甘草甜素通过核因子- κ B/核苷酸结合寡聚结构域样受体蛋白3/白细胞介素-1 β 信号通路对慢性牙周炎大鼠牙周组织损伤的影响

Effects of glycyrrhizin on periodontal tissue damage in rats with chronic periodontitis via the nuclear factor- κ B/nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3/interleukin-1 β pathway

摘要

目的 探究甘草甜素（glycyrrhizin，GL）通过调节核因子-κB（nuclear factor-κB， NF-κB）/核苷酸结合寡聚结构域样受体蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3， NLRP3）/白细胞介素（interleukin， IL）-1β信号通路对慢性牙周炎（chronic periodontitis， CP）大鼠牙周组织损伤的影响。 方法 取部分大鼠经牙龈卟啉单胞菌感染建立模型，将建模成功的60只大鼠随机分为模型组、低剂量GL（low-dose GL， L-GL）组、中剂量GL（medium-dose GL， M-GL）组、高剂量GL（high-dose GL， H-GL）组（低、中、高剂量组分别静脉注射2、4、10 mg·kg^-1 GL）、通路激活剂组（静脉注射0.5 mg·kg^-1 NF-κB/NLRP3/IL-1β通路激活剂CHPG），每组12只；另随机选取12只大鼠作为对照组；其中对照组和模型组静脉注射等量生理盐水，每日1次，持续20 d。采用探针测定牙周探诊深度（probing depth， PD）；观察牙齿活动度（tooth mobility， TM）；评估出血指数（bleeding index， BI）；通过碱性品红染色法测定菌斑指数（plaque index， PLI）；通过酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay， ELISA）检测血清中IL-1β、IL-6、干扰素-γ（interferon-γ， IFN-γ）水平；显微计算机断层扫描（micro computed tomography， Micro-CT）分析牙槽骨吸收情况；采用苏木精-伊红（hematoxylin-eosin， HE）染色和抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase， TRAP）染色观察牙周组织的病理学变化及破骨细胞数量；采用免疫组织化学技术（immunohistochemistry， IHC）和蛋白印迹法（Western blotting）检测牙周组织中NF-κB、NLRP3、IL-1β蛋白的阳性率及表达水平。 结果 模型组大鼠出现上皮破裂及大量炎症细胞浸润，提示建模成功；与对照组比较，模型组的IL-1β、IFN-γ、IL-6、PD、TM、BI、PLI、牙骨质-釉质交界（cemento-enamel junction， CEJ）、CEJ到牙槽骨顶（alveolar ridge， ABC）的距离（CEJ-ABC）值、破骨细胞数量，以及NF-κB、NLRP3、IL-1β蛋白的阳性率和表达水平均显著升高（P<0.05）；与模型组比较，L-GL组、M-GL组、H-GL组的牙周组织损伤得到改善，上述指标均显著降低（P<0.05）；通路激活剂则可逆转GL的处理效果。 结论 GL可能通过抑制NF-κB/NLRP3/IL-1β通路改善CP大鼠的牙周组织损伤，且该作用呈浓度依赖性。

Abstract

Objective To determine whether glycyrrhizin （GL） alleviates periodontal tissue damage in rats with chronic periodontitis （CP） by modulating the nuclear factor-κB （NF-κB）/nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3 （NLRP3）/interleukin-1β （IL-1β） signaling pathway. Methods Twelve healthy rats served as the control group. Sixty CP rats， induced by Porphyromonas gingivalis， were randomly allocated to 5 groups （n=12）： model （saline）， low-dose GL （2 mg·kg^-1）， medium-dose GL （4 mg·kg^-1）， high-dose GL （10 mg·kg^-1）， and pathway activator （0.5 mg·kg^-1 CHPG）. All agents were administered intravenously once daily for 20 days. Periodontal probing depth （PD）， tooth mobility （TM）， bleeding index （BI）， and plaque index （PLI） were recorded. Enzyme linked immunosorbent assay （ELISA） was used to quantify the serum IL-1β， IFN-γ， and IL-6. Micro computed tomography （Micro-CT） was used to assess alveolar bone loss； Hematoxylin-eosin （HE） staining and tartrate resistant acid phosphatase （TRAP） staining was used to evaluate periodontal histopathology and osteoclast counts. Immunohistochemistry （IHC） and Western blot were employed to measure the levels of NF-κB， NLRP3， and IL-1β protein. Results CP rats exhibited epithelial disruption， marked inflammatory infiltration，and elevated PD， TM， BI， PLI， CEJ-ABC， osteoclast counts， IL-1β， IFN-γ， IL-6， and NF-κB/NLRP3/IL-1β expression versus controls （P<0.05）. Low-， medium-， and high-dose GL progressively ameliorated periodontal tissue damage， reduced PD， TM， BI， PLI， CEJ-ABC， osteoclast numbers， and inflammatory mediators， and down-regulated NF-κB/NLRP3/IL-1β proteins （P<0.05）. CHPG reversed these benefits. High-dose GL produced the most pronounced improvements. Conclusion Glycyrrhizin attenuates CP-related periodontal destruction in a dose-dependent manner by inhibiting the NF-κB/NLRP3/IL-1β axis， suggesting a promising therapeutic strategy for chronic periodontitis.

