大苞荆芥化学成分的研究

Studies on the chemical constituents of Nepeta bracteata Benth.

摘要

目的 研究荆芥属植物大苞荆芥（Nepeta bracteata Benth.）的化学成分及其抗炎活性。 方法 采用十八烷基硅烷键合硅胶（octadecylsilyl， ODS）柱色谱、硅胶柱色谱、半制备高效液相色谱等技术对大苞荆芥体积分数95%乙醇提取物进行分离纯化，结合理化性质及核磁共振、质谱等波谱技术鉴定化合物结构；采用脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7模型对所得化合物进行抗炎活性筛选。 结果 从大苞荆芥95%乙醇提取物中分离得到10个化合物，分别鉴定为3-（4’-甲酰基苯氧基）-4-甲氧基苯甲醛（1）、水杨酸（2）、（E）-3-（4-羟基苯基）丙烯酸乙酯（3）、2，6，2’，6’-四甲氧基-4，4’-双（2，3-环氧-1-羟丙基）联苯（4）、5-羟甲基糠醛（5）、反式-3-甲氧基-4-羟基肉桂酸（6）、耻骨甲素A（7）、coleolactone （8）、4-羟基-3，5-二甲氧基苯甲醛（9）、ethyl 3，4-dihydro-2-oxo-2H-pyrrole-5-carboxylate （10）。 结论 化合物1、4、6、7、8、10均为首次从荆芥属植物中分离获得；抗炎活性筛选结果显示，化合物3、6具有较强的抗炎活性，IC₅₀值分别为32.8、21.5 μmol·L^-1。

Abstract

Objective To study the chemical constituents of Nepeta bracteata Benth. . Methods The 95% ethanol extract of Nepeta bracteata Benth. was separated and purified using octadecylsilyl （ODS） column chromatography， silica gel column chromatography， and semi-preparative high-performance liquid chromatography. Compound structures were identified through physicochemical characterization and spectroscopic techniques including nuclear magnetic resonance （NMR） and mass spectrometry （MS）. The anti-inflammatory activity was screened by using lipopolysaccharide （LPS） induced mouse macrophage line RAW264.7. Results Ten compounds， including phenols， phenylpropionic acids and terpenes， were isolated from 95% ethanol extract of Nepeta bracteata Benth. and identified as 3-（4’-formylphenoxy）-4-methoxybenzaldehyde （1）， salicylic acid （2）， （E）-3-（4-hydroxyphenyl） ethyl acrylate （3）， 2，6，2’，6’-tetramethoxy-4，4’-bis （2，3-epoxy-1-hydroxypropyl） biphenyl （4）， 5-hydroxymethylfurfural （5）， 4-hydroxy-3-methoxy- phenylacrylic acid （6）， pubinernoid A （7）， coleolactone （8）， 4-hydroxy-3，5-dimethoxybenzaldehyde （9）， and ethyl 3，4-dihydro-2-oxo-2H-pyrrole-5-carboxylate （10）. Conclusion Compounds 1、4、6、7、8、10 were isolated from Nepeta bracteata Benth. for the first time. Compounds 3 and 6 showed strong anti-inflammatory activity， The IC₅₀ values were 32.8 μmol·L^-1 and 21.5 μmol·L^-1 respectively.

Graphical abstract

关键词

大苞荆芥 / 化学成分 / 分离鉴定 / 抗炎活性

Key words

Nepeta bracteata Benth. / chemical constituents / isolation and identification / anti-inflammation

大苞荆芥（Nepeta bracteata Benth.）为唇形科（Labiatae）荆芥属（Nepeta）植物，干燥全草入药，主要分布于巴基斯坦、尼泊尔和伊朗等国家，是新疆维吾尔医民间习用药材，维吾尔语名为“祖发”^［1］。该药材气微清香、味淡，性微湿，归肺、肝经^［2］。具有止咳平喘、清热除湿的功效，临床常用于支气管炎、呼吸道气管痉挛、小便不利等症状的治疗^［3］。

