基于特征图谱和化学计量学的不同基原地榆的评价

Evaluation of different origins of garden burnet root based on characteristic chromatograms and chemometrics

摘要

目的 通过比较不同基原地榆的酚类成分，明确其特征成分的差异特征，为地榆药材的基原鉴别及质量评价提供科学依据。 方法 采用超高效液相色谱法（ultra performance liquid chromatography， UPLC）构建地榆药材酚类成分的特征图谱分析方法，结合聚类分析、主成分分析（principal component analysis， PCA）进行样本分类，采用正交偏最小二乘法判别分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis， OPLS-DA）筛选不同基原地榆药材的差异化学标志物。 结果 聚类分析和PCA模型的分类结果一致，除江西产地的C18~C20号样本外，地榆和长叶地榆两个基原样本可各自聚为一类；通过OPLS-DA筛选出峰7、峰8为两个基原的差异标志性成分，其中峰8的相对峰面积比值可作为区分地榆两个基原的关键鉴别指标。 结论 建立的UPLC特征图谱结合化学计量学统计分析方法，可准确实现地榆药材的基原分类和鉴别，为地榆相关产品的质量控制与评价提供可靠支撑。

Abstract

Objective The different chemical markers were obtained by comparing the phenolic components from different origins of garden burnet root， and to provide a basis for the origin identification and quality evaluation of Garden Burnet Root. Methods The ultra-performance liquid chromatography （UPLC） method was established to obtain the characteristic chromatograms of phenolic components. Furthermore， cluster analysis and principal component analysis （PCA） were performed to classify the samples， and the different chemical markers were obtained from orthogonal partial least squares discriminant analysis （OPLS-DA）. Results The classification results of cluster analysis and PCA model were consistent， and 2 classes of samples were clustered separately except for C18~C20 from Jiangxi Province. In addition， peak 7 and peak 8 were selected as chemical markers by OPLS-DA analysis， and the relative peak area ratio of peak 8 could be used as the identification point of the 2 different origins of garden burnet root. Conclusion The established method can accurately classify and identify the materials of garden burnet root， and provide a basis for the quality control of related products.

Graphical abstract

关键词

地榆 / 基原鉴别 / 酚类成分 / 超高效液相色谱法 / 特征图谱 / 化学计量学

Key words

garden burnet root / origin identification / phenolic components / ultra performance liquid chromatography / characteristic chromatograms / chemometrics

我国中药材品种繁多、资源丰富，但“同名异物”“同物异名”“一药多源”等现象普遍存在，导致市场中流通的中药材存在品种混乱、质量参差不齐等问题，因此建立科学、有效的种属鉴别与质量评价方法具有重要意义。

地榆为传统常用中药材，药用部位为蔷薇科地榆属植物的干燥根，全球地榆属植物约有30种，主要分布于欧洲、亚洲及北美地区^［1-2］。该药材具有凉血止血、解毒敛疮等功效，临床常用于便血、痔血、血痛、崩漏、水火烫伤、痈肿疮毒等病症的治疗^［3-5］。我国地榆属植物共有8个种，包括地榆、长叶地榆、细叶地榆、粉花地榆、白花地榆、大白花地榆、小白花地榆、宽蕊地榆，另有混淆品白叶地榆、紫地榆^［6-8］。其中，地榆（Sanguisorba officinalis L.）与长叶地榆［Sanguisorba officinalis L. var. longifolia （Bertol.） Yü et Li］为《中华人民共和国药典》（2020年版）收载的法定基原。由于两种基原植物经产地初加工后，形态特征、断面颜色等差异不显著，仅通过性状鉴别难以精准区分。且前期研究发现，长叶地榆作为地榆的变种，二者主导单倍型差异很小，基于DNA的鉴别方法也难以实现二者的精准区分^［8-11］。

