千斤拔挥发油抗氧化有效部位的筛选及其物质基础的解析

Screening of the antioxidant-active fractions of volatile oil from Moghaniae radix and their chemical profiling

摘要

目的 筛选千斤拔挥发油的抗氧化有效部位，并对其化学成分进行气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）解析。 方法 采用7种溶剂提取法提取千斤拔挥发油，通过体外抗氧化实验评价不同提取工艺所得挥发油的抗氧化活性，运用GC-MS技术对各挥发油组分进行化学成分定性分析。 结果 不同溶剂提取的千斤拔挥发油抗氧化活性存在显著差异，活性由强至弱依次为无水乙醇提取物>甲醇提取物>正丁醇提取物>乙酸乙酯提取物，二氯甲烷、石油醚、正己烷提取物的抗氧化活性较弱。GC-MS分析从7种溶剂提取的挥发油中分别定性出43、48、45、44、40、43、46个化合物。讨论　千斤拔挥发油的化学成分与其抗氧化活性的构效关系仍需进一步深入研究。

Abstract

Objective To screen the antioxidant-active fractions of volatile oil of Moghaniae radix and to identify their chemical constituents by gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS）. Methods Volatile oil was isolated by 7 solvent systems （anhydrous ethanol， methanol， n-butanol， ethyl acetate， dichloromethane， petroleum ether and n-hexane）. Antioxidant capacity was evaluated and chemical compositions were analyzed by GC-MS. Results Anhydrous ethanol extract exhibited the highest antioxidant activity， followed by methanol， n-butanol and ethyl acetate extracts， whereas dichloromethane， petroleum ether and n-hexane extracts showed weak activity. 43， 48， 45， 44， 40， 43 and 46 compounds were identified in the respective fractions. Conclusion The ethanol-soluble fraction is the most promising antioxidant-rich part， but structure-activity relationships require further investigation.

Graphical abstract

关键词

千斤拔 / 挥发油 / 抗氧化 / 气相色谱串联质谱联用仪 / 溶剂提取法

Key words

Moghaniae radix / volatile oil / antioxidant / gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS） / solvent method

千斤拔为豆科千斤拔属植物蔓性千斤拔Flemingia philippinensis Mer.et Rolfe的干燥根^［1］，其味甘、微涩，性平，归肝、肾、脾、胃经，具有补脾胃、益肝肾、强腰膝、舒筋络的功效，临床常用于治疗脾胃虚弱、气虚脚肿、肾虚腰痛、手足酸软、风湿骨痛、跌打损伤等症^［1］。现代药理研究证实，千斤拔具有抗炎、抑制血栓形成、抗肿瘤、抗氧化等多种活性^［2-4］，其化学成分复杂，已分离鉴定出黄酮类、挥发油类、香豆素类、甾醇类、蒽醌类及苷类等多种化合物^［5］。

《中华本草》中明确记载千斤拔可用于类风湿关节炎的治疗^［6］，而瑶药“千斤拔油”在临床中治疗类风湿关节炎的应用实践^［7-10］，进一步表明千斤拔挥发油可能是其发挥抗类风湿关节炎作用的核心活性成分。然而目前关于千斤拔化学成分与药理作用的研究仍不够系统，现有研究证实其总黄酮具有抗类风湿性关节炎的作用^［11］，黄酮类成分^［12］、多糖^［13］及氯仿、正丁醇提取部位^［14］具有抗氧化活性，但针对挥发油的抗氧化活性部位筛选及物质基础解析尚未深入。资料证实千斤拔挥发油提取方法有水蒸气蒸馏（steam distillation，SD）法、二氯甲烷萃取法、超声辅助水蒸气蒸馏法及超临界二氧化碳流体萃取法等^［15-18］，化学成分定性多采用气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技术^［19］。

本研究选取正己烷、石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、无水乙醇、甲醇7种不同极性的有机溶剂，系统提取千斤拔的挥发油成分；结合体外抗氧化实验筛选活性最优部位，再通过GC-MS技术定性分析各部位化学组成，阐明千斤拔挥发油抗氧化活性的物质基础，为其抗氧化活性评价、有效部位筛选及物质基础研究提供实验依据与参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