检索维普、中国知网（China National Knowledge Infrastructure，CNKI）等学术数据库发现，国内外关于大苞荆芥的研究文献报道较为有限。张萌等^［3］研究证实，大苞荆芥总多糖可显著抑制炎性细胞因子白细胞介素（interleukins，IL）-4、IL-6、IL-17的释放，推测这可能是该药材发挥治疗哮喘的重要作用机制之一。另有研究表明，大苞荆芥中的萜类成分具有较强的抗炎活性，其中ZHANG M等^［4］研究发现二萜类化合物是荆芥属植物发挥抗炎作用的物质基础，YANG E L等^［5］进一步明确松香烷型二萜类化合物为大苞荆芥抗炎活性的核心物质。

迄今为止，大苞荆芥的研究主要集中在药理活性层面，针对其化学成分的系统研究相对薄弱。为深入阐明该药材的药效物质基础，本研究对大苞荆芥体积分数95%乙醇粗提取物的二氯甲烷萃取部位进行系统分离纯化，并对得到的化合物进行抗炎活性筛选。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Bruker Avance Ⅲ 600型核磁共振波谱仪（德国Bruker公司）；Thermo Fisher LTQ-Obitrap XL型液质联用仪（美国Thermo Fisher公司）；Varioskan ALF型酶标仪（美国Thermo Fisher公司）；NIB900型倒置显微镜（宁波永新光学股份有限公司）；TG-21WC型台式高速离心机（山东高芯生物传感器研究院有限公司）；AL204型精密电子天平（济南鑫贝西生物技术有限公司）；JC-100-T型CO₂培养箱（青岛精诚仪器仪表有限公司）；BCM-1000A-Ⅱ型超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）。

1.2 材料

细胞培养瓶（美国Thermo Fisher公司）；96孔细胞培养板（上海碧云天生物技术有限公司）；柱色谱硅胶和薄层色谱用硅胶G、H、GF₂₅₄（青岛海洋化工有限公司）；HW-40C凝胶（北京兰博利德商贸有限公司）；MCI（日本三菱化学公司）。

大苞荆芥药材购自新疆维吾尔自治区麦迪森药业有限公司，经新疆维吾尔自治区药品检验研究院苏来曼·哈力克主任药师鉴定为唇形科荆芥属植物大苞荆芥（Nepeta bracteata Benth.）的干燥全草，凭证标本（编号：M20191025）现保存于新疆中药民族药研究所药材标本室。

鼠源性巨噬细胞系RAW264.7购自武汉普诺赛生命科技有限公司。

2 方法与结果

2.1 提取与分离

取大苞荆芥干燥全草6.0 kg，粉碎成段，按照料液比1∶3加入体积分数为95%乙醇冷浸提取，过滤后，药渣再用体积分数为95%乙醇连续回流提取3次，每次2 h，合并所有提取液，减压浓缩得总浸膏437.0 g。总浸膏用适量水分散后，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯进行梯度萃取，萃取液分别减压浓缩至干，得石油醚部位浸膏134.8 g、二氯甲烷部位浸膏67.4 g、乙酸乙酯部位浸膏56.3 g。

