华蟾素联合动脉化疗栓塞术对不可切除肝细胞癌患者铁死亡蛋白表达及预后的影响

Effect of cinobufagin combined with transcatheter arterial chemoembolization on ferroptosis-related protein expression and prognosis in patients with unresectable hepatocellular carcinoma

摘要

目的 探讨华蟾素对动脉化疗栓塞术（transcatheter arterial chemoembolization， TACE）后肝细胞癌（hepatocellular carcinoma， HCC）患者铁死亡相关蛋白表达及临床预后的影响。 方法 该研究为回顾性分析，纳入接受TACE联合华蟾素治疗的60例不可切除HCC患者作为研究组，选取同期仅接受TACE治疗的60例不可切除HCC患者作为对照组。主要研究终点为无进展生存期（progression-free survival， PFS），次要研究终点为总生存期（overall survival，OS）。治疗前及治疗2个周期后采集静脉血样本，使用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA）试剂盒检测血浆中4-羟基-2-壬烯醛（4-hydroxy-2-nonenal， 4-HNE）和谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4， GPX4）的表达水平。 结果 治疗后，与对照组比较，研究组的4-HNE水平显著降低（P<0.05）， GPX4水平显著升高（P<0.05）。研究组和对照组的中位PFS分别为14.0个月（95%CI=9.49~18.51个月）和6.0个月（95%CI=0~13.02个月）。研究组的PFS显著优于对照组（Log-Rank=5.060， P=0.024<0.05）。多因素Cox比例风险回归分析结果显示，治疗后4-HNE水平（HR=1.008， 95%CI=1.001~1.016）、巴塞罗那临床肝癌分期（Barcelona clinic liver cancer， BCLC）C期（HR=2.381，95%CI=1.307~4.337）及肿瘤大小≥5 cm（HR=1.796， 95%CI=1.040~3.103）是PFS的独立预后因素。研究组和对照组的中位OS分别为27.50个月（95%CI=25.44~29.56个月）和22.00个月（95%CI=18.63~25.37个月），且研究组的OS显著优于对照组（Log-Rank=3.868， P=0.049<0.05）。 结论 对于不可切除HCC患者，华蟾素联合TACE治疗较单独TACE治疗可显著改善患者的PFS和OS，铁死亡相关蛋白4-HNE的表达变化可作为晚期HCC治疗效果的预测指标。

Abstract

Objective To analyze the effects of cinobufagin on ferroptosis-related protein expression and clinical prognosis in patients with hepatocellular carcinoma （HCC） after transcatheter arterial chemoembolization （TACE）. Methods This retrospective study enrolled 60 patients with unresectable HCC who received cinobufagin combined with TACE at our hospital between January 2020 and June 2021. A control group of 60 patients who received TACE alone during the same period was selected. The primary endpoint was progression-free survival （PFS）， and the secondary endpoint was overall survival （OS）. Venous blood samples were collected before treatment initiation and after 2 treatment cycles. The plasma levels of 4-hydroxy-2-nonenal （4-HNE） and glutathione peroxidase 4 （GPX4） were assessed using ELISA kits. Results Compared with the control group， the study group showed a significantly decreased post-treatment 4-HNE level （P<0.05） and a significantly increased GPX4 level （P<0.05）. The median PFS was 14.0 months （95%CI=9.49-18.51 months） in the study group and 6.0 months （95%CI=0-13.02 months） in the control group. PFS was significantly better in the study group （Log-Rank=5.060， P=0.024）. Multivariate Cox proportional hazards analysis identified post-treatment 4-HNE level （HR=1.008， 95%CI=1.001-1.016）， Barcelona Clinic Liver Cancer （BCLC） stage C （HR=2.381， 95%CI=1.307-4.337）， and tumor size ≥5 cm （HR=1.796， 95%CI=1.040-3.103） as independent prognostic factors for PFS. The median OS was 27.50 months （95%CI=25.44-29.56） in the study group and 22.00 months （95%CI=18.63-25.37） in the control group. OS was significantly better in the study group （Log-Rank=3.868， P=0.049<0.05）. Conclusion For patients with unresectable HCC， cinobufagin combined with TACE provides better PFS and OS compared with TACE alone. Altered expression of the ferroptosis-related protein 4-HNE may serve as a predictor of treatment efficacy in advanced HCC.

