硫辛酸-2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱深共晶凝胶的制备及其用于治疗大鼠皮肤损伤效果的研究

Preparation of lipoic acid-2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine deep eutectic gels and application in rat skin injury

摘要

目的 制备硫辛酸-2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱（lipoic acid-2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine， LA-MPC）深共晶凝胶，并评价其理化特性及对大鼠皮肤损伤的治疗效果。 方法 采用溶剂法制备LA-MPC深共晶凝胶，通过安东帕流变仪分析凝胶流变学特性，利用扫描电子显微镜（scanning electron microscope， SEM）观察微观形貌，用重量法测定凝胶溶胀率，采用万能试验机测定凝胶与皮肤组织的黏附强度。建立大鼠背部全层皮肤损伤模型，将模型大鼠随机分为模型组（不作处理）、3M膜组（外敷直径10 mm的3M膜）和凝胶组（外敷0.1 mL LA-MPC深共晶凝胶）。通过统计大鼠伤口愈合率、对伤口组织进行病理学切片分析，评价LA-MPC深共晶凝胶对皮肤损伤的疗效。 结果 流变学测试显示储能模量高于损耗模量，SEM视野观察到有序的纹状结构，证实LA-MPC深共晶凝胶制备成功；凝胶溶胀率为20%，黏附强度为16 kPa。在体实验结果显示，与模型组、3M组比较，LA-MPC深共晶凝胶组大鼠皮肤损伤愈合速度显著加快（P<0.05）；伤口组织病理检查显示，LA-MPC深共晶凝胶组局部炎症反应明显缓解，结缔组织重建更加有序。 结论 LA-MPC深共晶凝胶具有良好的组织黏附性与生物活性，可有效缓解大鼠皮肤损伤局部炎症反应、促进伤口愈合，为开发新型皮肤修复敷料提供了实验依据和新思路。

Abstract

Objective To prepare deep eutectic gels of lipoic acid-2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine （LA-MPC） for the treatment of rat skin injuries. Methods The LA-MPC deep eutectic gels were prepared and characterized for morphology and strength by using an Anton Paar rheometer （MCR 302） and scanning electron microscopy （SEM）. The swelling rate and adhesive strength were measured. A rat skin injury model was established， and the therapeutic effects of the LA-MPC deep eutectic gels were evaluated through wound healing rate statistics and histopathological analysis of skin tissue in the rat skin injury model. Results Rheological tests showed that the storage modulus was higher than the loss modulus， and SEM observations revealed an ordered striated structure， confirming the successful preparation of the LA-MPC deep eutectic gels. The swelling rate and adhesive strength were 20% and 16 kPa， respectively. In vivo therapeutic evaluation showed the LA-MPC deep eutectic gels significantly accelerated skin injury healing in rats （P<0.05）. Histopathological examination of the wound tissue revealed the LA-MPC deep eutectic gels significantly reduced local inflammation and more orderly connective tissue reconstruction. Conclusion The prepared LA-MPC deep eutectic gels have good tissue adhesion and antioxidant activity. The gels alleviate local inflammation in rat skin injuries and promote wound healing， providing new ideas for the development of novel skin dressings.

Graphical abstract

关键词

硫辛酸 / 2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱 / 深共晶凝胶 / 皮肤损伤 / 伤口愈合

Key words

lipoic acid / 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine / deep eutectic gels / skin injury / wound healing

皮肤组织的结构完整性是其发挥屏障保护、感知外界等生理功能的前提，但在日常生活中，皮肤易受到外部机械损伤、理化刺激等影响而发生损伤^［1-2］。近几十年来，慢性难愈合伤口发病率居高不下，已成为全球公共卫生领域的重要挑战^［3］。伤口愈合是一个动态且复杂的生物学过程，主要包括止血、炎症反应、细胞增殖和组织重塑4个互相关联、有序衔接的阶段^［4-5］。其中，伤口局部持续的高水平炎症反应是导致愈合进程停滞于炎症期以及影响皮肤损伤修复的关键因素^{［3， 6］}。手术缝合作为临床闭上伤口的“金标准”，虽应用广泛，但在应对不规则创面、调控伤口微环境等方面存在明显局限性^［7］。水凝胶因具备优异的生物相容性、仿生组织机械性能及微环境调控能力，被认为是下一代伤口闭合与修复材料的重要发展方向^［8］。因此，开发可针对性改善皮肤损伤炎症微环境的水凝胶敷料，对提升伤口愈合质量具有重要临床意义^［9］。