取二氯甲烷部位浸膏（67.4 g）进行硅胶柱色谱（100~200目）分离，以二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，收集得到11个流分（Fr.A1~Fr.A11）。Fr.A1 （15.0 g）经硅胶柱色谱（100~200目）进一步分离，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，得到7个亚流分（Fr.A1-1~Fr.A1-7）。Fr.A1-2通过半制备高效液相色谱（Hypersil GOLD色谱柱，250 mm×10 mm，5 μm；流动相：体积分数60%甲醇水溶液）分离，得到化合物1（1.9 mg）、化合物2 （3.6 mg）、化合物3 （1.0 mg）。Fr.A1-3 （12.0 g）经反相RP-18柱色谱分离，体积分数50%~100%甲醇水溶液梯度洗脱，得到4个组分（Fr.A1-3a~Fr.A1-3d）；其中Fr.A1-3a（1.0 g）经半制备高效液相色谱（Hypersil GOLD色谱柱，250 mm×10 mm，5 μm；流动相：体积分数38%甲醇水溶液）得到化合物9（1.4 mg）、化合物10 （1.2 mg）。Fr.A1-4 （2.2 g）经半制备高效液相色谱（Hypersil GOLD色谱柱，250 mm×10 mm，5 μm；流动相：体积分数40%甲醇水溶液）分离，得到化合物5 （2.0 mg）、化合物6 （1.2 mg）、化合物7（1.1 mg）。Fr.A1-5 （2.1 g）经半制备高效液相色谱（Hypersil GOLD色谱柱，250 mm×10 mm， 5 μm；流动相：体积分数40%甲醇水溶液）分离，得到化合物8 （2.2 mg）。Fr.A1-6 （1.8 g）经半制备高效液相色谱（Hypersil GOLD色谱柱，250 mm×10 mm， 5 μm；流动相：体积分数60%甲醇水溶液）分离，得到化合物4（1.3 mg）。

2.2 结构鉴定

化合物1：黄色油状物；电喷雾电离质谱法（electrospray ionization mass spectrometry，ESI-MS） m/z： 279.0628 ［M＋Na］⁺。结合¹³C-核磁共振（¹³C-nuclear magnetic resonance，¹³C-NMR）、附着质子（attached proton test，APT）¹³C-NMR谱确定分子式为C₁₅H₁₂O₄。¹H-NMR （600 MHz， CDCl₃） δ： 7.44 （1H， d， J = 2.0 Hz， H-2）， 7.45 （1H， dd， J = 7.8， 1.8 Hz， H-4）， 7.06 （1H， d， J = 8.0 Hz， H-5）， 7.00 （2H， d， J = 8.4 Hz， H-2’/6’）， 7.82 （2H， d， J = 8.4 Hz， H-3’/5’）， 9.83 （1H， s， 4’-CHO）， 9.86 （1H， s， 6-CHO）， 3.97 （3H， s， 3-OCH₃）； ¹³C-NMR （150 MHz， CDCl₃） δ： 129.9 （C-1）， 108.9 （C-2）， 151.9 （C-3）， 127.9 （C-4）， 114.5 （C-5）， 147.3 （C-6）， 161.9 （C-1’）， 116.0 （C-2’/6’）， 132.5 （C-3’/5’）， 130.1 （C-4’）， 191.1 （4’-CHO）， 191.2 （6-CHO）， 56.3 （3-OCH₃）。以上数据与文献^［6］报道一致，故鉴定化合物1为3-（4’-甲酰基苯氧基）-4-甲氧基苯甲醛。

化合物2：黄色油状物；ESI-MS m/z： 161.020 9 ［M＋Na］⁺。结合¹³C-NMR、APT谱确定分子式为C₇H₆O₃。¹H-NMR （600 MHz， CDCl₃） δ： 7.02 （1H， brd， J = 8.0 Hz， H-3）， 7.52 （1H， dd， J = 7.8， 1.6 Hz， H-4）， 6.94 （1H， t， J = 7.4 Hz， H-5）， 7.93 （1H， dd， J = 8.0， 1.4 Hz， H-6）； ¹³C-NMR （150 MHz， CDCl₃） δ： 111.8 （C-1）， 162.3 （C-2）， 118.0 （C-3）， 137.0 （C-4）， 119.7 （C-5）， 131.1 （C-6）， 175.0 （1-COOH）。以上数据与文献^［7］报道一致，故鉴定化合物2为水杨酸。

