复方丹参滴丸通过调控巨噬细胞极化改善冠心病患者冠状动脉病变及炎症状态机制的研究

Compound Danshen Dripping Pills mitigate coronary lesions and inflammation in coronary heart disease patients via the macrophage pathway

摘要

目的 探讨复方丹参滴丸（Compound Danshen Dripping Pills， CDDP）通过调控巨噬细胞极化途径，干预冠心病（coronary heart disease， CHD）患者冠状动脉病变程度及炎症状态的作用机制。 方法 选取收治的86例CHD患者作为研究对象，采用随机数字表法分为对照组和试验组，每组43例。对照组给予CHD常规治疗，试验组在对照组治疗的基础上联合CDDP治疗，2组的疗程均为3周。治疗后，通过冠状动脉造影评估患者冠脉狭窄程度；采用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA）检测血清炎症因子［C-反应蛋白（C-reactive protein， CRP）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）、白细胞介素-6（interleukin-6， IL-6）］和氧化应激指标［丙二醛（malondialdehyde， MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）］水平；通过流式细胞术检测外周血中M1型、M2型巨噬细胞极化水平；采用实时荧光定量反转录聚合酶链式反应（reverse transcription quantitative real-time polymerase chain reaction， RT-qPCR）检测巨噬细胞极化相关基因的相对表达水平。 结果 治疗后，与对照组比较，试验组的冠状动脉狭窄程度评分显著降低（P<0.001）；试验组的血清CRP、TNF-α、IL-6及MDA水平均显著降低，SOD水平显著升高（P<0.05）；试验组的外周血M1型巨噬细胞比例显著降低，M2型巨噬细胞比例显著升高（P<0.001）；试验组M1型巨噬细胞中诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase， iNOS）、TNF-α、IL-6基因相对表达水平均显著降低，M2型巨噬细胞中精氨酸酶1（arginase 1， Arg1）、白细胞介素-10（interleukin-10， IL-10）基因相对表达水平均显著升高（P<0.001）。 结论 CDDP可通过促进M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞转化，减轻CHD患者集体炎症反应和氧化应激损伤，进而缓解冠状动脉病变进展，该研究为CDDP在CHD临床治疗中的应用提供了实验依据和机制支撑。

Abstract

Objective To investigate the mechanism of the action of Compound Danshen Dripping Pills （CDDP） in modulating macrophage polarization pathways to improve the severity of coronary artery lesions and inflammatory status in patients with coronary heart disease （CHD）. Methods 86 patients with CHD were enrolled and randomly divided into a control group and an experimental group， with 43 patients in each group. The control group received conventional CHD treatment， while the experimental group received CDDP in addition to the control group’s treatment regimen. Both groups received a 3-week treatment course. After treatment， the degree of coronary artery stenosis was assessed by coronary angiography. Serum inflammatory factors ［C-reactive protein （CRP）， tumor necrosis factor-α （TNF-α），and interleukin-6 （IL-6）］， and oxidative stress indicators ［malondialdehyde （MDA） and superoxide dismutase （SOD）］ were measured by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. The polarization levels of M1 and M2 macrophages in peripheral blood were determined by flow cytometry. Real-time fluorescence quantitative reverse transcription polymerase chain reaction （RT-qPCR） was used to detect the relative expression levels of macrophage polarization-related genes. Results The degree of coronary artery stenosis in the experimental group was significantly lower than that in the control group （P<0.001）. The levels of inflammatory markers CRP， TNF-α， and IL-6， as well as MDA， were significantly reduced， while the SOD levels were significantly increased （P<0.05）. The proportion of M1 macrophages in the experimental group was significantly decreased， and the proportion of M2 macrophages was significantly increased （P<0.001）. The relative expression levels of inducible nitric oxide synthase （iNOS）， TNF-α， and IL-6 genes in M1 macrophages were significantly decreased， and the relative expression levels of arginase 1 （Arg1） and interleukin-10 （IL-10） genes in M2 macrophages were significantly increased in the experimental group （P<0.001）. Conclusion CDDP can alleviate the collective inflammatory response and oxidative stress damage in CHD patients by promoting the transformation of M1 macrophages to M2 macrophages， thereby alleviating the progression of coronary artery lesions. This study provides experimental basis and mechanism for the application of CDDP in the clinical treatment of CHD.

