虫草素通过抑制葡萄糖调节蛋白78表达逆转由棕榈酸诱导的肝细胞损伤及凋亡的研究

Cordycepin reverses palmitic acid-induced hepatocyte injury by modulating glucose-regulated protein 78 expression

摘要

目的 探究虫草素能否逆转由棕榈酸诱导的肝细胞损伤，并明确其对细胞凋亡及葡萄糖调节蛋白78（glucose-regulated protein 78，GRP78）表达的影响。 方法 采用棕榈酸诱导LO2细胞内脂滴沉积，构建肝细胞脂肪变性模型，并计算半数抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC₅₀）。将细胞分为对照组、棕榈酸组、棕榈酸与虫草素共同处理组，采用细胞计数试剂盒-8（Cell Counting Kit-8，CCK-8）检测细胞活力变化；运用油红O染色法评估各组细胞内脂滴积累情况；利用流式细胞术检测细胞凋亡变化；采用免疫印迹法（Western blotting）检测细胞凋亡相关蛋白与GRP78的表达变化。 结果 棕榈酸的IC₅₀为35.8 μmol·L^-1。与对照组比较，棕榈酸组的细胞活力显著下降，而棕榈酸与虫草素共同处理组的细胞活力显著升高（P<0.001）；棕榈酸组细胞的脂滴数量显著增加，而棕榈酸与虫草素共同处理组细胞的脂滴数量显著减少（P<0.001）；棕榈酸组的细胞凋亡率显著升高，经虫草素处理后细胞凋亡率显著降低（P<0.001）；棕榈酸组细胞中凋亡蛋白及GRP78的表达水平显著升高，抗凋亡蛋白表达显著降低，而经虫草素处理后，凋亡蛋白与GRP78的表达水平均被逆转（P<0.001）。 结论 棕榈酸可诱导LO2肝细胞发生脂肪变性，而虫草素能够通过抑制GRP78的表达，逆转由棕榈酸诱导的肝细胞损伤和凋亡。

Abstract

Objective To investigate whether cordycepin can reverse palmitic acid-induced hepatocyte injury and its effects on apoptosis and glucose-regulated protein 78 （GRP78） expression. Methods A hepatocellular steatosis model was established by inducing lipid droplet accumulation in LO2 cells with palmitic acid， and the half-maximal inhibitory concentration （IC₅₀） was calculated. The cells were divided into control， palmitic acid， and palmitic acid plus cordycepin co-treatment groups. Cell viability was assessed using the Cell Counting Kit-8 （CCK-8）. The accumulation of lipid droplets in each group was evaluated by Oil Red O staining. Apoptosis was detected using flow cytometry. The expression of apoptotic proteins and GRP78 was measured by Western blotting. Results The IC₅₀ of palmitic acid was 35.8 μmol·L^-1. Compared with the control group， cell viability in the palmitic acid group was significantly decreased， while cell viability in the palmitic acid plus cordycepin co-treatment group was significantly increased （P<0.001）. The number of lipid droplets was significantly increased in the palmitic acid group but significantly reduced in the palmitic acid plus cordycepin co-treatment group （P<0.001）. The apoptosis rate was significantly elevated in the palmitic acid group， and significantly decreased following cordycepin treatment （P<0.001）. The expression levels of apoptotic proteins and GRP78 were significantly increased in the palmitic acid group， while the expression of anti-apoptotic proteins was significantly decreased； these changes were reversed by cordycepin treatment （P<0.001）. Conclusion Palmitic acid can induce steatosis in LO2 hepatocytes. Cordycepin can reverse palmitic acid-induced hepatocyte injury and apoptosis by inhibiting the expression of GRP78.

Graphical abstract

关键词

肝细胞损伤 / 虫草素 / 葡萄糖调节蛋白78 / 棕榈酸 / 细胞凋亡

Key words

hepatocellular injury / cordycepin / glucose-regulated protein 78 / palmitic acid / apoptosis

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是全球范围内较常见的慢性代谢性肝病之一，其主要特征为肝细胞内脂肪过量积累。这种脂肪积累可引发肝脏炎症及细胞损伤，进而发展为非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）^［1］。全球NAFLD患病率正处于快速上升阶段，目前已达30%左右，且这一比例预计到2040年实现翻倍增长^［2］。NAFLD的发病与肥胖、代谢和饮食习惯等多种因素密切相关^［3］。