Graphical abstract

关键词

甘草甜素 / 慢性牙周炎 / 核因子-κB/核苷酸结合寡聚结构域样受体蛋白3/白细胞介素-1β信号通路 / 牙周组织损伤 / 炎症

Key words

glycyrrhizin / chronic periodontitis / clear factor-κB/nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein3/interleukin-1β （NF-κB/NLRP3/IL-1β） pathway / periodontal tissue injury / inflammation

慢性牙周炎是发生在牙周组织的一种慢性破坏性进行性疾病，是导致成年人牙齿损伤及缺失的主要原因^［1］。随着牙周炎的进展，患者可出现牙齿松动、移位甚至脱落等症状，这些症状不仅严重影响患者的咀嚼功能、发音及口腔健康，还对其生活质量造成不良影响，甚至导致牙齿丧失功能。目前临床常用的治疗方法虽能控制炎症进展并阻止牙槽骨进一步吸收，但无法有效缓解牙髓组织损伤。

甘草甜素（glycyrrhizin，GL）已被证实有抗炎、抗病毒、抗氧化及抗癌等多种生物活性，能够降低炎症因子的表达，缓解炎症症状，改善线粒体损伤与肝损伤，并可显著降低牙髓组织中破骨细胞及中性粒细胞的数量^［2-4］。核因子-κB（nuclear factor-κB， NF-κB）作为炎症反应的关键介质，可被核苷酸结合寡聚结构域样受体蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3， NLRP3）激活，进而上调白细胞介素（interleukin，IL）-1β的表达。通过抑制NF-κB/NLRP3/IL-1β信号通路，可改善肠上皮屏障损伤、减轻败血支原体感染后的肺损伤，减少牙槽骨吸收及破骨细胞数量，并降低牙龈组织中炎症因子的产生，从而减轻炎症症状^［5-7］。

然而，目前关于GL是否可通过调控NF-κB/NLRP3/IL-1β通路对慢性牙周炎（chronic periodontitis，CP）大鼠牙周组织损伤产生影响尚未阐明。因此，本研究旨在通过分析GL对CP大鼠牙周组织损伤的影响，探讨其潜在的作用机制。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Leitz Optilux型光学显微镜（德国徕卡公司）；Multiskan SkyHigh型生物酶标仪（美国赛默飞世尔科技公司）；ChemiDoc化学发光成像仪（美国BIORAD公司）。

1.2 试药

牙龈卟啉单胞菌（批号JC-CC0166，上海机纯实业有限公司）；NLRP3（批号GTX00763）、β-肌动蛋白（β-actin，批号GTX629630），均购自美国GeneTex公司；山羊抗鼠免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）H&L（批号ab6708）、山羊抗兔IgG H&L（批号ab6702）、NF-κB（批号ab220803）、IL-1β（批号ab283818），均购自美国Abcam公司；激活剂CHPG（批号HY-101364，美国MCE公司）；IL-1β（批号ml037361）、干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ，批号ml027464）、IL-6酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（批号ml102828），均购自上海酶联生物科技有限公司；苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色试剂盒（批号C0105M）、抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）染色试剂盒（批号P0332），均购自上海碧云天生物技术股份有限公司。

1.3 实验动物

80只斯泼累格·多雷（Sprague Dawley，SD）大鼠，7~8周龄，体质量为220~240 g，购自上海鸣科医疗科技有限公司，生产许可证号为SYXK（沪）2023-0051。在温度为（23±2） ℃，相对湿度为（55%±5%），12 h光/暗循环的环境中饲养1周。本实验经动物伦理委员会审核、批准。