关键词

复方丹参滴丸 / 巨噬细胞 / 冠心病 / 炎症

Key words

Compound Danshen Dripping Pills / macrophages / coronary heart disease / inflammation

冠心病（coronary heart disease，CHD）是临床常见的缺血性心血管疾病，其主要特征为冠状动脉粥样硬化斑块形成和管腔狭窄，导致心肌供血不足、缺血缺氧，进而诱发心绞痛、心肌梗死等严重并发症，严重威胁患者的生命健康^［1-3］。随着居民生活方式的改变和人口老龄化进程加快，CHD的发病率呈逐年上升的趋势，亟需安全、有效的治疗和干预手段^［4-5］。巨噬细胞作为动脉粥样硬化病理进程中的关键免疫细胞，一方面，通过分泌调节炎症反应和组织修复的细胞因子和趋化因子，加剧局部炎症反应；另一方面，巨噬细胞通过参与脂质的摄取和清除过程，在动脉粥样硬化进展中发挥关键作用^［6-8］。因此，精准调控巨噬细胞功能与极化方向，有望减缓甚至逆转动脉粥样硬化进程，为CHD的治疗提供新的作用靶点。

复方丹参滴丸（Compound Danshen Dripping Pill，CDDP）是由丹参、三七和冰片等组成的复方中药制剂，具有活血化瘀、通络止痛的功效，临床研究证实，CDDP可有效改善CHD患者冠状动脉血流动力学、显著降低心绞痛发作频率并减轻疼痛程度^［9-11］。近年来基础研究进一步发现，CDDP还具有抗炎、抗氧化应激和免疫调节活性，可通过抑制炎症因子释放、增强抗氧化酶活性保护血管内皮功能^［12-13］。然而，关于CDDP是否通过调控巨噬细胞极化途径干预CHD病理进程，其具体作用机制仍不明确。

基于此，本研究以CHD患者为研究对象，探讨CDDP对患者冠状动脉病变程度及炎症状态的干预效果，重点阐明其对巨噬细胞极化方向及相关分子机制的调控作用，旨在为CDDP在CHD临床治疗中的应用提供科学依据与机制支撑。

1 一般资料

选取收治的86例CHD患者作为研究对象，采用随机数字表法分为对照组和试验组，每组43例。2组一般资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性，见表1。本研究经医院医学伦理委员会审核、批准。

纳入标准：①符合《稳定性冠心病基层诊疗指南（实践版·2020）》^［14］中CHD的诊断标准；②冠状动脉造影检查明确证实存在冠状动脉病变；③认知功能正常，具备良好的治疗依从性，能够严格遵从医嘱按时服药、完成各项检查及随访；④患者及家属对本研究的内容知情并签署知情同意书。

排除标准：①合并严重心血管疾病或严重心律失常者；②对本研究所用药物或其成分过敏者；③合并自身免疫性疾病者；④存在精神障碍或智力障碍，无法配合数据采集与治疗者；⑤患有恶性肿瘤或严重精神疾病者；⑥治疗期间服用可能影响研究结果的西药、中成药或中草药者；⑦治疗过程中未按要求配合检查和治疗或未按时服药者；⑧治疗结束后未按规定时间进行随访者。

2 方法

2.1 治疗方法

对照组给予常规西医基础治疗（经皮冠状动脉介入术，常规性输氧、血管扩张剂、利尿剂、钙离子受体阻滞剂、β-受体拮抗剂及硝酸酯类药物治疗）。试验组在对照组治疗的基础上联合CDDP治疗。口服CDDP，每次270 mg，每日3次，温水送服。2组均连续治疗3个疗程，每个疗程1周。

2.2 冠状动脉狭窄程度的评估

采用FD20型血管造影机（荷兰飞利浦公司）获取即时造影图像，通过计算机辅助定量分析系统测量病变处最小管腔直径和参考血管直径，计算直径狭窄百分比。直径狭窄百分比=（1-参考血管直径/最小管腔直径）×100%。