Graphical abstract

关键词

华蟾素 / 动脉化疗栓塞术（TACE） / 肝细胞癌 / 铁死亡 / 预后

Key words

cinobufagin / transcatheter arterial chemoembolization （TACE） / hepatocellular carcinoma / ferroptosis / prognosis

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma， HCC）是全球第四大癌症相关死亡原因，我国是肝癌高发地区^［1］。对于不具备手术切除、肝移植或局部消融等根治性治疗指征的患者，其5年生存率仍处于较低水平^［2］。在我国，经动脉化疗栓塞（transcatheter arterial chemoembolization， TACE）常用于不可切除且肝功能正常的HCC患者［巴塞罗纳临床肝癌分期系统（Barcelona clinic liver cancer， BCLC）］B期的姑息性治疗^［3］。既往研究证实，与全身化疗或支持性治疗比较，TACE干预可显著改善不可切除HCC患者的生存预后^［4］。然而，TACE治疗后患者的复发率仍较高，长期生存率不理想，因此，提高TACE治疗的疗效、探索有效的联合治疗方案仍是当前临床面临的主要挑战。

华蟾素是从中华大蟾蜍或黑眶蟾蜍的干燥皮肤腺体中提取的中药制剂，并由国家药品监督管理局批准用于包括肝癌在内的多种恶性肿瘤治疗，且长期临床应用安全性良好^［5］。一项纳入27项随机对照试验、共2079例患者的系统评价结果显示，华蟾素对不可切除肝癌患者具有一定治疗获益^［6］，但由于纳入试验的整体质量偏低，上述结果需谨慎解读。华蟾素的主要化学成分包括蟾蜍二烯内酯、生物碱、核苷、多肽、胆固醇及有机酸等^［7-8］。其多成分特性使其可能通过多作用靶点发挥药理作用。有学者采用超高效液相色谱-高分辨率质谱（ultra performance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry， UPLC-HRMS）结合细胞代谢组学与脂质组学技术，系统探究华蟾素抗HCC的潜在机制，证实铁死亡在其中发挥重要作用^［9］。

铁死亡作为一种新型程序性细胞死亡方式，研究发现其可能与患者对化疗及其他治疗的敏感性密切相关^［10］。4-羟基-2-壬烯醛（4-hydroxy-2-nonenal， 4-HNE）和谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）已被证实可作为铁死亡的关键调控因子^［11］，基于此，推测二者的表达水平和失衡状态可能有助于预测HCC患者对TACE联合华蟾素治疗的敏感性。本研究探讨4-HNE和GPX4的表达变化对接受TACE联合华蟾素治疗的HCC患者生存结局的影响。

1 一般资料

本研究为回顾性分析，纳入本院接受TACE联合华蟾素治疗的60例不可切除HCC患者作为研究组，选取同期仅接受TACE治疗的60例不可切除HCC患者作为对照组。本研究经医院医学伦理委员会审核、批准。

纳入标准：①年龄为18~75岁；②经病理或临床确诊为原发性肝癌；③Child-Pugh肝功能分级为A级或B级；④美国东部肿瘤协作组体力状况评分（Eastern Cooperative Oncology Group Performance Status， ecOG PS）≤2分；⑤患者及家属均知情同意，并签署知情同意书。

排除标准：①存在严重器官衰竭者［肝功能衰竭（Child-Pugh C级）、心力衰竭（NYHA心功能分级Ⅲ~Ⅳ级）、肾功能衰竭（血肌酐>442 μmol·L^-1）］；②合并重症免疫系统疾病（免疫缺陷病、系统性红斑狼疮、类风湿关节炎和强直性脊柱炎）。