棕榈酸（palmitic acid）是主要的膳食饱和脂肪酸。研究表明，棕榈酸可通过促进内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）和脂肪酸合成，诱导肝细胞炎症及凋亡，从而加剧NAFLD肝损伤^［4］。葡萄糖调节蛋白78（glucose-regulating protein 78，GRP78）作为内质网应激反应的标志性蛋白，在调控该反应中发挥关键作用^［5］。在NASH患者中，血清GRP78水平升高，表明其可能在NAFLD的发病过程中具有重要作用^［6］。

目前，NAFLD的治疗主要依赖于药物、饮食结构改善和运动等措施^［7］，但缺乏特效药物。虫草素（cordycepin）是冬虫夏草的主要活性成分之一，已被证实具有改善肝损伤的作用^［8］，但其对NAFLD的影响研究较少。继往研究发现，虫草素可通过激活AMP激活蛋白激酶信号通路，减轻肝细胞脂肪堆积和炎症反应，从而改善肝损伤^［9］。然而，目前尚无研究探讨虫草素是否能逆转由棕榈酸诱导的肝细胞损伤。本研究通过棕榈酸诱导建立肝细胞脂肪变性模型，探讨虫草素对棕榈酸诱导的肝细胞损伤的抑制作用，特别是其对GRP78蛋白表达的调控机制，以期为虫草素治疗NAFLD提供理论依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Synergy H1型酶标仪（美国BioTek公司）；FACSCalibur型流式细胞仪（美国BD公司）；Axio Vert.A1型倒置显微镜（德国Zeiss公司）；CB150型恒温二氧化碳培养箱（德国Binder公司）；5424R型高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；NanoDrop 2000型蛋白浓度测定仪（美国Thermo Fisher公司）；Mini-PROTEAN Tetra System型电泳仪、ChemiDoc MP型化学发光成像系统，均购自美国Bio-Rad公司。

1.2 试药

棕榈酸（批号B21705，质量分数≥99%，上海源叶生物科技有限公司）；虫草素（批号C3394，质量分数≥98%，美国Sigma公司）；杜氏改良的eagle培养基（dulbecco’s modified eagle’s medium，DMEM）高糖培养基（批号E600003）和胎牛血清（批号E510002）均购自武汉生工生物工程股份有限公司；青链霉素混合液（批号P1400，北京索莱宝科技有限公司）；细胞计数试剂盒-8（Cell Counting Kit-8，CCK-8，批号CK04，日本Dojindo公司）；油红O染色试剂盒（批号C0157S）、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白浓度测定试剂盒（批号P0009），均购自上海碧云天生物技术有限公司）；Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒（批号A211-01/02，南京诺唯赞生物科技股份有限公司）；GRP78（批号：BA2042）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶12（cysteine-aspartic protease 12，Caspase 12，批号：BA3142）、B细胞淋巴瘤-2（B cell lymphoma-2，Bcl-2）抗体（批号：BA0412），均购自武汉博士德生物工程有限公司；裂解半胱天冬酶-3（Cleaved-Caspase-3）抗体（批号ab32042）和山羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）的辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记二抗（批号ab6721），均购自美国Abcam公司；B细胞淋巴瘤-2相关X蛋白（B cell lymphoma-2 associated X，Bax）抗体（批号GB114122-100）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体（批号GB11002-100），均购自上海赛维尔生物科技有限公司。

1.3 细胞

人肝细胞系LO2细胞，由中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心提供。

2 方法

2.1 CCK-8法测定棕榈酸对LO2细胞的半数抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC₅₀）

从液氮罐中取出LO2细胞冻存管，使用DMEM高糖培养基复苏，培养基中添加体积分数10%胎牛血清及100 U·mL^-1青霉素、100 U·mL^-1链霉素进行传代培养。将LO2细胞以1 000个·孔^-1的密度接种于96孔板中，置于37 ℃、含体积分数5% CO₂培养箱中培养24 h。用不同浓度的棕榈酸（0.78、1.56、3.13、6.25、12.5、25、50、100 μmol·L^-1）处理LO2细胞24 h，每孔加入10 μL CCK-8试剂，37 ℃避光孵育2 h，使用酶标仪测定450 nm波长处各孔的吸光度（A）值。绘制棕榈酸浓度与细胞存活率的关系曲线，通过非线性回归模型拟合得到IC₅₀值。