地榆的化学成分复杂，主要含酚类、三萜类、黄酮类、有机酸和单萜烯醇苷等，其中鞣质和酚酸类化合物为其核心化学活性成分，具体包括没食子酸鞣质、鞣花鞣质、没食子酸（甲基）葡萄糖苷、黄烷-3-醇类衍生物等^［12-23］。特征图谱/指纹图谱结合多变量统计分析技术，已广泛应用于中药材不同基原、产地、混淆品及炮制品的质量差异评价，可有效筛选差异标志物并进行定性定量分析^［24-30］。为明确地榆两种基原药材的特征成分差异及关键差异标志物，本研究建立地榆药材酚类成分特征图谱，结合聚类分析、主成分分析（principal component analysis， PCA）、正交偏最小二乘法-判别分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis， OPLS-DA）等多变量统计方法，对地榆和长叶地榆两种基原的特征成分差异进行系统评价，明确其差异标志物，为地榆两种基原的精准鉴别及质量评价体系构建提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters ACQUITY UPLC H-Plus型超高效液相色谱仪（美国沃特世公司）；DL-98-2型万用电炉（天津泰斯特仪器有限公司）；KQ-500DE型数控超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；XPE205DR/XSE204型电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 试药

没食子酸（批号110831-201906，质量分数为91.5%）、儿茶素（批号110877-202005，质量分数为95.1%）、鞣花酸（批号111959-201903，质量分数为88.8%）、地榆（地榆）对照药材（批号121286-201703），均购自中国食品药品检定研究院；没食子儿茶素（批号MUST-18050810，质量分数为98.57%，成都曼思特生物科技有限公司）；2，3，8-三-O-甲基鞣花酸（批号PS230510-01，质量分数≥95%，成都普思生物科技股份有限公司）；乙腈（色谱纯）、磷酸（色谱纯），均购自美国Fisher公司；实验室用水为超纯水。

共收集地榆属药材43批，其中23批经中药质量研究国家重点实验室（澳门科技大学）鉴定为蔷薇科植物地榆（Sanguisorba officinalis L.）的干燥根，产地信息见表1；20批经中药质量研究国家重点实验室（澳门科技大学）及广州中医药大学黄海波副教授联合鉴定为长叶地榆［Sanguisorba officinalis L. var. longifolia （Bert.） Yü et Li］的干燥根，产地信息见表2。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用Waters ACQUITY UPLC^® HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）色谱柱；流动相为乙腈（A）-1 mL‧L^-1磷酸溶液（B），梯度洗脱程序：0~15 min，2% A→10% A；15~30 min，10% A→20% A；30~35 min，20% A→35% A；35~45 min，35% A→45% A；流速为0.3 mL‧min^-1；柱温为30 ℃；检测波长为230 nm；进样量为10 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照药材溶液及混合对照品溶液

取地榆对照药材和长叶地榆对照药材各约0.2 g，精密称定，分别置于具塞锥形瓶中，加水25 mL，加热回流提取30 min，放冷后滤过，精密量取滤液15 mL，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次25 mL，合并乙酸乙酯提取液，减压蒸干。残渣加入体积分数为75%甲醇溶液使其溶解，转移至10 mL量瓶中，用体积分数为75%甲醇定容至刻度，摇匀后滤过，取续滤液作为对照药材溶液。

另取没食子酸、儿茶素、鞣花酸对照品适量，精密称定，加入体积分数为50%甲醇溶解并稀释，制成各成分质量浓度均为40 μg‧mL^-1的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液

取表1和表2中43批药材粉末（过4号筛）各约0.2 g，精密称定，分别置于具塞锥形瓶中，加水25 mL，超声处理（功率500 W，频率40 kHz）30 min，放冷后摇匀滤过，精密量取续滤液15 mL，按照2.2.1项下对照药材溶液制备方法，自“用乙酸乙酯振摇提取2次”起，同法操作，制成供试品溶液。

2.3 共有特征峰的指认和参照峰的选择

采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（ultra-high pressure liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry， UHPLC-Q-TOF MS）技术，结合二级质谱解析及对照品比对，对特征峰进行鉴定。最终指认峰1为没食子酸、峰2为没食子儿茶素、峰4为儿茶素、峰6（S）为鞣花酸、峰8为2，3，8-三-O-甲基鞣花酸，见图1。其中，峰1归属没食子酸鞣质类，峰2、峰4、峰6、峰8归属酚酸类^［12-23］。鉴于鞣花酸（峰6）出峰时间居中、峰形对称且峰面积稳定，选定其作为参照峰，计算各共有特征峰的相对保留时间与相对峰面积。

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性考察

按照2.2项下方法制备对照品溶液和供试品溶液；另取体积分数为75%甲醇作为阴性对照溶液。上述溶液均按照2.1项下色谱条件进样测定。结果显示，阴性对照溶液在供试品各特征峰对应保留时间处无干扰峰，表明该方法的专属性良好。见图1。

