高效液相色谱法同时测定竹根七中5种甾体皂苷的含量

Simultaneous determination of 5 steroidal saponin components in Rohdea chinensis Baker. by high-performance liquid chromatography

摘要

目的 建立高效液相色谱法（high-performance liquid chromatography， HPLC），同时测定竹根七中5种甾体皂苷成分的含量。 方法 采用Thermo HyPURITY C₁₈色谱柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm）；以乙腈-水为流动相，梯度洗脱；流速为1.0 mL·min^-1；检测波长为203 nm；柱温为25 ℃；进样量为10 μL。 结果 竹根七中5种甾体皂苷tupisteroide B、（25R）-26-O-β-d-glucopyranosyl-furost-1β， 3β， 26-trihydroxy-5（6）， 20（22）-dien-3-O-β-d-glucopyranoside、spirost 25（27）-ene-1β， 2β， 3β， 4β， 5β， 6β， 7α-heptol、aspidoside A、1β， 2β， 3β， 4β， 5β， 7α-hexahydroxy-spirost-25（27）-ene-6-one的线性范围分别为0.06~1.50、0.06~1.08、0.58~3.88、0.07~2.25、1.54~45.24 μg（r≥0.999 6）；平均加样回收率依次为98.59%、99.25%、99.44%、98.33%、99.63%，相对标准偏差（relative standard deviation， RSD）分别为1.07%、0.86%、1.42%、0.90%、1.74%。 结论 建立的含量测定方法简便可靠、重复性良好，可为竹根七的质量控制及开发利用提供科学依据。

Abstract

Objective To establish a high-performance liquid chromatography （HPLC） method for the simultaneous determination of 5 steroidal saponins in Rohdea chinensis Baker.. Methods The analysis was performed on a Thermo HyPURITY C18 column （250 mm×4.6 mm， 5 μm） maintained at 25 °C. A gradient elution program was employed using acetonitrile and water as the mobile phase， at a flow rate of 1.0 mL·min^-¹. The detection wavelength was set at 203 nm， and the injection volume was 10 μL. Results The 5 steroidal saponins： tupisteroide B， （25R）-26-O-β-d-glucopyranosyl-furost-1β， 3β， 26-trihydroxy-5（6）， 20（22）-dien-3-O-β-d-glucopyranoside， spirost 25（27）-ene-1β， 2β， 3β， 4β， 5β， 6β， 7α-heptol， aspidoside A， 1β， 2β， 3β， 4β， 5β， 7α-hexahydroxy-spirost-25（27）-ene-6-one showed good linearity within the ranges of 0.06-1.50， 0.06-1.08， 0.58-3.88， 0.07-2.25， and 1.54-45.24 μg （r≥0.999 6）. The average recoveries were 98.59%， 99.25%， 99.44%， 98.33%， and 99.63%， with corresponding relative standard deviation （RSD） of 1.07%， 0.86%， 1.42%， 0.90%， and 1.74%， respectively. Conclusion The developed HPLC method is simple， reliable， and reproducible， and can serve as a reference for the development and utilization of these 5 steroidal saponins from Rohdea chinensis Baker..

Graphical abstract

关键词

竹根七 / 甾体皂苷 / 高效液相色谱法 / 含量测定

Key words

Rohdea chinensis Baker. / steroidal saponins / high-performance liquid chromatography / content determination

竹根七为百合科开口箭属植物开口箭Rohdea chinensis Baker.的干燥根及根茎，又名开口箭、苞谷七等，为秦巴山区特色“太白七药”之一。该药材全年均可采收，除去须根及叶片后，取根茎晒干备用，具有清热解毒、祛风除湿、散瘀止痛的功效，临床常用于咽喉肿痛、风湿痹痛、毒蛇咬伤等病症的治疗^［1］。现代药理研究发现，竹根七的化学成分主要包括甾体皂苷类、黄酮类、强心苷类等^［2-8］，其药理活性广泛，涵盖抗肿瘤、抗炎镇痛、抑菌、改善心血管功能及调节免疫等，其中甾体皂苷类成分是其发挥药效的主要物质基础，尤其在抗肿瘤方面表现出良好的活性^［9-12］。