2.2 CCK-8法评估虫草素对棕榈酸诱导LO2细胞损伤的逆转作用

棕榈酸处理细胞24 h后，加入不同浓度的虫草素（1、5、10、20、30、40、50 μmol·L^-1）继续孵育24 h。每孔加入10 μL CCK-8试剂，在37 ℃避光孵育2 h，使用酶标仪测定450 nm波长处的A值。

2.3 CCK-8法检测细胞活力

取生长状态良好的细胞，经0.25%胰酶消化后计数，以5 000个·孔^-1的密度接种于96孔板中。实验分为对照组（培养基不做处理）、棕榈酸组（培养基中加入30 μmol·L^-1棕榈酸处理24 h）、棕榈酸与虫草素共同处理组（培养基中加入30 μmol·L^-1棕榈酸处理24 h后，加入30 μmol·L^-1虫草素处理24 h）。细胞稳定后，向每孔加入相当于培养基体积1/10的CCK-8试剂（即每孔约10 μL），在37 ℃、含体积分数5% CO₂培养箱中培养3 h，使用酶标仪测定450 nm波长处的A值，以时间为横坐标、A值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

2.4 油红O检测脂肪变性情况

细胞经体积分数4%多聚甲醛固定10 min后，用磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline，PBS）洗涤2次。加入染色洗涤液覆盖细胞20 s，随后加入油红O染色工作液染色15 min。去除油红O染色工作液，加入染色洗涤液静置30 s，再用PBS洗涤。最后加入适量PBS覆盖细胞，在显微镜下观察、拍照并统计脂滴数量。将染色后的油红O用体积分数60%异丙醇提取，提取液转移至96孔板中，使用分光光度计在520 nm波长处测定A值，通过A值变化量评估各组脂滴积累差异。

2.5 流式细胞仪检测细胞凋亡率

从培养箱中取出处理后的细胞培养瓶，吸去培养基，每瓶加入2 mL预热PBS洗涤以去除残留培养基。吸去PBS，加入1 mL质量分数0.25%胰蛋白酶，孵育3 min。待细胞成球状后，吸去胰酶，加入1 mL全培养基终止消化，再加入2 mL PBS吹打悬浮细胞，转移至流式管中，以1 000 r·min^-1离心5 min，弃上清。加入凋亡检测工作液吹打重悬，避光孵育15 min后，使用流式细胞仪进行分析。

2.6 Western blotting检测细胞中蛋白的表达情况

提取细胞总蛋白，采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定总蛋白浓度。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）法分离蛋白样品，转移至聚偏氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride membrane，PVDF）。室温封闭1 h，用Tris缓冲盐溶液（Tris-buffered saline， TBS）洗膜。加入GRP78、Caspase 12、Bax、Cleaved-Caspase-3、Bcl-2、GAPDH一抗（1∶1 000），室温摇床平缓摇动1 h，TBS洗膜。将PVDF膜放入含稀释1∶5 000的二抗的溶液中，室温摇床平缓摇动40 min。TBS洗膜后，进行化学发光、显影、定影。扫描胶片，用Image J分析系统采集图像并检测各蛋白条带灰度值，目的蛋白相对表达水平以目的蛋白条带与内参照GAPDH条带的灰度值之比表示。

2.7 统计学方法

使用GraphPad Prism 9.0软件分析数据。计量资料以（\overline{x}±s）表示，组间两两比较采用单因素方差分析（one-way analysis of variance，ANOVA）。若ANOVA提示组间存在显著差异，进一步采用Tukey’s多重比较检验确定组间显著性差异。P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 棕榈酸处理LO2细胞的IC₅₀值及虫草素逆转作用

棕榈酸对LO2细胞的IC₅₀为35.8 μmol·L^-1（见图1），表明当棕榈酸浓度达到35.8 μmol·L^-1时，可使LO2细胞存活率降至50%。此外，本研究进一步评估了不同浓度虫草素对棕榈酸诱导LO2细胞损伤的抑制作用：在采用30 μmol·L^-1棕榈酸建立细胞损伤模型的基础上，分别加入不同浓度的虫草素进行干预。结果显示，虫草素在10~40 μmol·L^-1浓度范围对棕榈酸诱导的细胞损伤表现出浓度依赖性逆转效果，其中30 μmol·L^-1虫草素的逆转作用最为显著（P<0.001）。基于上述结果，后续实验确定采用30 μmol·L^-1虫草素作为干预浓度。见表1。