GCMS-TQ8040NX型气相色谱质谱仪（日本岛津公司）；Spectra Max^®M2型多功能全自动酶标仪（美国MD公司）；KQ-800KDE型高功率超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；TE124S型电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）。

1.2 试药

维生素C（vitamin C，Vc，批号C13053029，质量分数>99.0%）、2，2-二苯基-1-苦肼基（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH，批号DY40108）、三氟化硼（批号C15008263）、三氯乙酸（批号C16134789）、铁氰化钾（批号C13703899），均购自上海麦克林生化科技有限公司；石油醚（批号250116）、无水乙醇（批号250203）、甲醇（批号25D225），均购自河南洛大化学试剂有限公司；二氯甲烷（批号220812）、乙酸乙酯（批号210329）、正丁醇（批号240103），均购自洛阳昊华化学试剂有限公司；三氯化铁（批号20210401）、硫酸亚铁（批号20220401），均购自天津市大茂化学试剂厂；磷酸氢二钠（230306）、磷酸二氢钠（240312），均购自天津欧博凯化工有限公司；过硫酸钾（批号20200811，天津市河东区红岩试剂厂）；正己烷（批号196492，赛默飞世尔科技有限公司）；水杨酸（批号200420，天津欧博凯化工有限公司）；双氧水（批号20170510，天津市科密欧化学试剂有限公司）；2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐［2，2’-azino-bis（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS，批号JS264840，上海源叶生物科技有限公司］。千斤拔药材经马存德主任药师鉴定为豆科千斤拔属植物蔓性千斤拔Flemingia philippinensis Merr. et Rolfe的干燥根和茎。

2 方法

2.1 千斤拔挥发油的提取

取千斤拔药材粉碎，过40目筛后，精密称取药粉150 g，平行称取7份，分别加入正己烷、石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、无水乙醇、甲醇各1 000 mL，超声（功率400 W，频率40 kHz）处理30 min，重复提取2次；滤过，合并2次滤液，减压回收溶剂，真空干燥至恒质量，得各溶剂提取的千斤拔挥发油干膏^［20-21］。

2.2 千斤拔挥发油抗氧化活性的评价

2.2.1 供试品溶液的制备

精密称取各溶剂提取的千斤拔干膏及Vc对照品，用无水乙醇配制成质量浓度分别为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg·mL^-1的系列供试品溶液，备用。

2.2.2 DPPH自由基清除能力的测定

精密量取质量浓度为0.05 mg·mL^-1的DPPH乙醇溶液2 mL，与不同质量浓度的供试品溶液2 mL混合均匀，置于28 ℃恒温水浴中反应30 min；精密吸取反应液80 μL至96孔板，采用多功能酶标仪在517 nm波长处测定吸光度（A₁）。另取2 mL DPPH溶液与2 mL无水乙醇混合，同法测定吸光度（A₀）。取2 mL供试品溶液与2 mL无水乙醇混合，同法测定吸光度（A₂）。以抗坏血酸为阳性对照^［22-24］，每个样品平行测定2次，计算DPPH自由基清除率。\mathrm{D}\mathrm{P}\mathrm{P}\mathrm{H}\mathrm{自由}\mathrm{基清}\mathrm{除率}(\mathrm{\%})=\frac{A_{\mathrm{0}}-(A_{\mathrm{1}}-A_{\mathrm{2}})}{A_{\mathrm{0}}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}。

2.2.3 羟基自由基清除能力的测定

精密量取不同质量浓度的供试品溶液各2 mL，依次加入6 mmol·L^-1 FeSO₄溶液2 mL、6 mmol·L^-1 H₂O₂溶液2 mL，摇匀后静置10 min；再加入6 mmol·L^-1水杨酸溶液2 mL，摇匀并静置30 min。精密吸取反应液80 μL至96孔板，采用多功能酶标仪在510 nm波长处测定吸光度（A₁），用超纯水替代水杨酸溶液，同法测定吸光度（A₂）；以超纯水替代供试品溶液，同法测定吸光度（A₀）。以抗坏血酸为阳性对照^［22-24］，每个样品平行测定2次，计算羟基自由基清除率。\mathrm{羟基}\mathrm{自由}\mathrm{基清}\mathrm{除}\mathrm{率}(\mathrm{\%})=\frac{A_{\mathrm{0}}-(A_{\mathrm{1}}-A_{\mathrm{2}})}{A_{\mathrm{0}}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}。