化合物3：黄色油状物；ESI-MS m/z： 251.067 9 ［M＋Na］⁺。结合¹³C-NMR、APT谱确定分子式为C₁₁H₁₂O₃。¹H-NMR （600 MHz， CDCl₃） δ： 7.44 （2H， d， J = 9.0 Hz， H-2/6）， 6.85 （2H， d， J = 9.0 Hz， H-3/5）， 7.26 （1H， brs， 4-OH）， 7.65 （1H， d， J = 16.2 Hz， H-7）， 6.31 （1H， d， J = 16.2 Hz， H-8）， 4.28 （2H， q， J = 7.1 Hz， H-10）， 1.29 （3H， t， J = 7.1 Hz， H-11）； ¹³C-NMR （150 MHz， CDCl₃） δ： 127.5 （C-1）， 130.1 （C-2/6）， 125.1 （C-3/5）， 157.7 （C-4）， 116.0 （C-7）， 159.9 （C-8）， 167.6 （C-9）， 60.3 （C-10）， 14.5 （C-11）。以上数据与文献^［8］报道一致，故鉴定化合物3为（E）-3-（4-羟基苯基）丙烯酸乙酯。

化合物4：油状物；ESI-MS m/z： 441.152 0 ［M＋Na］⁺。结合¹³C-NMR、APT谱确定分子式为C₂₂H₂₆O₈。¹H-NMR （600 MHz， CDCl₃） δ： 6.58 （4H， s， H-3/3’/5/5’）， 4.73 （2H， d， J = 7.8 Hz， H-7/7’）， 5.54 （2H， brs， 7/7’-OH）， 3.09 （2H， m， H-8/8’）， 3.96 （2H， m， H-9a/9a’）， 4.27 （2H， m， H-9b/9b’）， 3.90 （12H， s， 2/2’/6/6’-OCH₃）； ¹³C-NMR （150 MHz， CDCl₃） δ： 132.2 （C-1/1’）， 147.3 （C-2/2’）， 102.8 （C-3/3’）， 134.3 （C-4/4’）， 102.7（C-5/5’）， 147.1 （C-6/6’）， 86.2 （C-7/7’）， 54.5 （C-8/8’）， 72.0 （C-9/9’）， 56.4 （2/2’/6/6’-OCH₃）。以上数据与文献^［9］报道一致，故鉴定化合物4为2，6，2’，6’-四甲氧基-4，4’-双（2，3-环氧-1-羟丙基）联苯。

化合物5：黄色固体；ESI-MS m/z： 149.020 9 ［M＋Na］⁺。结合¹³C-NMR、APT谱确定分子式为C₆H₆O₃。¹H-NMR （600 MHz， CDCl₃） δ： 9.60 （1H， s， H-1）， 7.25 （1H， d， J = 5.4 Hz， H-3）， 6.53 （1H， d， J = 3.0 Hz， H-4）， 4.73 （2H， s， H-6）； ¹³C-NMR （150 MHz， CDCl₃） δ： 177.9 （C-1）， 151.6 （C-2）， 125.1 （C-3）， 110.1 （C-4）， 160.4 （C-5）， 57.7 （C-6）。以上数据与文献^［10］报道一致，故鉴定化合物5为5-羟甲基糠醛。

化合物6：白色固体；ESI-MS m/z： 217.047 1 ［M＋Na］⁺。结合¹³C-NMR、APT谱确定分子式为C₁₀H₁₀O₄。¹H-NMR （600 MHz， CDCl₃） δ： 7.10 （1H， d， J = 1.8 Hz， H-2）， 6.89 （1H， d， J = 7.2 Hz， H-3）， 7.26 （1H， s， 4-OH）， 7.11 （1H， d， J = 1.8 Hz， H-6）， 7.69 （1H， d， J = 3.6 Hz， H-7）， 6.31 （1H， d， J = 15.6 Hz， H-8）， 3.94 （3H， s， 5-OCH₃）； ¹³C-NMR （150 MHz， CDCl₃） δ： 126.8 （C-1）， 126.3 （C-2）， 113.4 （C-3）， 148.6 （C-4）， 149.3 （C-5）， 117.0 （C-6）， 149.7 （C-7）， 114.1 （C-8）， 172.0 （C-9）， 56.1 （5-OCH₃）。以上数据与文献^［11］报道一致，故鉴定化合物6为反式-3-甲氧基-4-羟基肉桂酸。