硫辛酸（lipoic acid，LA）是一种内源性小分子辅酶，其独特的五元二硫杂环结构赋予其优异的抗炎和抗氧化活性^［10-13］。目前已有学者尝试将LA制备成水凝胶用于医学领域，例如天津大学刘文广教授团队设计了LA和甲基丙烯酸酯改性明胶组成的复合水凝胶，该凝胶具有湿度响应性黏附能力和良好抗氧化活性，可用于牙周炎的治疗^［13-16］。但现有制备方法多涉及复杂化学反应，且可能引入有害化学试剂，对凝胶的生物活性与应用安全性存在潜在不利影响，因此，需要开发更简便、安全、有效的LA基凝胶制备策略。

本研究发现，LA分子中的羧酸基团具有作为氢键供体的潜力。受Abbott等人2003年发现乙二醇与氯化胆碱可形成深共晶溶剂的启发^{［15，17-18］}，课题组推测选择适宜的氢键受体分子，可与LA通过非共价相互作用形成深共晶凝胶。2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱（2-methacryloyloxy ethyl phosphorylcholine，MPC）因具有与氯化胆碱相似的氢键受体基团，且其良好的生物相容性已被大量研究证实^［19-21］，成为本研究的优选氢键受体。实验结果显示，当LA与MPC质量比为1.5∶1时，二者混合后熔点表现出显著降低的现象，在40 ℃条件下可形成LA-MPC深共晶凝胶。通过调控LA和MPC的比例，有望构建合成简便、兼具抗炎活性的新型皮肤损伤修复敷料。

1 仪器与材料

1.1 仪器

EU-K1-40TJ型超纯水机（南京欧铠环境科技有限公司）；MCR 302型流变仪（奥地利安东帕公司）；MAIA3 LMH型扫描电子显微镜（捷克TESCAN公司）；MTS-880/25型万能试验机［美特斯工业系统（中国）有限公司］。

1.2 试药

硫辛酸（天津希恩思生化科技有限公司）；2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱（上海麦克林生化科技股份有限公司）。

1.3 实验动物

雄性SD大鼠，体质量为（200±20） g，购自西安交通大学医学部实验动物中心，生产许可证号为SCXK（陕）2023-002。大鼠饲养在清洁级动物房中，12 h照明/12 h黑暗，温度为20~22 ℃，相对湿度为40%~60%，自由获取食物和水。

2 方法与结果

2.1 统计学方法

采用Prism 8.0软件对数据进行处理。计量资料用（\overline{x}\pm s）表示，组间比较用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2.2 LA-MPC深共晶凝胶的制备及表征

2.2.1 LA-MPC深共晶凝胶的制备

按不同质量比称取LA与MPC置于离心管中，涡旋振荡1 min使两种粉末充分混匀，随后置于40 ℃恒温水浴中加热30 min，观察凝胶形成情况。通过多组质量比筛选实验发现：当LA与MPC质量比<1.5∶1时，MPC熔化不完全，凝胶体系中可以观察到大量MPC固体颗粒；当质量比达到1.5∶1时，LA-MPC共混物熔点降低至约40 ℃，两种粉末完全熔化，形成透明黄色凝胶；当质量比增加至2∶1时，虽两种粉末均完全熔化，但凝胶呈固态、失去流动性，不利于在皮肤表面涂抹。综上所述，确定LA∶MPC=1.5∶1为最终制备工艺。见图1。

2.2.2 LA-MPC深共晶凝胶的流变学表征

采用安东帕流变仪对LA-MPC深共晶凝胶进行流变学测试，所有测试均在直径25 mm的锥板上进行，温度设定为37 ℃（模拟人体生理温度）。

应变扫描测试：频率固定为1 Hz，应变范围为1%~2 000%，测定动态储能模量（G'）和损耗模量（G″）。结果显示，当应变处于1%~1 500%范围时，储能模量G'始终大于损耗模量G″，表明凝胶具有稳定的交联网络结构，呈典型弹性固体特征。