2 方法

2.1 造模、分组

从饲养的大鼠中随机选取12只作为对照组，其余68只大鼠采用牙龈卟啉单胞菌液感染法建立牙周炎模型^［8］。建模方法：通过腹腔注射体积分数10%的氯醛水合物（4 mL·kg^-1）麻醉大鼠，用浸泡过牙龈卟啉单胞菌液（菌悬液浓度调整至1×10⁷ CFU）的缝合线结扎上颌第一和第二磨牙牙龈下部，每2 d接种1次，连续接种3次。若结扎线移位或松动则及时更换，1周后去除结扎线。

将建模成功的60只大鼠随机分为模型组、低剂量GL（low-dose GL，L-GL）组、中剂量GL（medium-dose GL，M-GL）组、高剂量GL（high-dose GL，H-GL）组及通路激活剂组，每组12只。其中，L-GL组、M-GL组、H-GL组分别通过尾静脉注射2、4、10 mg·kg^-1 GL^［9］；通路激活剂组注射0.5 mg·kg^-1 NF-κB/NLRP3/IL-1β通路激活剂CHPG^［10］；对照组和模型组静脉注射等量生理盐水。各组均每日给药1次，连续给药20 d，期间观察大鼠牙龈情况。

2.2 牙周指标的检测

大鼠处死前，检查上颌第一磨牙，采用探针测定牙周探诊深度（probing depth，PD）；观察牙齿活动度（tooth mobility，TM）；评估出血指数（bleeding index，BI）；通过碱性品红染色法测定菌斑指数（plaque index，PLI），以此综合评估牙周状况。

2.3 组织取材

牙周指标检测完成后，通过腹主动脉取血，用于ELISA检测。麻醉处死大鼠后，每组各取6只大鼠分离上颌骨，用于检测牙槽骨吸收；取剩余6只大鼠的牙周组织，其中一部分用于蛋白印迹（Western blotting）实验，其余部分组织用于HE染色、TRAP染色和免疫组织化学实验。

2.4 血清炎症因子的检测

取2.3项下大鼠的腹主动脉血3 mL，离心，取上清，按照IL-1β、IFN-γ、IL-6的ELISA试剂盒说明书进行操作，用酶标仪测定450 nm处的吸光度值，计算血清中IFN-γ、IL-1β、IL-6的浓度。

2.5 显微计算机断层扫描（micro computed tomography，Micro-CT）分析牙槽骨吸收情况

使用Micro-CT系统对2.3项下大鼠的上颌骨进行扫描，使用Image J软件测量牙骨质-釉质交界（cemento-enamel junction，CEJ）、CEJ到牙槽骨顶（alveolar ridge，ABC）的距离（CEJ-ABC）值，以此分析牙槽骨吸收情况。

2.6 HE染色观察牙周组织病理学变化

取2.3项下分离的牙周组织，经固定、脱水、浸蜡、包埋等，切成0.4 μm的切片，按照HE染色试剂盒步骤进行操作，观察牙周组织的病理变化。

2.7 TRAP染色观察牙周组织破骨细胞数量的变化

取2.6项下石蜡切片，按照TRAP染色试剂盒步骤进行操作，观察牙周组织破骨细胞数量。

2.8 免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）法检测NF-κB、NLRP3、IL-1β蛋白表达阳性率

取2.6项下石蜡切片，加NF-κB（1∶250）、IL-1β（1∶500）、NLRP3（1∶200），4 ℃孵育过夜，室温复温30 min，用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）漂洗，二抗（1∶500）室温孵育20 min，PBS漂洗，2，2’-二烯丙基双酚A（diallyl bisphenol A，DBA）溶液染色，苏木素复染，晾干，于显微镜下观察、拍照。

2.9 Western blotting检测牙周组织通路NF-κB、NLRP3、IL-1β蛋白的表达

取2.3项下用于Western blotting的牙周组织，组织破碎提蛋白，BCA蛋白测定，电泳，转印，封闭，PBS漂洗。一抗NF-κB（1∶3 000）、IL-1β（1∶1 000）、NLRP3（1∶2 000）、β-肌动蛋白（β-actin）（1∶5 000）4 ℃过夜孵育，PBS漂洗，加入二抗（1∶5 000），孵育1 h，化学发光显影仪采用增强型化学发光（enhanced chemiluminescence，ECL）显色。采用Image J软件分析各条带灰度值，根据条带的深浅和面积综合得出蛋白的相对表达水平，以此得出目标蛋白的相对表达量。

2.10 统计学方法

采用SPSS 26.00软件分析数据。以（\overline{x}\pm s）表示计量资料，多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较用SNK-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 大鼠牙周指标水平的比较