2.4.2 精密度考察

精密吸取同一份供试品溶液，按照2.1项下色谱条件连续进样6次，测定特征图谱。结果显示，8个共有峰的相对保留时间的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）均<0.23%，相对峰面积的RSD均<1.26%，表明仪器的精密度良好。

2.4.3 重复性考察

精密称取同一批号地榆药材粉末6份，按照2.2.2项下方法平行制备供试品溶液，按照2.1项下色谱条件进样测定特征图谱。结果显示，8个共有峰相对保留时间的RSD均<0.81%，相对峰面积的RSD均<2.93%，表明该方法的重复性良好。

2.4.4 稳定性考察

精密吸取同一份供试品溶液，分别于室温放置0、5、10、15、20、24 h，按照2.1项下色谱条件进样测定特征图谱。结果显示，8个共有峰相对保留时间的RSD均<0.96%，相对峰面积的RSD均<2.50%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.5 样品特征图谱的测定

取地榆与长叶地榆两种基原的43批药材，分别按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，按照2.1项下色谱条件进样测定特征图谱，典型特征图谱见图2，各共有特征峰的相对峰面积数据见表3、表4。

2.6 数据分析

2.6.1 聚类分析

以峰6（鞣花酸）为参照峰，选取两种基原药材（地榆D1~D23、长叶地榆C1~C20）中8个共有峰的相对峰面积为变量，对原始数据进行Z-score标准化后，采用SPSS 29.0 软件进行聚类分析，采用组间连接法，以欧式距离作为样本相似性测度进行聚类分析。结果见图3。

当欧式距离为15时，43批药材可分为5类：第Ⅰ类为地榆基原（D1~D23），产自甘肃、新疆；第Ⅱ类为长叶地榆基原（C18、C19），产自江西九江、赣州；第Ⅲ类为长叶地榆基原（C1~C8、C12~C17），产自山东、江苏、浙江；第Ⅳ类为长叶地榆基原（C9~C11），产自安徽滁州、六安、安庆；第Ⅴ类为长叶地榆基原（C20），产自江西九江。结果显示，除安徽、江西产地的长叶地榆质量差异较显著外，地榆和长叶地榆两个基原可各自聚类。地榆基原主产地集中于甘肃陇西，新疆吐鲁番也有分布，且产地间质量差异较小；长叶地榆基原产地分布广泛，产地间质量差异明显，其中江西、安徽产地与其他产地差异较大，山东、江苏、浙江产地质量相近。

2.6.2 PCA分析

以峰6为参照峰，以两种基原药材（地榆D1~D23、长叶地榆C1~C20）中8个共有峰的相对峰面积为变量，将数据导入SIMCA 18.0软件，采用非监督模式识别法进行PCA分析。模型自动拟合选择3个主成分，累积方差贡献率为89.9%，提示模型的预测能力良好，见图4。由图4可见，除江西产地的C18~C20号样本外，地榆和长叶地榆两个基原样本可各自聚为一类，两类样本之间差异显著，该结果与聚类分析的结果一致。

2.6.3 OPLS-DA分析

以峰6为参照峰，以两种基原药材（地榆D1~D23、长叶地榆C1~C20）中8个共有峰的相对峰面积为变量，通过SIMCA 18.0软件进行OPLS-DA分析，筛选差异化合物。地榆组与长叶地榆组的模型参数为R²X＝0.837，R²Y＝0.865，Q²＝0.829，见图5。OPLS-DA得分图（图5-A）显示，所有样本均集中分布于95%置信区间内，模型拟合效果良好；C20号样本为圈外离群点，其与其他样本存在一定差异，但该离群点未超出95%置信区间，故予以保留。S-plot图（图5-B）显示，峰2（没食子儿茶素）、峰4（儿茶素）、峰7（未知峰）、峰8（2，3，8-三-O-甲基鞣花酸）位于S-plot图的两端，提示可能为差异标志物。构建OPLS-DA的模型验证实验，设置检验次数为200次，置换检验（图5-C）结果显示，随机模型的Q²值均小于原模型，表明模型稳定性良好、拟合性良好。根据变量权重重要性（variable importance in the projection，VIP）排序图（图5-D），提取VIP>1的变量（峰7、峰8），经t检验验证，两者的P值均<0.05，存在显著性差异，提示峰7、峰8为区分两种基原的关键差异标志物。