2.3 人外周血单核细胞的分离和培养

治疗后，采集患者空腹肘部静脉血20 mL，采用用20 mL Ficoll密度梯度离心液（美国GE healthcare公司）分离外周血单核细胞，以1 000 r·min^-1离心30 min，将分离得到的外周血单核细胞加入含有体积分数为10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的RPMI 1640培养基（美国Gibco公司）中，置于37 ℃、含体积分数5% CO₂的恒温细胞培养箱中进行培养。

2.4 巨噬细胞极化指标的检测

收集培养皿中的单核细胞，使用磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）洗涤，调整细胞密度至1×10⁶个·mL^-1。加入荧光标记抗体CD86-FITC（美国BioLegend公司）、CD80-PE（美国BioLegend公司）、CD206-APC（美国BioLegend公司）和Arg1-PerCP（美国BioLegend公司），轻轻混匀，在4 ℃避光孵育30 min。用PBS洗涤细胞2~3次，以去除未结合抗体，用体积分数4%多聚甲醛固定细胞10 min，洗涤后重悬于PBS中。使用BD FACSCelesta型流式细胞仪（美国BD公司）检测各荧光通道信号的强度，计算M1和M2表型巨噬细胞的阳性比例。

2.5 RT-qPCR检测巨噬细胞相关基因的表达

收集培养后的巨噬细胞，采用FreeZol Reagent提取细胞总RNA，使用NanoDrop 2000C测定RNA浓度。随后，利用HiScript Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Kit（含gDNA wiper）将RNA逆转录为cDNA。在qPCR反应板中，将SYBR Green qPCR Master Mix、cDNA模板及诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、精氨酸酶1（arginase 1，Arg1）、白细胞介素-10（interleukin-10，IL-10）或β-肌动蛋白（β-actin）的特异性引物进行混合，进行实时荧光定量反转录聚合酶链式反应（reverse transcription quantitative real-time polymerase chain reaction，RT-qPCR）。采用QuantStudio™3 Real-Time PCR系统进行数据采集与分析，通过2^–ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量，并以内参基因β-actin进行标准化校正。

2.6 血清炎症因子与氧化应激指标的检测

采集患者空腹肘静脉血5 mL，静置30 min后，以3 000 r·min^-¹离心15 min，分离上清液，分装后置于-80 ℃保存待测。采用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA）检测血清中C-反应蛋白（C-reactive protein， CRP）、TNF-α、IL-6及丙二醛（malondialdehyde， MDA）水平，操作严格按照试剂盒说明书进行（CRP、TNF-α、IL-6试剂盒均购自上海酶联生物科技有限公司；MDA试剂盒购自南京建成生物工程研究所）。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性采用黄嘌呤氧化酶法测定，试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

2.7 统计学方法

采用SPSS 27.0软件对数据进行处理。连续变量进行正态性检验，符合正态分布的计量资料以（\overline{x}±s）表示，2组间连续变量的比较使用t检验，3组间连续变量的比较使用单因素方差检验，事后比较使用LSD-t检验，组间分类数据的差异使用Fisher精确检验。P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 CDDP对CHD患者冠状动脉病变的影响

治疗后，试验组冠状动脉狭窄程度（7.74%± 2.11%）显著低于对照组（12.33%±3.36%），P<0.05。

3.2 CDDP对CHD患者炎症和氧化应激状态的影响

治疗后，试验组炎症因子CRP、TNF-α、IL-6及MDA表达水平显著均低于对照组，SOD水平显著高于对照组（P<0.05）。表明CDDP能够缓解CHD患者的炎症和氧化应激反应。见表3。

3.3 2组患者外周血巨噬细胞极化水平的比较

治疗后，试验组外周血单核细胞中CD86、CD80阳性的M1型巨噬细胞的比例显著低于对照组，CD206、Arg1阳性的M2型巨噬细胞的比例显著高于对照组（P<0.001）。表明CDDP能够促进CHD患者M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞的转化。见表4。

3.4 2组患者外周血巨噬细胞极化标志物表达水平的比较

治疗后，试验组M1型相关基因iNOS、TNF-α、IL-6的表达水平均显著低于对照组，M2型相关基因ARG1、IL-10的表达水平均显著高于对照组。见表5。

4 讨论

巨噬细胞作为先天免疫系统的关键效应细胞，具备吞噬外来病原体、清除凋亡细胞、调控免疫应答的功能。心脏是耗能最多、血管最丰富的器官之一，其生理功能的稳定性高度依赖良好的血液循环与免疫微环境^［15］。心血管疾病目前已成为全球人口首要死亡原因，而CHD作为其中较常见且严重的类型，其核心病理基础为冠状动脉粥样硬化^［16］。