与对照组比较，模型组的PD、TM、BI、PLI水平均显著升高（P<0.05）；与模型组比较，L-GL组、M-GL组、H-GL组的PD、TM、BI、PLI水平均显著降低（P<0.05），且呈剂量依赖性；与H-GL组比较，通路激活剂组的PD、TM、BI、PLI水平均显著升高（P<0.05）。见表1。

3.2 大鼠血清炎症因子IL-1β、IFN-γ、IL-6水平的比较

与对照组比较，模型组的血清IL-1β、IFN-γ、IL-6水平均显著升高（P<0.05）；与模型组比较，L-GL组、M-GL组、H-GL组的IL-1β、IFN-γ、IL-6水平均显著降低（P<0.05），且呈剂量依赖性；与H-GL组比较，通路激活剂组的IL-1β、IFN-γ、IL-6水平均显著升高（P<0.05）。见表2。

3.3 大鼠牙槽骨吸收情况的比较

与对照组比较，模型组的CEJ-ABC值显著升高（P<0.05）；与模型组比较，L-GL组、M-GL组、H-GL组的CEJ-ABC值均显著降低（P<0.05），且呈剂量依赖性；与H-GL组比较，通路激活剂组的CEJ-ABC值显著升高（P<0.05）。见表3、图1。

3.4 大鼠牙周组织病理变化的比较

对照组的牙周组织结构完整，无明显病理学改变；模型组可见上皮破裂，伴有大量炎症细胞浸润；L-GL组、M-GL组、H-GL组随着GL剂量增加，病理损伤程度逐渐减轻，炎症细胞浸润数量逐渐减少；通路激活剂组病理损伤程度与模型组相近。见图2。

3.5 大鼠牙周组织破骨细胞数量的比较

与对照组比较，模型组的破骨细胞数量显著升高（P<0.05）；与模型组比较，L-GL组、M-GL组、H-GL组的破骨细胞数量均显著减少（P<0.05），且呈剂量依赖性；与H-GL组比较，通路激活剂组的破骨细胞数量显著升高（P<0.05）。见表4、图3。

3.6 大鼠牙周组织相关通路蛋白阳性表达情况的比较

与对照组比较，模型组的NF-κB、NLRP3、IL-1β阳性率均显著升高（P<0.05）；与模型组比较，L-GL组、M-GL组、H-GL组的NF-κB、NLRP3、IL-1β阳性率均显著降低（P<0.05），且呈剂量依赖性；与H-GL组比较，通路激活剂组的NF-κB、NLRP3、IL-1β阳性率均显著升高（P<0.05）。见表5、图4。

3.7 大鼠牙周组织相关通路蛋白表达的比较

与对照组比较，模型组NF-κB、NLRP3、IL-1β蛋白的表达水平均显著升高（P<0.05）；与模型组比较，L-GL组、M-GL组、H-GL组的NF-κB、NLRP3、IL-1β蛋白表达水平均显著降低（P<0.05），且呈剂量依赖性；与H-GL组比较，通路激活剂组的NF-κB、NLRP3、IL-1β蛋白表达水平均显著升高（P<0.05）。见图5、图6。

4 讨论

牙周炎是一种慢性炎症性疾病，常由牙菌斑积累引发，以牙周韧带破坏和牙槽骨质流失为特征，严重时可导致牙齿脱落^［11-12］。其破坏性机制包括菌斑中细菌及细菌产物直接造成的组织损伤，以及通过过度产生炎症介质和基质金属蛋白酶诱导宿主免疫与炎症反应，进而间接加剧牙周炎的进展及严重程度。在全球范围内，约11%的人群患有重度牙周炎，受影响人口达7.43亿^［13］。此外，牙周炎引起的口腔菌群失调与恶性肿瘤存在关联，包括肺癌、结肠癌、乳腺癌、口腔癌等，其中中度和重度牙周炎与口腔癌及消化系统疾病死亡风险增加相关^［14-17］。牙周炎常伴有牙龈发红、肿胀、出血、牙齿松动等症状。本研究采用牙龈卟啉单胞菌建立大鼠牙周炎模型，结果显示，模型组牙周检测指标（PD、TM、BI、PLI）均高于对照组，且模型组出现上皮破裂、大量炎症细胞浸润等现象，表明大鼠牙周炎模型建模成功。