化合物7：白色粉末；ESI-MS m/z： 219.099 2 ［M＋Na］⁺。结合¹³C-NMR、APT谱确定分子式为C₁₁H₁₆O₃。¹H-NMR （600 MHz， CDCl₃） δ： 1.54 （1H， dd， J = 14.6， 3.6 Hz， H-1a）， 1.99 （1H， m， H-1b）， 2.45 （1H， t， J = 4.8 Hz， H-3a）， 2.48 （1H， t， J = 4.8 Hz， H-3b）， 5.69 （1H， s， H-6）， 1.47 （3H， s， H-9）， 1.28 （3H， s， H-10）， 1.78 （3H， s， H-11）； ¹³C-NMR （150 MHz， CDCl₃） δ： 47.4 （C-1）， 66.9 （C-2）， 45.7 （C-3）， 87.0 （C-4）， 182.8 （C-5）， 113.0 （C-6）， 172.2 （C-7）， 36.1 （C-8）， 26.6 （C-9）， 30.8 （C-10）， 27.1 （C-11）。以上数据与文献^［12］报道一致，故鉴定化合物7为耻骨甲素A。

化合物8：白色无定型粉末；ESI-MS m/z： 205.083 5 ［M＋Na］⁺。结合¹³C-NMR、APT谱确定分子式为C₁₀H₁₄O₃。¹H-NMR （600 MHz， CDCl₃） δ： 2.03 （1H， dd， J = 12.0， 4.2 Hz， H-1a）， 1.43 （1H， t， J = 12.0 Hz， H-1b）， 4.22 （1H， dddd， J = 12.0， 9.0， 6.0， 4.0 Hz， H-2）， 2.70 （1H， dd， J = 19.0， 6.6 Hz， H-3a）， 2.11 （1H， dd， J = 19.0， 6.6 Hz， H-3b）， 3.83 （1H， d， J = 8.0 Hz， H-7a）， 4.10 （1H， d， J = 8.0 Hz， H-7b）， 1.23 （3H， s， H-9）， 2.11 （3H， s， H-10）； ¹³C-NMR （150 MHz， CDCl₃） δ： 41.3 （C-1）， 64.9 （C-2）， 42.3 （C-3）， 146.5 （C-4）， 126.2 （C-5）， 169.6 （C-6）， 78.4 （C-7）， 41.4 （C-8）， 25.8 （C-9）， 18.3 （C-10）。以上数据与文献^［13］报道一致，故鉴定化合物8为coleolactone。

化合物9：白色无定型粉末；ESI-MS m/z： 205.047 1 ［M＋Na］⁺。结合¹³C-NMR、APT谱确定分子式为C₉H₁₀O₄。¹H-NMR （600 MHz， CDCl₃） δ： 7.15 （2H， s， H-2/6）， 9.82 （1H， s， 7-CHO）， 3.98 （6H， s， 3/5-OCH₃）； ¹³C-NMR （150 MHz， CDCl₃） δ： 128.5 （C-1）， 106.8 （C-2/6）， 147.5 （C-3/5）， 140.9 （C-4）， 191.0 （7-CHO）， 56.6 （3/5-OCH₃）。以上数据与文献^［14］报道一致，故鉴定化合物9为4-羟基-3，5-二甲氧基苯甲醛。