动态时间扫描实验：设定应变值为1%，频率为1 Hz，测定时间为0~200 s。结果显示，测试期间G'与G″值保持稳定，表明LA-MPC深共晶凝胶具有良好的结构稳定性。

步进应变扫描测试：在1 Hz恒定频率下，交替施加高剪切应变（500%）和低剪切应变（0.5%），每个循环持续100 s，共进行3次循环。结果显示，凝胶在3次循环中G'与G″值保持稳定，表明其具有良好的自愈能力。

黏度-剪切速率曲线测定：扫描剪切速率为1~1 000 s^-1，结果显示，凝胶黏度随剪切速率升高而降低，呈现显著的剪切稀化特性，利于临床涂布操作。

2.2.3 LA-MPC深共晶凝胶的扫描电子显微镜表征

取少量LA-MPC深共晶凝胶，均匀涂布于硅片表面，经液氮快速冷冻后，在扫描电子显微镜（放大倍数500×）下观察微观形貌。结果显示，凝胶呈现与常规凝胶不同的独特纹状微观结构，推测该结构由LA与MPC通过深共晶作用形成的有序分子排列所致。

2.2.4 LA-MPC深共晶凝胶的溶胀率测定

精密称取3份LA-MPC深共晶凝胶，每份0.15 g，分别置于50 mL离心管中，每管加入40 mL超纯水，置于37 ℃恒温水浴摇床中以120 r·min^-1振摇24 h，结束后取出凝胶，吸干表面水分并称其质量，计算溶胀率。结果显示，LA-MPC深共晶凝胶溶胀率较低，达到溶胀平衡时的溶胀率为20%，这是由于LA分子具有较强疏水性，抑制了水分子向凝胶内部的渗透。

2.2.5 LA-MPC深共晶凝胶的黏附强度测定

将LA-MPC深共晶凝胶分别夹于两层猪皮（模拟人体皮肤）、玻璃、木材及金属表面之间，凝胶涂布面积为4 cm²，使用万能试验机进行拉伸实验，测定凝胶在不同材料表面的最大黏附强度。结果显示，凝胶在玻璃、木材、金属表面的最大黏附强度分别约为60、80、300 kPa；在新鲜猪皮表面的最大黏附强度约为16 kPa，可实现与皮肤组织的牢固贴合，不易因外力作用脱落，满足伤口敷料的黏附需求。

2.3 LA-MPC深共晶凝胶对大鼠皮肤损伤模型的疗效研究

2.3.1 动物分组及给药方案

选取12只雄性SD大鼠随机分为模型组、3M膜组和凝胶组。通过异氟烷吸入麻醉大鼠后，备皮。使用直径为10 mm的打孔器在大鼠背部相近的部位制备伤口。3M膜组给予直径10 mm的3M膜处理、凝胶组给予0.1 mL凝胶，所有伤口都给予绷带缝合避免伤口污染。

2.3.2 体内药效评估

伤口愈合率测定：分别与建模当天（0 d）、3、7、14 d，采用数码相机拍摄各组伤口图像，并按照公式（1）计算伤口面积愈合率。

\begin{array}{c}\mathrm{伤口}\mathrm{愈合}\mathrm{率}\left(\mathrm{\%}\right)=\\ \frac{\mathrm{伤口}\mathrm{面}{\mathrm{积}}_{\mathrm{第}\mathrm{0}\mathrm{天}}-\mathrm{伤口}\mathrm{面}{\mathrm{积}}_{\mathrm{第}n\mathrm{天}}}{\mathrm{伤口}\mathrm{面}{\mathrm{积}}_{\mathrm{第}\mathrm{0}\mathrm{天}}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}\end{array}（1）