动脉粥样硬化本质上是一种慢性炎症性疾病，其起始阶段以单核细胞从外周血进入血管内皮并经历黏附、活化和跨内皮迁移为特征^［18］。巨噬细胞是动脉粥样硬化斑块形成的早期驱动因素，通过泡沫细胞在动脉内膜累积，最终发展为复杂的动脉粥样硬化斑块^［19］。根据功能差异，巨噬细胞可分为经典活化型巨噬细胞（M1型）和替代活化型巨噬细胞（M2型）^［20］：M1型巨噬细胞主要分泌TNF-α，白细胞介素-1（interleukin-1， IL-1）和单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1， MCP-1）等炎症因子和趋化因子，通过招募更多炎症细胞至斑块部位，促进炎症反应并破坏斑块稳定性。LIU S等^［21］的研究进一步证实，M1型巨噬细胞可通过分泌促炎外泌体和特定miRNA（如抑制血管生成、阻碍心脏修复的miRNA）直接导致心肌组织损伤。与之相反，M2型巨噬细胞具有抗炎和组织修复双重作用，可通过分泌IL-10等抗炎因子抑制炎症扩散，同时参与细胞外基质重塑与血管生成。例如在心肌梗死后第4~7天，Ly6C低表达单核细胞会优先被募集到梗死心肌区域，分化为M2型巨噬细胞，为心肌修复提供必要的微环境^［22］。

CDDP是一种中药复方制剂，具有活血化瘀、通络止痛的功效。本研究结果显示，CDDP能显著缓解CHD患者的冠状动脉狭窄程度，同时降低外周血中炎症因子和氧化应激相关蛋白的表达，这与刘凤敏等^［17］的研究结论一致，进一步证实了CDDP的抗炎、抗氧化活性。更重要的是，本研究首次明确CDDP可调控CHD患者外周血中M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞转化，M2型的标志蛋白显著增加，同时能够降低巨噬细胞中炎症因子的水平。这一结果表明，CDDP并非单纯抑制炎症因子释放，而是通过重塑巨噬细胞极化平衡，从“源头”调控炎症反应与组织修复过程，为其改善CHD进程提供了关键机制支撑。传统抗炎药物主要通过抑制如TNF-α和IL-6等促炎因子的释放来减轻炎症，但对巨噬细胞极化状态的调控作用有限，难以从根本上改善炎症微环境。而CDDP则在此基础上，可进一步促进巨噬细胞向抗炎修复型M2表型转变，从而在抗炎和组织修复方面表现出更为全面的作用，使其在缓解冠状动脉病变上具有独特的优势。

尽管本研究证实了CDDP在CHD治疗中通过调控巨噬细胞极化发挥了显著作用，但仍存在一些局限性。首先，研究主要集中在外周血中巨噬细胞的极化变化，未充分探讨冠状动脉局部巨噬细胞的功能状态及其微环境对巨噬细胞极化的影响，未来需要结合局部组织分析，以全面理解巨噬细胞在冠状动脉粥样硬化中的具体作用机制。其次，本研究中的巨噬细胞极化状态主要通过流式细胞术检测特定标志蛋白的表达来评估，但巨噬细胞的功能状态和多样性不仅由标志蛋白决定，还与其他指标相关，未来需要进一步采用单细胞测序等技术，以全面解析巨噬细胞在CDDP治疗中的具体作用和机制。最后，研究未探讨CDDP的潜在不良反应及与CHD常规治疗药物的相互作用，而临床中CHD患者多需长期联合用药，未来需通过大样本进行长期随访研究，评估CDDP的安全性及药物相互作用风险，为临床用药提供更全面的依据。

综上所述，本研究证实CDDP可通过调控巨噬细胞极化方向，减轻CHD患者机体炎症反应和氧化应激损伤，从而抑制冠状动脉粥样硬化病变进程，为CDDP作为CHD辅助治疗药物的临床应用提供了重要理论支撑。

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基金资助

陕西省卫生健康科研项目(2022111089)