570 nm处的吸光度值，计算抑制率。

2.4 细胞毒作用

将RAW264.7细胞悬液接种于96孔板中，细胞密度为2×10⁵个·孔^-1，在37 ℃、5% CO₂的培养箱中孵育24 h后，将含有100 mol·L^-1终浓度样品的新鲜培养基加入每孔，每组样品设置3个复孔，继续培养24 h后，向每孔中加入20 μL质量浓度为5 mg·mL^-1的MTT溶液，继续培养4 h后，弃去培养液，加入150 μL DMSO，振荡溶解后，检测490 nm处的吸光度值，计算抑制率。

活性测定结果表明，这14个化合物对RAW264.7细胞中一氧化氮（nitric oxide， NO）的产生均有不同程度的抑制作用，尤其是化合物2和5，在浓度为100 mol·L^-1时对NO的抑制率分别为（43.2%±3.2%）（P<0.01）和（36.6%±3.8%）（P<0.01），同时在此浓度下并未显示细胞毒作用。另外，尽管化合物9和14也显示出一定的NO抑制活性［抑制率分别为（36.3%±2.1%）和（31.1%±0.4%）］，但可能是由于其细胞毒作用引起（见表1）。除了化合物9和14在浓度为100 mol·L^-1时显示出轻微的细胞毒作用，其他化合物均无细胞毒作用（见表1）。

3 讨论

民族药是我国各少数民族人民在长期与疾病斗争的过程中总结的智慧结晶，除了传统的四大民族药外，其他少数民族医药也有自己的地域特色，如生活在寒冷地区的鄂伦春族人民常用的民族药很多是用于治疗与风湿寒冷疾病或外伤等的相关药物，大多具有抗炎作用。近年来，本课题组对几种少数民族药进行了一系列的研究^［20-25］，阐明了其主要化学成分和药理活性，为这些民族药的民间应用提供了科学依据，也为继承和发扬民族药奠定了理论基础。

挨姆末作为一种鄂伦春特色民族药，具有清热解毒的功效，但对其药用部位叶中化学成分和生物活性的研究较少。本研究在前期研究的基础上进一步对其抗炎活性成分进行研究，从进一步分离得到的化合物类型来看，主要有黄酮、环烯醚萜以及苯丙素等，这些化合物都具有不同程度的体外抗炎作用，这为进一步的体内活性测试和深入研究奠定了基础。

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基金资助

国家自然科学基金项目(81673564)

国家自然科学基金项目(81102382)

陕西省自然科学基金重点项目(2019JZ-01)

陕西省中医药管理局项目(2023-ZDYJSY-009)

西安市科技局医学研究重点项目(24YXYJ0018)

西安市科技局医学研究重点项目(24YXYJ0021)

西安市卫健委中医药科研项目(SJZZ202403)