目前，竹根七已被《陕西省药材标准》（2015年版）、《广西壮族自治区瑶药材质量标准（第一卷）》收录，但现有标准均未设置含量测定项目，且主成分不明确，薄层鉴别所用的对照品缺乏特征性，难以实现对其质量的有效控制，在一定程度上限制了其开发和利用。化学成分含量是中药材质量评价的重要指标，而现有相关研究多仅以单一成分为指标进行含量测定^［13］，难以全面反映竹根七的整体质量。基于此，本课题组在前期研究的基础上^［14］，聚焦甾体皂苷类活性成分，建立高效液相色谱（high-performance liquid chromatography， HPLC）同时测定竹根七中5种甾体皂苷的含量，以期为该药材质量控制体系的构建及进一步开发利用提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters e2695型高效液相色谱仪（美国Waters公司）；101-A4型电热鼓风干燥箱（上海捷呈实验仪器有限公司）；GB204型电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-500DE型超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限责任公司）；KEWE型电热恒温水浴锅（北京科伟永兴有限公司）；DYF-200A型高速万能粉碎机（上海比朗仪器有限公司）。

1.2 试药

tupisteroid B、（25R）-26-O-β-d-glucopyranosyl-furost-1β， 3β， 26-trihydroxy-5（6），20（22）-dien-3-O-β-d-glucopyranoside、spirost 25（27）-ene-1β， 2β， 3β， 4β， 5β， 6β， 7α-heptol、aspidoside A、 1β， 2β， 3β， 4β， 5β， 7α-hexahydroxy-spirost-25（27）-ene-6-one对照品均为实验室自制，质量分数经HPLC峰面积归一化法测定，均>98%，符合定量要求^［14］；甲醇、乙腈，均为色谱纯，均购自天津市科密欧化学试剂有限公司；纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）。

13批竹根七样品分别采自陕西、甘肃、四川等地，经陕西中医药大学王薇教授鉴定为百合科植物开口箭Rohdea chinensis Baker.的干燥根及根茎。具体信息见表1。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用Thermo HyPURITY C₁₈色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）-水（B），梯度洗脱程序为0~15 min， 15% A→20% A； 15~25 min，20% A→23% A； 25~30 min， 23% A→24% A；30~36 min， 24% A→24% A； 36~40 min， 24% A→28% A； 40~46 min， 28% A→30% A； 46~55 min， 30% A→34% A； 55~60 min， 34% A→40% A； 60~70 min， 40% A→43% A； 70~76 min， 43% A→52% A； 76~85 min， 52% A→55% A； 85~90 min， 55% A→60% A； 流速为1.0 mL·min^-1；检测波长为203 nm；柱温为25 ℃；进样量为10 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液

取tupisteroide B、（25R）-26-O-β-d-glucopyranosyl-furost-1β， 3β，26-trihydroxy-5（6），20（22）-dien-3-O-β-d-glucopyranoside、 spirost 25（27）-ene -1β， 2β， 3β， 4β，5β， 6β， 7α-heptol、 aspidoside A、 1β， 2β， 3β， 4β， 5β， 7α-hexahydroxy-spirost-25（27）-ene-6-one对照品适量，精密称定，置于同一10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，制成质量浓度分别为0.06、0.04、0.16、0.09、0.31 mg·mL^-1的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液

取竹根七粉末（过5号筛）约0.5 g，精密称定，置于100 mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20 mL，密塞后精密称定质量，超声处理（功率250 W，频率60 kHz）45 min，冷却至室温后，再精密称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，经0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。

2.3 专属性考察

取上述对照品溶液和供试品溶液适量，按照2.1项下色谱条件进样测定，见图1。结果表明，对照品与混合对照品溶液中色谱峰出峰时间一致。在本研究条件下，各成分间的分离度良好，理论塔板数按tupisteroide B计算不低于4 000。

2.4 线性关系考察

精密吸取混合对照品溶液，用甲醇依次稀释2倍，制备系列质量浓度混合对照品溶液。按照2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱峰面积。以进样量为横坐标（x）、峰面积为纵坐标（y）进行线性回归，得回归方程和线性范围；以信噪比（signal-to-noise ratio，S/N）=3计算检测限（limit of detection，LOD），S/N=10计算定量限（limit of quantification，LOQ），结果见表2。5种成分在各自线性范围内的线性关系良好（r≥0.999 6）。