2.2.4 ABTS自由基清除能力的测定

分别配制7 mmol·L^-1 ABTS水溶液和2.45 mmol·L^-1过硫酸钾水溶液，取等体积ABTS水溶液与过硫酸钾水溶液混合，于室温避光条件下反应16 h，得ABTS自由基储备液；用体积分数60%乙醇将储备液稀释至734 nm波长处吸光度值为（0.7±0.02），备用。精密取不同质量浓度的供试品溶液1 mL，加入4 mL的ABTS自由基工作液，振荡混匀后于室温反应30 min；精密吸取反应液80 μL至96孔板，采用多功能酶标仪在734 nm波长处测定其吸光度（A₁）。用体积分数60%乙醇替代供试品溶液，同法测定吸光度（A₀）。以抗坏血酸为阳性对照^［22-24］，每个样品平行测定2次，计算ABTS自由基清除率。\mathrm{A}\mathrm{B}\mathrm{T}\mathrm{S}\mathrm{自由}\mathrm{基清}\mathrm{除率}(\mathrm{\%})=

\frac{A_{\mathrm{0}}-A_{\mathrm{1}}}{A_{\mathrm{0}}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}。

2.2.5 总还原能力的测定

精密量取不同质量浓度的供试品溶液1 mL，依次加入0.2 mol·L^-1磷酸缓冲液（pH 6.6）2.5 mL、质量分数1%铁氰化钾溶液2.5 mL，混匀后于50 ℃水浴中恒温20 min；快速冷却后加入质量分数10%三氯乙酸溶液2.5 mL，摇匀；再加入超纯水5 mL、质量分数0.1%三氯化铁溶液1 mL，混匀后于室温静置10 min。精密吸取反应液80 μL至96孔板，采用多功能酶标仪在700 nm波长处测定吸光度值（A₁），以无水乙醇替代供试品溶液，同法测定吸光度（A₀），以A₁－A₀值表征样品的总还原能力。以抗坏血酸为阳性对照^［22-24］，所有测定平行操作2次。

2.3 千斤拔挥发油化学成分的分析

2.3.1 挥发性成分甲酯化的处理

取用各溶剂提取的千斤拔干膏适量，精密称定，置于具塞试管中，加入0.5 mol·L^-1氢氧化钾甲醇溶液5 mL，于70 ℃水浴中皂化反应10 min（操作过程中不定时振荡，使油脂充分反应）；冷却3 min后，加入质量分数14%三氟化硼甲醇溶液3 mL，继续于70 ℃水浴中甲酯化反应5 min。反应结束后，加入饱和氯化钠溶液10 mL，再加入色谱级正己烷少许，振摇后静置分层，取上层正己烷相，经0.22 μm有机微孔滤膜滤过，即得待测供试品溶液^［25-26］。

2.3.2 气相色谱条件

采用SH-RXi-5Sil MS石英毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm，温度320~350 ℃）；柱温程序：初始温度100 ℃，以5.0 ℃·min^-1升温至150 ℃并保持2 min，再以3.0 ℃·min^-1升温至210 ℃并保持3 min，最后以5.0 ℃·min^-1升温至270 ℃并保持5 min；进样口温度为280 ℃；载气为高纯氦气（纯度99.999%），载气流速为1.5 mL·min^-1；分流比为10∶1；进样口压力为125.4 kPa；总流量为25.4 mL·min^-1；色谱柱流量为2.04 mL·min^-1；载气线速为52.1 cm·s^-1；吹扫流量为3.0 mL·min^-1；溶剂延迟2 min。

2.3.3 质谱条件

采用电子轰击源；三重四级杆质量分析器；接口温度为250 ℃；离子源温度为280 ℃；质量扫描范围为m/z 50~750。

2.3.4 样品测定及数据分析

取甲酯化后的待测供试品溶液，经0.22 μm有机微孔滤膜滤过，精密吸取1 μL注入气相色谱-质谱联用仪，按上述条件进行测定。采用色谱工作站对总离子流图进行分析，结合质谱库检索对化合物进行定性鉴定。