结果显示，0~7 d内，凝胶组伤口愈合率显著高于模型组（P<0.05）；第14天时，凝胶组与3M组愈合率比较，差异无统计学意义（P>0.05）。

组织病理学分析：分别于第3、7、14天处死大鼠，取伤口部位皮肤组织，置于体积分数4%多聚甲醛溶液中固定48 h，石蜡包埋并切片，进行苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，H&E）染色和Masson染色，在光学显微镜下观察组织病理学变化。结果显示，模型组在各时间点均可见明显的组织缺损区域，伴随大量炎性细胞浸润，伤口未完全愈合，表皮角质层未重建；3M膜组在第14天时伤口闭合速度快于模型组，但仍存在明显炎症反应，新生结缔组织排列不规则；凝胶组在第7天和第14天时伤口面积均显著小于模型组和3M膜组，表皮的角质层完全重建，炎症反应最轻微，且可见新生毛囊结构，提示伤口愈合质量更优秀。

3 讨论

LA作为一种具有独特巯基-双硫键结构的天然抗氧化剂，其多靶点抗氧化机制（包括清除活性氧自由基、再生内源性抗氧化剂、抑制核因子激活的B细胞的κ-轻链增强信号通路等）已在糖尿病神经病变、动脉粥样硬化、炎症性肠病及类风湿关节炎等多种疾病模型中得到验证，展现出显著的抗炎与组织保护疗效^［22-24］。然而，目前将LA用于皮肤损伤治疗的相关研究较少，且已有LA基水凝胶的制备方法多涉及复杂化学反应和较高反应温度，这不仅可能破坏LA的生物活性，引入潜在的安全风险，还提高了凝胶工业化生产与临床应用的门槛。

基于此，本研究以LA分子中羧酸基团的氢键供体潜力为出发点，设想引入适宜的氢键受体分子，通过非共价相互作用与LA形成深共晶水凝胶。受Abbott团队开创性研究（氯化胆碱与乙二醇可通过氢键网络形成室温离子液体^［18］）的启发，本课题组发现MPC的磷酸胆碱基团与LA的羧酸基团在质量比为1.5∶1时，可以在40 ℃恒温水浴条件下形成均一深共晶凝胶。该制备过程无需化学引发剂，温和的制备条件（40 ℃）可最大程度保留LA的生物活性。但此方法是否可扩展应用在各类富含羟基或羧基的小分子活性化合物，仍需后续进一步验证。

对所得LA-MPC深共晶凝胶的性能表征结果显示，该凝胶在猪皮表面的最大黏附强度达16 kPa，可以牢固黏附在皮肤组织上，推测该特性由LA的羧基和MPC的带电磷酸胆碱基团的协同作用所致。通过调节LA与MPC的质量比，或许可以进一步调控凝胶的黏附能力，适配不同伤口部位的使用需求；凝胶的平衡溶胀率为20%，较低的溶胀率使得该凝胶不易被伤口渗液过度溶胀破坏，从而维持伤口局部微环境稳定，减少敷料更换频率。流变学测试结果显示，凝胶的动态储能模量（G'）约为400 Pa，该黏弹性参数与人体真皮层力学特性（G'=300~500 Pa）高度匹配，可避免对损伤皮肤产生机械刺激，同时具备良好的涂布性，适用于不规则伤口的治疗。此外，通过建立SD大鼠全层皮肤损伤模型，给予LA-MPC深共晶凝胶治疗后，分析伤口愈合率、组织病理学等发现，凝胶组伤口愈合速度显著提高，局部炎症明显缓解。这一疗效可能是由于LA具有良好的抗氧化活性，可减轻伤口部位的炎症反应。此外，有研究报道，两性离子可调节巨噬细胞极化和中性粒细胞凋亡，可能通过免疫调节途径协同促进伤口修复，该机制需后续通过细胞实验进一步验证^［25］。

综上所述，本研究成功制备了LA-MPC深共晶凝胶，其可在较低温度（40 ℃）下成胶，有效避免了传统化学交联凝胶制备过程中高交联温度和引发剂潜在毒性的劣势，且在大鼠全层皮肤损伤模型中证实了其优异的伤口修复效果，为开发新型皮肤损伤敷料提供了实验依据与创新思路。

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基金资助

国家自然科学基金项目(32171336)

浙江省自然科学基金项目(LHDMY24H300002)