2.7 两种基原地榆药材的鉴别

根据OPLS-DA分析结果，对峰7、峰8的的相对峰面积数据进行比较。结果显示，两种基原的峰7相对峰面积实际范围存在重叠，而峰8相对峰面积实际范围无重叠，故选择峰8的相对峰面积作为两种基原的鉴别指标。见表5。

结合实际数据分布，制订峰8相对峰面积限度：以23批地榆药材峰8与峰6（S）的平均峰面积比值-1.4倍标准差（standard deviation，SD）为下限，以峰8与峰6（S）的平均峰面积比值＋3倍SD为上限，规定地榆药材峰8相对峰面积限度为0.060~0.230。以20批长叶地榆峰8与峰6（S）的平均峰面积比值-1倍SD为下限（下限取整），以峰8与峰6（S）的平均峰面积比值＋3倍SD为上限，规定长叶地榆药材峰8的相对峰面积限度为0~0.057。验证结果显示，20批长叶地榆峰8的相对峰面积实际范围为0~0.057（在规定的0~0.057范围内），23批地榆药材峰8的相对峰面积实际范围为0.072~0.208（在规定的0.060~0.230范围内），可实现两种基原的精准鉴别。

3 讨论

3.1 供试品前处理方法的考察

本研究首先对提取溶剂进行优化，比较体积分数30%、50%、75%的甲醇溶液，纯甲醇及水的提取效果。结果显示，以水为提取溶剂时，色谱基线平稳，各特征峰的峰形良好，故选定水作为提取溶剂。进一步比较超声提取与回流提取两种方式，发现两者所得色谱峰的响应值无显著差异，结合超声提取操作简便、高效的优势，确定提取方式为超声提取。对超声提取时间（15、30、60 min）进行考察，结果表明不同提取时间下色谱图形态、特征峰数量基本一致，峰响应值差异较小，综合考虑提取完全性与效率，最终选定提取时间为30 min。

3.2 检测波长的选择

已有研究证实，地榆的主要化学成分为没食子酸鞣质类和酚酸类化合物^［12-23］。本研究采用光电二极管阵列检测器进行紫外全波长扫描，结果显示在230 nm波长处，色谱峰的种类丰富，且各特征峰的分离度良好、峰形对称，故确定230 nm为检测波长。

3.3 耐用性考察

本研究系统考察了不同色谱柱（Waters ACQUITY UPLC^® HSS T3、Agilent ZORBAX SB-C₁₈、Agilent ZORBAX Eclipse Plus C₁₈）、柱温浮动（25~35 ℃）、流速变化（0.28~0.32 mL‧min^-1）对8个共有特征峰的影响。结果显示，上述条件变化时，除峰1外，其余特征峰的相对保留时间和相对峰面积均无显著差异。由于峰1出峰时间较短，虽受柱温、色谱柱品牌影响较大，但该峰为已知成分峰，可通过与对照品保留时间直接比对进行确认，故无需规定其相对保留时间，表明该方法耐用性良好。

3.4 结果分析

本研究建立了两种基原地榆药材的UPLC酚酸类成分特征图谱，并结合多变量统计分析进行模式识别。聚类分析与PCA结果一致，除安徽、江西产地的长叶地榆质量差异显著外，地榆和长叶地榆两个基原可实现有效聚类。推测安徽、江西产地长叶地榆质量差异明显可能与生长年限相关，后续需进一步开展生长年限与药材质量的关联性研究。通过OPLS-DA筛选出峰7、峰8为两种基原的关键差异标志物，其中峰8与峰6的峰面积比值，可作为区分地榆与长叶地榆的核心鉴别指标。

4 结论

本研究以地榆、长叶地榆两种基原的43批药材为研究对象，建立了稳定、可靠的酚类成分UPLC特征图谱测定方法，该方法准确性高、重复性好，可全面表征地榆药材的酚类成分整体质量。结合聚类分析、PCA、OPLS-DA等化学计量学方法，成功筛选出两种基原的质量差异标志物，建立了精准的基原鉴别方法，为地榆药材的基原区分、质量控制及临床合理应用提供了科学依据。

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基金资助

2023年广西科技重大专项课题（编号：桂科AA23023035-5）