3 结果

3.1 挥发油抗氧化活性的评价

3.1.1 DPPH自由基清除能力

7种溶剂提取的千斤拔挥发油对DPPH自由基的清除能力均弱于V_C阳性对照，其中正丁醇、乙酸乙酯、甲醇、无水乙醇提取物的清除能力稍弱于V_C。千斤拔挥发油的DPPH自由基清除能力由强至弱依次为正丁醇提取物>乙酸乙酯提取物>甲醇提取物>无水乙醇提取物>二氯甲烷提取物>正己烷提取物>石油醚提取物，以正丁醇、乙酸乙酯、甲醇、无水乙醇提取物的DPPH自由基清除能力相对突出。见图1。

3.1.2 羟基自由基清除能力

各溶剂提取物的羟基自由基清除能力均低于Vc阳性对照，清除能力由强至弱依次为无水乙醇提取物>甲醇提取物>正丁醇提取物>乙酸乙酯提取物>二氯甲烷提取物>石油醚提取物>正己烷提取物，其中无水乙醇和甲醇提取物的清除能力显著。见图2。

3.1.3 ABTS自由基清除能力

7种提取物的ABTS自由基清除能力均弱于V_C阳性对照，无水乙醇提取物、甲醇提取物、正丁醇提取物的清除能力与V_C接近。清除能力由强至弱依次为无水乙醇提取物>甲醇提取物>正丁醇提取物>乙酸乙酯提取物>二氯甲烷提取物>石油醚提取物>正己烷提取物，以无水乙醇、甲醇、正丁醇、乙酸乙酯提取物的清除效果较好。见图3。

3.1.4 总还原能力

各提取物的总还原能力均低于Vc阳性对照，总还原能力由强至弱依次为无水乙醇提取物>甲醇提取物>正丁醇提取物>乙酸乙酯提取物>二氯甲烷提取物>正己烷提取物>石油醚提取物，其中无水乙醇与甲醇提取物的总还原能力相对较强。见图4。

3.2 挥发性成分物质基础分析

采用优化后的GC-MS分析条件，对正己烷、石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、无水乙醇、甲醇提取的千斤拔挥发油进行成分定性分析。通过NIST20质谱库相似度检索（匹配库：NIST20-1.lib、NIST20-2.lib、NIST20s.lib），结合总离子流图与峰积分结果，分别鉴定出43、48、45、44、40、43、46个化合物。总离子流图见图5。

千斤拔正己烷提取物中鉴定出43个化合物，主要为萜类、芳香族及脂肪族化合物，其中含量较高组分包括棕榈酸甲酯（15.63%）、亚油酸甲酯（10.5%）、反-9-十八碳烯酸甲酯（8.01%）、邻苯二甲酸二甲酯（6.18%）、2，4-二特丁基苯酚（2.94%）、硬脂酸甲酯（4.57%）。见表1。

千斤拔石油醚提取物中鉴定出48个化合物，主要为萜类、芳香族、脂肪族化合物等，其中含量较高的有棕榈酸甲酯（13.81%）、2，4-二特丁基苯酚（7.94%）、亚油酸甲酯（7.56%）、邻苯二甲酸二甲酯（5.2%）、反-9-十八碳烯酸甲酯（5.16%）、硬脂酸甲酯（5.38%）。

千斤拔二氯甲烷提取物中鉴定出45个化合物，主要为萜类、芳香族、脂肪族化合物等，其中含量较高的有γ-谷甾醇（34.9%）、亚油酸甲酯（10.05%）、棕榈酸甲酯（8.45%）、反-9-十八碳烯酸甲酯（7.07%）、β-香树脂酮（7.05%）、邻苯二甲酸二甲酯（3.67%）、硬脂酸甲酯（1.52%）、2，4-二特丁基苯酚（1.23%）。见表3。

千斤拔乙酸乙酯提取物中鉴定出44个化合物，主要为萜类化合物，芳香族化合物，脂肪族化合物等，其中含量较高的有亚油酸甲酯（10.76%）、棕榈酸甲酯（10.6%）、2，4-二甲基苯甲醛（10.44%）、反-9-十八碳烯酸甲酯（7.71%）、2，4-二特丁基苯酚（5.81%）、邻苯二甲酸二甲酯（4.83%）、硬脂酸甲酯（2.56%）。见表4。