GL是从甘草中提取的天然三萜类化合物，具有抗炎、抗病毒、抗氧化、抗癌等多种特性^［18］，已被证实在口腔疾病治疗中具有巨大的潜力，可作为根管治疗药物用于龋齿、牙周炎、牙龈炎、假丝酵母菌病、复发性口疮和口腔癌等疾病的治疗^［19］。在日本，GL作为慢性肝炎的治疗药物已有60余年应用历史，其通过多种机制减轻炎症，包括抑制高迁移率组盒1蛋白、环氧合酶-2、间隙连接/连接蛋白等途径，可减少炎症因子以缓解短暂性脊髓缺血损伤，也能降低心肌炎症的发生^［20］。ZHU K Y等^［2］研究表明，GL可抑制铁死亡相关基因及炎症因子的表达，改善线粒体损伤，从而缓解炎症。SHEN C H等^［3］研究发现，GL通过抑制磷酸肌醇3/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路，下调HMGB1表达，进而抑制炎症并促进细胞凋亡，以改善肝损伤。SUN Y等^［9］研究发现，在CP大鼠中，GL可抑制由肿瘤坏死因子-α诱导的HMGB1表达，降低炎症因子水平，从而抑制大鼠牙周炎症。AKUTAGAWA K等^［21］研究发现，GL能抑制炎症因子产生，可治疗糖尿病小鼠的牙周及全身炎症。IDEGUCHI H等^［4］研究发现，牙周炎患者发炎的牙龈组织巨噬细胞中存在高浓度促炎介质，经GL处理后，破骨细胞及中性粒细胞数量显著减少，可有效减缓炎症反应。上述研究均表明GL能抑制炎症、减少组织损伤，但针对CP组织损伤的研究较少。本研究结果显示，经GL处理后大鼠牙周指标优于模型组，炎症因子（IL-1β、IFN-γ、IL-6）水平、CEJ-ABC值、破骨细胞数量均显著低（少）于模型组，病理损伤程度减轻，且上述指标的变化趋势呈剂量依赖性。表明GL可有效缓解CP大鼠牙周组织损伤。

NF-κB属于Rel蛋白家族，作为炎症反应的关键介质，其可通过相关信号通路参与激活机体内的炎性反应、氧化应激和免疫调节等过程，并通过促进大量炎症细胞因子、组胺因子和多种免疫活性因子的产生而逐步加重体内的炎症反应^［22］。炎症小体是一类多蛋白复合物，其中NLRP3是已鉴定的炎症小体之一，在先天免疫中发挥核心作用，可对病原体相关分子模式和损伤相关分子模式做出反应，并激活NF-κB信号通路^［23］。NF-κB的上调可增加IL-1β的表达，导致炎症细胞浸润^［24］。LI Y等^［5］研究发现，肠上皮细胞中NF-κB和NLRP3炎症小体被激活后，会导致IL-1β分泌增加，加重对肠上皮内淋巴细胞的毒性及上皮屏障损伤程度。SHAN C等^［6］研究发现，阻断NF-κB/NLRP3/IL-1β信号通路的激活，可有效抑制炎症因子产生及细胞凋亡，减轻败血支原体感染后的肺损伤。ZEYADA M S等^［25］研究发现，通过靶向调控NF-κB/NLRP3/IL-1β信号转导，可减轻炎症症状，从而减少肺泡上皮细胞的凋亡与衰老。ZHAO Y M等^［26］的研究结果显示，地塞米松通过抑制NF-κB/NLRP3/IL-1β通路，减少炎症因子表达及细胞胶质增生，以减轻创伤性增殖性玻璃体视网膜病变。LI L等^［7］研究发现，抑制NF-κB/NLRP3通路可抑制牙槽骨吸收，减少破骨细胞数量，降低牙龈组织中炎症因子（IL-1β、IL-6、IFN-γ）的表达，从而减轻炎症症状。本研究表明，抑制NF-κB/NLRP3/IL-1β通路可减轻炎症症状，缓解组织损伤。本研究结果显示，与模型组比较，经GL处理后，NF-κB、NLRP3、IL-1β蛋白表达及阳性表达率均显著降低，而加入NF-κB/NLRP3/IL-1β激活剂后，上述蛋白表达及阳性表达率、牙周检测指标（PD、TM、BI、PLI）、炎症因子（IL-1β、IL-6、IFN-γ）水平、CEJ-ABC值及破骨细胞数量均出现逆转，表明GL可抑制NF-κB/NLRP3/IL-1β信号通路。

综上所述，GL可能通过抑制NF-κB/NLRP3/IL-1β信号通路，改善CP大鼠牙周组织损伤，且该作用呈剂量依赖性。由于NF-κB/NLRP3/IL-1β通路调控机制复杂，本研究仅在大鼠体内进行了验证，后续将进一步通过体外实验及临床研究加以证实。

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