化合物10：黄色油状物；ESI-MS m/z： 178.047 5 ［M＋Na］⁺。结合¹³C-NMR、APT谱确定分子式为C₇H₉NO₃。¹H-NMR （600 MHz， CDCl₃） δ： 2.66 （1H， dd， J = 6.0， 6.0 Hz， H-2a）， 2.84 （1H， m， H-2b）， 2.34 （1H， m， H-3a）， 2.67 （1H， dd， J = 6.0， 6.0 Hz， H-3b）， 3.70 （1H， m， H-6a）， 4.17 （1H， q， J = 6.0， 6.6 Hz， H-6b）， 1.27 （3H， t， J = 7.2 Hz， 7-CH₃）； ¹³C-NMR （150 MHz， CDCl₃） δ：172.6 （C-1）， 29.2 （C-2）， 26.8 （C-3）， 49.0 （C-4）， 177.8 （C-5）， 61.0 （C-6）， 14.3 （C-7）。以上数据与文献报道一致^［15］，故鉴定化合物10为ethyl 3，4-dihydro-2-oxo-2H-pyrrole-5-carboxylate。

化合物1~10的结构见图1。

2.3 抗炎活性筛选

取处于对数生长期的RAW264.7细胞，经体积分数0.25%胰蛋白酶消化后，用含体积分数10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的DMEM培养基调整细胞密度至10⁴个·mL^-1，以每孔200 μL接种在96孔细胞培养板中，置于37 ℃、含体积分数5% CO₂培养箱中孵育24 h。待细胞贴壁生长良好后，向各孔加入LPS，使其终质量浓度为1 μg·mL^-1，继续培养24 h后，以1 000 r·min^-1离心5 min，收集上清液备用。

用含体积分数10% FBS的DMEM培养液将对照品亚硝酸钠梯度稀释，同时将待测物样品稀释至系列浓度，按每孔50 µL分别加入96孔板中；随后各孔依次加入室温平衡后的Griess试剂Ⅰ液和Griess试剂Ⅱ液各50 µL，轻摇混匀，室温避光静置10 min，采用酶标仪于540 nm波长处测定各孔的吸光度值，根据标准曲线计算样品中的NO释放量。与阳性对照吲哚美辛比较，化合物3、6具有显著的抗炎活性，其IC₅₀分别为32.8、21.5 μmol·L^-1。见表2。

3 讨论

本研究采用硅胶柱色谱、反相RP-18柱色谱、半制备高效液相色谱等现代色谱分离技术，结合波谱鉴定手段，对大苞荆芥95%乙醇提取物的二氯甲烷萃取部位进行系统分离纯化与结构鉴定，共获得10个单体化合物。其中，化合物1［3-（4’-甲酰基苯氧基）-4-甲氧基苯甲醛］、化合物4［2，6，2’，6’-四甲氧基-4，4’-双（2，3-环氧-1-羟丙基）联苯］、化合物6（反式-3-甲氧基-4-羟基肉桂酸）、化合物7（耻骨甲素A）、化合物8（coleolactone）、化合物10（ethyl 3，4-dihydro-2-oxo-2H-pyrrole-5-carboxylate）均为首次从荆芥属植物中分离得到，丰富了该属植物的化学成分数据库。

为探究大包荆芥抗炎活性的物质基础，本研究采用LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症模型，通过Griess试剂法测定NO释放量，评价所得单体化合物的抗炎活性。结果显示，化合物3［（E）-3-（4-羟基苯基）丙烯酸乙酯］和化合物6均表现出较强的NO生成抑制活性，IC₅₀值分别为32.8、21.5 μmol·L^-1，进一步验证了荆芥属植物中含有的萜类化合物等成分可能是其抗炎作用的核心物质基础。对比化合物3和化合物6两者结构差异，推测甲氧基的连接位置可能是影响抗炎活性强弱的原因。

综上所述，本研究系统阐明了大苞荆芥的部分化学成分，明确了其中2个化合物的抗炎活性及结构-活性关联特征，为深入揭示该药材抗炎作用的物质基础提供了实验依据，也为其临床应用的拓展及后续新药研发奠定了基础。

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基金资助

“天山英才”医药卫生高层次人才培养计划(TSYC202301B045)