千斤拔正丁醇提取物中鉴定出40个化合物，主要为萜类化合物，芳香族化合物，脂肪族化合物等，其中含量较高的有棕榈酸甲酯（24.23%）、亚油酸甲酯（24.21%）、反-9-十八碳烯酸甲酯（17.25%）、硬脂酸甲酯（6.63%）、2，4-二特丁基苯酚（1.12%）、邻苯二甲酸二甲酯（0.65%）。见表5。

千斤拔无水乙醇提取物中鉴定出43个化合物，主要为萜类化合物，芳香族化合物，脂肪族化合物等，其中含量较高的有亚油酸甲酯（8.37%）、棕榈酸甲酯（7.09%）、邻苯二甲酸二甲酯（6.16%）、反-9-十八碳烯酸甲酯（5.81%）、硬脂酸甲酯（2.03%）。见表6。

千斤拔甲醇提取物中鉴定出46个化合物，主要为萜类化合物、芳香族化合物、脂肪族化合物等，其中含量较高的有棕榈酸甲酯（4.89%）、亚油酸甲酯（4.67%）、辛基四十二烷基醚（3.92%）、正五十四烷（3.88%）、邻苯二甲酸二甲酯（2.62%）。

3 讨论

千斤拔作为传统抗风湿中药，临床常用于治疗类风湿关节炎、风湿性关节痛，但其物质基础与作用机制研究相对薄弱，制约了相关成方制剂的工艺优化和质量标准提升。类风湿关节炎的发病机制复杂，氧化应激被证实是其发生、发展的关键环节^［27］。已有研究表明，中药复方及单体化合物可通过核因子-κB（nuclear factor-κB， NF-κB）信号通路缓解类风湿关节炎症状^［28-29］，而抗氧化作用是其基于核因子-κB/核因子E2相关因子2（nuclear factor-κB/nuclear factor erythroid 2-related factor 2， NF-κB/Nrf2）信号通路发挥药理活性的重要途径^［30］，提示抗氧化成分可能成为治疗类风湿关节炎或辅助治疗的潜在物质。基于此，本研究通过体外抗氧化实验筛选千斤拔抗风湿的挥发性活性物质基础，对正己烷、石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、无水乙醇、甲醇提取的千斤拔挥发油进行DPPH自由基清除能力、羟基自由基清除能力、ABTS自由基的清除能力、总还原能力等抗氧化活性评价，结果显示，不同极性溶剂提取的挥发油抗氧化活性存在显著差异，其中无水乙醇、甲醇提取物的抗氧化活性最优，正丁醇、乙酸乙酯提取物也表现出一定抗氧化能力，提示极性偏醇类的溶剂更易提取千斤拔中具有抗氧化活性的成分。

本研究优化了千斤拔挥发油的GC-MS分析条件，通过程序升温梯度的调控实现了挥发性成分的有效分离。采用超声波辅助溶剂提取法获得的7种不同溶剂提取物，经定性分析，正己烷、石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、无水乙醇、甲醇提取物分别鉴定出43、48、45、44、40、43、46个化合物，主要为萜类、芳香族及脂肪族化合物，且各提取物的成分组成差异明显。其中邻苯二甲酸二甲酯、棕榈酸甲酯、亚油酸甲酯为7种提取物中的共有高含量成分，这类化合物是否为千斤拔挥发油发挥抗氧化活性的核心物质，其构效关系及协同作用机制仍需进一步验证。此外，二氯甲烷提取物中鉴定出的γ-谷甾醇（34.9%）为特有高含量成分，其与抗氧化活性的关联也值得深入探究。

综上所述，本研究明确了千斤拔挥发油的抗氧化活性部位及主要化学成分，为后续阐释其抗类风湿关节炎的物质基础与作用机制提供了实验依据，也为千斤拔挥发油的开发利用奠定了基础。

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基金资助

陕西省科技厅创新能力支撑计划项目(2025JC-GXPT-024)

协同创新项目(22JY-006)