2 方法

2.1 TACE手术操作

2组患者均接受常规TACE治疗，具体方案如下：TACE术前禁食4 h，术前静脉注射5 mg地塞米松；局部麻醉下经右股动脉穿刺置入导管，行数字减影血管造影术（digital subtraction angiography，DSA）检查肝动脉及肠系膜上动脉，明确肿瘤的大小、位置及血供情况；根据肿瘤供血动脉分布，超选择性插管至右肝动脉、左肝动脉或靶血管；将10 mL碘油乳剂与60 mg吡柔比星（深圳万乐药业有限公司）混合，根据肿瘤的大小可追加纯碘油至最大20 mL，在DSA监控下缓慢注射乳剂和碘油，避免反流，确保药物充分沉淀于肿瘤区域；若肿瘤累及双肝叶，根据肿瘤动脉血供来源，经远端肝固有动脉或胃十二指肠动脉注射药物。

TACE治疗周期为4周，若出现血管禁忌证、肝功能严重受损、Ⅲ~Ⅳ级不良事件或疾病进展，则终止治疗。

2.2 华蟾素治疗方案

研究组患者在TACE治疗后1 d开始接受华蟾素辅助治疗，口服华蟾素片，每次300 mg，每日3次，4周为1个治疗周期。若出现Ⅲ~Ⅳ级不良事件，可酌情减小剂量。待不良反应缓解后，建议恢复原剂量继续治疗。研究组华蟾素给药中位持续时间为6.6个月（范围2~23个月）。

2.3 临床资料收集和检测指标

通过查阅患者病历资料，收集临床和影像学资料，包括年龄、性别、巴塞罗那临床肝癌（Barcelona Clinic Liver Cancer， BCLC）分期、血管侵犯情况（定义为门静脉或肝静脉系统内肿瘤旁血栓形成且边界模糊），以及实验室检查指标［白细胞计数（white blood cell，WBC）、血小板计数（platelet，PLT）、中性粒细胞计数、淋巴细胞计数、丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）、血红蛋白水平等］。

2.4 结局评估与样本检测

主要终点为无进展生存期（progression-free survival， PFS），定义为从治疗开始至首次记录疾病进展的时间。次要终点是总生存期（overall survival，OS），定义为从治疗开始至患者死亡的时间。患者每月门诊随访1次，随访截止日期为2023年9月1日。分别于治疗前和治疗2个周期后采集静脉血样，离心分离血浆，采用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA）试剂盒（批号分别为ab238538、ab262509， 英国Abcam公司）检测血浆中4-HNE和GPX4的水平，操作严格按照试剂盒说明书进行。

2.5 统计学方法

采用SPSS 25.0软件对数据进行统计分析。通过Kolmogorov-Smirnov检验判断计量资料的正态分布性：符合正态分布的数据以（\overline{x}±s）表示，组间比较采用独立样本t检验。非正态分布数据以“中位数（四分位数间距）”表示，组间比较采用秩和检验。计数资料以“例（%）”表示，组间比较采用χ²检验。采用Cox比例风险回归模型筛选影响PFS的独立因素，采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，组间生存差异采用Log-Rank检验。P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 患者的基线特征

2组患者的年龄、性别、BCLC分期、肿瘤大小、肿瘤数量、肝纤维化程度、血管侵犯情况、病理分化等级及各项实验室指标水平比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。见表1。

3.2 4-HNE、GPX4水平

治疗前，2组患者4-HNE、GPX4水平比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。治疗后，与对照组比较，研究组的血浆4-HNE水平显著降低（P<0.05），GPX4水平显著升高（P<0.05）。见表2。

3.3 主要结局

Kaplan-Meier生存分析结果显示，研究组的中位PFS为14.0个月（95%CI=9.49~18.51个月）显著长于对照组的6.0个月（95%CI=0~13.02个月），（Log-Rank=5.060， P=0.024<0.05）。见图1。

多因素Cox比例风险分析结果显示，治疗后4-HNE水平（HR=1.008， 95%CI=1.001~1.016， P=0.033<0.05）、BCLC分期C期（HR=2.381，95%CI=1.307~4.337， P=0.005<0.05）及肿瘤大小≥5 cm（HR=1.796， 95%CI=1.040~3.103，P=0.036<0.05）是影响患者PFS的独立预后因素。见表3。

3.4 次要结局

Kaplan-Meier生存分析结果显示，研究组的中位OS为27.50个月（95%CI=25.44~29.56个月），显著长于对照组的22.00个月（95%CI=18.63~25.37个月），（Log-Rank=3.868，P=0.049<0.05）。见图2。