3.2 CCK-8法检测的结果

第5天，棕榈酸组的A值显著低于对照组（1.13±0.12） vs. （1.90±0.03），（P<0.001），表明棕榈酸可显著抑制LO2细胞的增殖活力。棕榈酸与虫草素共同处理组的A值显著高于棕榈酸组（1.70±0.07） vs. （1.13±0.12），（P<0.001），表明虫草素可逆转棕榈酸对LO2细胞增殖的抑制作用。见图2。

3.3 流式细胞仪检测的结果

对照组LO2细胞中仅存在少量早期凋亡细胞，晚期凋亡细胞占比极低。与之相比，棕榈酸组的细胞凋亡率从对照组的（5.46%±0.05%）显著升高至（16.33%±0.28%），P<0.001。而棕榈酸与虫草素共同处理组的细胞总凋亡率较棕榈酸组显著降低，从（16.33%±0.28%）降至（8.43%±0.23%），P<0.001。上述结果表明，虫草素可有效缓解由棕榈酸诱导的LO2细胞凋亡。见图3。

3.4 油红O检测的结果

与对照组比较，棕榈酸处理组细胞内脂滴数量从（7.33±3.78）个显著增加至（41±4.58）个（P<0.001），表明棕榈酸可显著促进LO2细胞内脂滴的异常积累。与棕榈酸组比较，棕榈酸与虫草素共同处理组的脂滴数量从（41±4.58）个显著减少至（15.67±3.05）个（P<0.001）。表明虫草素可有效抑制由棕榈酸诱导的LO2细胞脂滴积累。见图4。

此外，通过油红O染色实验测定A值对脂质沉积水平进行量化评估，结果显示各组间的差异具有统计学意义。棕榈酸组的A₅₂₀值为（1.17±0.04），显著高于对照组的（0.42±0.04），P<0.001；而棕榈酸与虫草素共同处理组的A₅₂₀值降至（0.49±0.03），与棕榈酸组比较，差异具有统计学意义（P<0.001）。该结果进一步证实，虫草素在减少LO2细胞脂滴积累、拮抗棕榈酸诱导的脂质沉积方面具有明确作用。

3.5 Western blotting检测的结果

与对照组比较，棕榈酸组的凋亡相关蛋白（Caspase-12、Bax、Cleaved-Caspase-3）及内质网应激标志蛋白GRP78的表达水平均显著上调，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平显著下调（P<0.001）。与之相比，棕榈酸与虫草素共同处理组的GRP78、Caspase-12、Bax及Cleaved-Caspase-3蛋白表达水平均显著降低，抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平则显著升高（P<0.001）。见图5、表2。

4 讨论

NAFLD是导致肝衰竭的主要病因之一，其核心病理特征为肝细胞内脂滴的异常积累^［10］。饱和脂肪酸对肝脏具有明确的脂毒性，可促进NAFLD的发生、发展。研究证实，棕榈酸作为饮食及血清中含量较丰富的饱和脂肪酸，能够在肝细胞中诱发脂毒性损伤^［11］。LIU X等^［12］研究发现，用棕榈酸处理LO2细胞后，可导致细胞活力降低、凋亡率升高。在肝细胞损伤研究中，肝细胞模型能够高效地模拟肝脏功能，广泛应用于药物毒理学研究^［13］。本研究采用棕榈酸干预LO2细胞，结果显示，细胞增殖活力显著下降、凋亡率明显上升，与上述文献报道的结论一致。进一步证实了棕榈酸的肝细胞脂毒性作用。

虫草素是一种天然核苷类化合物，具有抗炎、抗肿瘤、调节脂质代谢及抗氧化等多种生物活性^［14-15］。近年来的研究发现，虫草素对多种原因诱导的肝损伤具有抑制作用，可延缓肝病进展。例如，虫草素能够改善脓毒症幼鼠的急性肝损伤，其机制与降低血清丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）及乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）水平，减少肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）的分泌，调控自噬相关蛋白如微管相关蛋白1轻链3Ⅱ（microtubule-associated protein 1 light chain 3Ⅱ，LC3Ⅱ）和Beclin1的表达，进而抑制细胞凋亡及炎症反应相关^［16］；虫草素还可通过减轻肝内胆汁淤积、抑制炎症反应，对抗由α-萘异硫氰酸酯诱导的肝损伤^［17］，并通过激活核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）/Kelch样ECH相关蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）信号通路，对由四氯化碳诱导的小鼠急性肝损伤发挥抑制作用^［18］。此外，虫草素能够降低脂肪细胞内脂滴数量，调节脂肪细胞的脂质代谢过程^［19］。本研究结果显示，虫草素不仅可减少由棕榈酸诱导的LO2细胞内脂滴积累，还能显著改善细胞增殖活力下降及凋亡增加的现象，提示虫草素在NAFLD治疗中具有重要应用前景，其可通过多途径发挥肝细胞保护作用，逆转脂肪性肝损伤，具备广泛的治疗潜力。沈伟等^［20］报道了虫草素的提取和纯化方法，包括超声波辅助的酸性水提取法和离子交换树脂法等，为虫草素的研究和应用提供了技术支持。