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度实验

取2.2.1项下制备的混合对照品溶液适量，按照2.1项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积。结果显示，5种成分峰面积的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）分别为1.78%、1.74%、1.19%、1.57%、0.81%，表明仪器的精密度良好。

2.5.2 重复性实验

取竹根七样品（S1）粉末6份，精密称定，按照2.2.2项下方法平行制备供试品溶液，按照2.1项下色谱条件进样测定并计算含量。结果显示，5种成分的平均含量分别为4.502 0、4.031 5、5.765 8、3.032 0、186.868 0 mg·g^-1，RSD分别为1.82%、1.75%、1.60%、1.64%、1.30%，表明该方法的重复性良好。

2.5.3 稳定性实验

取竹根七样品（S1）粉末适量，精密称定，按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，分别于室温下放置0、2、4、8、12、24 h后，按照2.1项下色谱条件分别进样测定，记录峰面积。结果显示，5种成分峰面积RSD分别为1.52%、1.65%、1.05%、1.55%、0.83%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.5.4 加样回收率实验

精密称取已知含量的竹根七（粉末）3份，每份约0.5 g，分别精密加入高、中、低质量浓度的混合对照品溶液，按照2.2.2项下方法制成供试品溶液，按照2.1下项色谱条件进样测定。结果显示，5种成分的平均加样回收率为98.33%~99.63%，RSD<2%，符合定量分析要求。具体结果见表3。

2.6 样品含量测定

取13批不同产地竹根七药材，每份约0.5 g，按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，按照2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，计算5种成分的含量，结果见表4。5种成分含量排序依次为：1β， 2β， 3β， 4β， 5β， 7α-hexahydroxy-spirost-25（27）-ene-6-one>spirost25（27）-ene-1β，2β，3β，4β，5β，6β，7α-heptol>（25R）-26-O-β-d-glucopyranosyl-furost-1β，3β，26-trihydroxy-5（6），20（22）-dien-3-O-β-d-glucopyranoside>aspidoside A>tupisteroide B。

3 讨论

3.1 提取条件的优化

在竹根七提取条件的系统优化中，通过比较不同溶剂（甲醇、乙醇）与提取方法（超声、回流），确定以甲醇为溶剂并结合超声提取法效果更佳，并进一步优化得出最佳条件为超声功率250 W、时间45 min，该条件可高效提取甾体皂苷类化合物，为后续HPLC定量分析提供了稳定、高效的样品前处理技术支撑。

3.2 色谱条件的优化

HPLC的分离效果是成分准确定量的关键，其核心依赖于流动相体系、洗脱梯度及柱温等参数的协同调控。本研究通过系统考察不同流动相、洗脱比例及柱温等关键参数对目标成分保留行为的影响，确定了2.1项下色谱条件对5种甾体类成分的分离效果良好且稳定。方法学验证结果表明，5种甾体成分线性关系、精密度、稳定性、重复性及加样回收率均符合要求，确保了检测方法的准确、可靠。

3.3 含量测定与质量评价

基于优化后的提取条件和色谱条件，本研究对13批来自主要分布区域的竹根七样品进行了5种甾体皂苷类成分的含量测定。结果显示，不同产地竹根七中5种甾体皂苷类成分的含量存在显著性地理差异，其中陕西凤县产竹根七的5种甾体成分含量均较高，表明该区域可能为竹根七的道地产区。这种含量差异性可能与产地的气候条件、土壤理化性质及海拔等环境因子密切相关。该研究结果不仅为竹根七药材的道地产区筛选、规范化种植基地建设提供了科学依据，也为药材采集、资源合理利用及保护策略制订提供了数据支撑，有助于实现竹根七药用资源的可持续开发。

综上所述，本研究以自制的5种甾体皂苷类成分对照品为定量指标，通过系统优化提取条件与色谱条件，建立了竹根七中目标成分的HPLC含量测定方法，该方法操作简便、准确可靠，可为竹根七药材的质量控制体系构建、质量评价标准制订及药用资源的深度开发利用提供科学参考。