3.5 治疗相关不良事件

2组患者治疗相关不良事件以腹泻和肝功能异常最为常见。2组共发生31例Ⅲ~Ⅳ级不良事件，涉及25例患者（20.8%）。1例患者于末次TACE术后2周因肺栓塞死亡。研究组Ⅲ~Ⅳ级不良事件发生率为26.7%（16/60），对照组为25.0%（15/60）。见表4。

4 讨论

4.1 华蟾素辅助治疗改善晚期HCC患者的预后

恶性肿瘤化疗面临耐药性、毒性和不良反应等瓶颈，寻找安全、有效的辅助疗法以改善晚期HCC患者生存预后、提升生活质量，是当前临床研究的重要方向。中药作为肿瘤辅助治疗手段已应用多年，多项研究结果表明华蟾素可能对晚期HCC患者具有治疗价值^［12-13］。本研究通过回顾性分析证实，与单纯TACE治疗比较，华蟾素联合TACE治疗可显著延长不可切除HCC患者的PFS和OS，其中位PFS（14.0个月）和中位OS（27.5个月）已达到TACE联合索拉非尼、舒尼替尼等靶向药物的临床试验水平^［14-15］，为晚期HCC的联合治疗提供了新的选择。

4.2 华蟾素通过调节铁死亡状态发挥抗肿瘤作用

华蟾素的抗肿瘤活性已经得到多项研究的证实，其可抑制人皮肤鳞状细胞癌A431细胞的增殖并诱导凋亡^［16］，通过改善胰腺癌微环境抑制胰腺星状细胞上皮间质转化^［17］，还可通过调节雄激素受体去磷酸化抑制胆囊癌细胞进展^［18］，或诱导G2/M期细胞周期停滞和自噬发挥抑癌作用^［19］。

铁死亡作为新型程序性细胞死亡方式，其核心调控因子GPX4与4-HNE的失衡在肿瘤发展中具有重要作用。GPX4可促进GSH的合成，通过维持细胞内氧化还原平衡抑制铁死亡；而4-HNE可通过促进GPX4泛素化降解形成铁死亡正反馈环路^［20-21］。本研究发现，华蟾素联合TACE治疗可显著降低患者血浆TACE水平，升高GPX4水平，且多因素Cox比例风险分析结果显示，治疗后4-HNE水平是PFS的独立预后因素，结合既往TACE可通过调控铁死亡抑制HCC肿瘤发生和转移的研究结论^［22］，提示华蟾素可能通过调节HCC患者铁死亡通路延缓TACE术后疾病复发，这与体外研究证实华蟾素通过诱导铁死亡促进肺癌细胞凋亡的机制一致^［23］。

4.3 华蟾素联合治疗的安全性特征

本研究中，2组患者治疗相关不良事件以轻度至中度为主，且多为TACE治疗常见不良反应（如腹泻、肝功能异常），研究组Ⅲ~Ⅳ级不良事件发生率（26.7%）与对照组（25.0%）比较，差异无统计学意义。仅1例患者因肺栓塞死亡，表明华蟾素联合TACE治疗的安全性良好，耐受性可控。需要注意的是，晚期HCC患者常合并乙型肝炎病毒感染及肝功能损伤，TACE治疗后可能因化疗药物、碘油等因素加重肝毒性，临床应用时需密切监测不良事件并进行及时干预^［24］。

4.4 研究的局限性

本研究存在一定局限性：第一，为单中心回顾性研究，可能存在选择偏倚；第二，纳入人群为肝功能保留患者，结论难以推广至肝功能更差的患者群体；第三，仅通过ELISA法检测血浆4-HNE和GPX4水平，未开展细胞或动物实验进一步验证铁死亡通路的调控机制。未来需开展多中心、前瞻性临床试验，结合基础实验深入探索华蟾素的作用靶点，为其临床应用提供更充分的证据。

5 结论

华蟾素联合TACE治疗不可切除HCC患者，可显著改善患者的PFS和OS，且安全性良好；铁死亡相关蛋白4-HNE的表达变化可作为晚期HCC治疗效果的潜在预测指标，为临床治疗决策及预后评估提供参考。

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基金资助

河北省中医药管理局2022年度中医药类科研计划课题(2022299)