肝细胞内脂质过度积累可诱导内质网（脂质生物合成的核心细胞器）发生结构与功能改变，如内质网膜磷脂组成异常，进而引发内质网应激、管腔内未折叠蛋白蓄积及细胞凋亡^［21］。NAFLD的发生机制涉及氧化应激介导的线粒体功能障碍、内质网应激、内毒素诱导等多个方面^［22］，其中棕榈酸可通过诱导氧化应激及钙稳态失衡，触发内质网应激，最终导致肝细胞损伤^［21］。GRP78作为内质网应激的关键标志物，主要功能为识别并结合新合成的多肽链和未折叠蛋白，协助其正确折叠，避免错误折叠和聚集^［23］。当细胞遭受缺氧、营养缺乏或药物刺激等情况时，内质网中未折叠或错误折叠的蛋白质大量积累，激活未折叠蛋白反应，此时GRP78会异常高表达以维持内质网稳态^［24］。LI Y M等^［25］研究发现，内质网应激抑制剂4-苯基丁酸可逆转棕榈酸对HepG2细胞活力的抑制作用，同时降低GRP78的表达水平，证实GRP78在内质网应激介导的细胞损伤中具有关键作用。本研究中，经棕榈酸处理的LO2肝细胞中GRP78的表达显著升高，且细胞凋亡率同步上升；而ZENG X等^［26］的研究表明，单不饱和油酸可通过抑制内质网应激和焦亡改善肝细胞脂毒性。本研究结果显示，虫草素能够显著下调由棕榈酸诱导的GRP78高表达，进而减轻细胞凋亡，这与上述研究结论一致，表明抑制GRP78表达可改善由棕榈酸介导的肝细胞损伤。推测虫草素可能通过抑制GRP78表达缓解内质网应激，阻止未折叠蛋白反应的过度激活。此外，内质网应激可通过多条信号通路诱导细胞凋亡，涉及Bcl-2家族蛋白调控、Caspase家族蛋白激活等关键环节^［27］，其中抗凋亡蛋白Bcl-2的表达下调，促凋亡蛋白Bax和Cleaved-Caspase-3表达上调，是内质网应激引发细胞凋亡的核心环节^［28］。本研究通过检测细胞凋亡相关蛋白表达发现，由棕榈酸诱导的LO2细胞中Caspase-12、Bax和Cleaved-Caspase-3表达显著升高，而经虫草素处理后上述蛋白的表达均显著降低，进一步验证了虫草素的抗凋亡保护作用，该作用可能与GRP78调控的内质网应激通路相关，但具体分子机制仍需深入研究。

本研究存在一定局限性：首先，本研究仅采用LO2肝细胞系进行体外研究，未在动物模型或临床试验中验证虫草素的保护作用。而体外细胞模型无法完全模拟体内复杂的生理微环境，因此需通过后续体内研究进一步明确其临床应用潜力。其次，研究聚焦于由棕榈酸诱导的肝细胞损伤及虫草素的干预效果，未探讨其他类型脂肪酸及其复合物对肝细胞的影响。最后，本研究虽初步探讨了虫草素的抗凋亡作用机制，但具体的分子调控网络及信号通路仍需进一步深入研究。

综上所述，本研究在模拟NAFLD病理状态的细胞模型中，证实虫草素可通过抑制GRP78表达及细胞凋亡，有效逆转由棕榈酸诱导的肝细胞损伤。该发现揭示了虫草素在抵御肝细胞脂毒性损伤中的重要潜力，为开发虫草素相关药物治疗NAFLD提供了新的思路和科学依据。

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基金资助

海南省自然科学基金面上项目(821MS0824)