参考文献

[1] 宋小妹，刘海静.太白七药研究与应用［M］.北京：人民卫生出版社，2011．

[2] LU Y， HE X， LIU Y，et al. Steriodal saponins from the rhizomes of Tupistra chinensis Baker［J］. Phytochemistry，2023，207：113583．

[3] YAO S F， ZHANG H B， CAI Z S，et al. Two new steroidal sapogenins from Rohdea chinensis （synonym Tupistra chinensis） rhizomes and their antifungal activity［J］. J Asian Nat Prod Res，2022，24（2）：153-162．

[4] 肖艳华，张广杰，宗良，等.开口箭化学成分及抗肿瘤活性［J］.高等学校化学学报，2019，40（9）：1897-1903．

[5] XIAO Yanhua， ZHANG Guangjie， ZONG Liang，et al ．Chemical constituents and antitumor activity of Tupistra chinensis ［J］. Chemical Journal of Chinese Universities，2019，40（9）：1897-1903．

[6] PAN W B， CHANG F R， WEI L M，et al. New flavans，spirostanol sapogenins，and a pregnane genin from Tupistra chinensis and their cytotoxicity［J］. J Nat Prod，2003，66（2）：161-168．

[7] PAN W B， WEI L M， WEI L L，et al. Chemical constituents of Tupistra chinensis Rhizomes［J］. Chem Pharm Bull，2006，54（7）：954-958．

[8] PAN Z H， LI Y， LIU J L，et al. A cytotoxic cardenolide and a saponin from the rhizomes of Tupistra chinensis ［J］．Fitoterapia，2012，83（8）：1489-1493．

[9] 吴国庆，樊浩，李玉泽，等.竹根七的化学成分及药理作用研究进展［J］.中国野生植物资源，2020，39（10）：50-60．

[10] WU Guoqing， FAN Hao， LI Yuze，et al. Research progress on chemical constituents and pharmacological activities of Tupistra chinensis baker［J］. Chinese Wild Plant Resources，2020，39（10）：50-60．

[11] SAMANTARAY A， PRADHAN D. Tupistra chinensis a traditional Chinese plant suppresses tumor growth and metastasis in vitro against ER positive and triple negative breast cancer［J］. Pharmacol Res Mod Chin Med，2024，10：100368．

[12] 谭刚，杨业玉，李建军. 开口箭抗炎镇痛作用实验研究［J］.实用中医药杂志，2013，29（7）：513-515．

[13] TAN Gang， YANG Yeyu， LI Jianjun. Experimental study on anti-inflammatory and analgesic effect of Tupistra chinensis Bak.［J］. Journal of Practical Traditional Chinese Medicine，2013，29（7）：513-515．

[14] YE T S， WANG X P， ZHANG X M，et al. Saponin from Tupistra chinensis Bak. inhibits NF-κB signaling in sarcoma S-180 cell mouse xenografts［J］. Curr Med Sci，2018，38（4）：697-703．

[15] 石孟琼，金家红，黄晓飞，等. 开口箭总皂苷对异丙肾上腺素致大鼠心肌肥厚的保护作用［J］. 中药药理与临床，2013，29（2）：64-69．

[16] SHI Mengqiong， JIN Jiahong， HUANG Xiaofei，et al ．Protective effects of total saponin total saponin from Tupistra chinensis Bak. on isoproterenol-induced myocardial hypertrophy in rats［J］. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica，2013，29（2）：64-69．

[17] 郭琳，李玉泽，毛昭琦，等.竹根七药材质量标准研究［J］.陕西中医，2018，39（12）：1818-1822．

[18] GUO Lin， LI Yuze， MAO Zhaoqi，et al. Quality standard of Tupistra chinensis baker［J］. Shaanxi Journal of Traditional Chinese Medicine，2018，39（12）：1818-1822．

[19] 李玉泽，梁小飞，王西林，等.竹根七化学成分的研究［J］.中成药，2019，41（10）：2383-2388．

[20] LI Yuze， LIANG Xiaofei， WANG Xilin，et al. Study on the chemical components of Tupistra chinensis baker［J］.Chinese Traditional Patent Medicine，2019，41（10）：2383-2388．

基金资助

国家自然科学基金项目(82405009)

陕西省科技厅项目(2024JC-YBQN-0860)

陕西中医药大学创新团队项目(2023-CXTD-05)