“防栓1号”中药通过核因子- κ B/环氧合酶-2信号通路对大鼠下肢深静脉血栓形成的影响

Effect of the traditional Chinese medicine “Fangshuan-1” on deep vein thrombosis formation in the lower limbs of rats through the NF- κ B/COX-2 signaling pathway

摘要

目的 探讨“防栓1号”中药对核因子-κB（nuclear factor-κB， NF-κB）/环氧合酶-2（cyclooxygenase-2， COX-2）信号通路的调控作用，及对大鼠下肢深静脉血栓形成的影响。 方法 将60只大鼠随机分为假手术组，模型组，低分子肝素钠组，“防栓1号”低、中、高剂量组，每组10只。采用下腔静脉结扎法构建大鼠下肢深静脉血栓模型。低分子肝素钠组皮下注射低分子肝素100 IU·kg^-1·d^-1，“防栓1号”低、中、高剂量组大鼠分别灌胃给予“防栓1号”汤剂0.001、0.005、0.010 mL·g^-1，模型组和假手术组给予等量生理盐水，每日1次，连续干预7 d。比较各组大鼠凝血功能指标［活化部分凝血活酶时间（activated partial thromboplastin time， APTT）、凝血酶原时间（prothrombin time， PT）、D-二聚体］，炎症因子水平［白细胞介素（interleukin， IL）-1β、IL-6和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）］，氧化应激指标［丙二醛（malonaldehyde， MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）］以及NF-κB和COX-2 mRNA表达量与p-NF-κB/NF-κB值、COX-2蛋白表达量。 结果 与假手术组比较，模型组的PT、APTT均显著缩短，D-二聚体、TNF-α、IL-6、IL-1β、MDA含量，NF-κB和COX-2 mRNA表达量，p-NF-κB/NF-κB值及COX-2蛋白表达量均显著升高，SOD活性降低（P<0.05）；与模型组比较，低分子肝素钠组，“防栓1号”低、中、高剂量组的PT、APTT均显著延长，D-二聚体、TNF-α、IL-6、IL-1β、MDA含量，NF-κB和COX-2 mRNA表达量，p-NF-κB/NF-κB值及COX-2蛋白表达量均显著降低，SOD活性显著升高（P<0.05）。 结论 “防栓1号”中药可显著抑制大鼠下肢深静脉血栓形成，减轻炎症反应和氧化应激损伤，其机制可能与抑制NF-κB/COX-2信号通路相关。

Abstract

Objective To investigate the regulatory effects of the traditional Chinese medicine “Fangshuan-1” on the nuclear factor-κB （NF-κB）/cyclooxygenase-2 （COX-2） signaling pathway， and its impact on deep vein thrombosis （DVT） formation in the lower limbs of rats. Methods Sixty rats were randomly divided into sham-operated group， model group， low molecular weight heparin sodium group， and low-， medium-， and high-dose “Fangshuan-1” groups， with 10 rats in each group. A DVT model was established by ligating the inferior vena cava. Rats in the low molecular weight heparin sodium group received subcutaneous injections of 100 IU·kg^-1·d^-1， while rats in the “Fangshuan-1” dose groups were administered 0.001， 0.005， or 0.010 mL·g^-1 of “Fangshuan-1” decoction by gavage once daily for 7 consecutive days. The model and sham-operated groups received equal volumes of normal saline. Coagulation parameters ［activated partial thromboplastin time （APTT）， prothrombin time （PT）， and D-dimer］， inflammatory cytokine levels ［interleukin-1β （IL-1β）， IL-6， and tumor necrosis factor-α （TNF-α）］， oxidative stress markers ［malondialdehyde （MDA） and superoxide dismutase （SOD）］， as well as mRNA and protein expression levels of NF-κB， COX-2， and phosphorylated NF-κB （p-NF-κB）， were measured and compared among the groups. Results Compared with the sham-operated group， the model group exhibited shortened PT and APTT， elevated levels of D-dimer， TNF-α， IL-6， IL-1β， and MDA， increased mRNA expression of NF-κB and COX-2， elevated protein expression of p-NF-κB/NF-κB and COX-2， and decreased SOD activity （P<0.05）. Compared with the model group， the low molecular weight heparin sodium group and all “Fangshuan-1” dose groups showed prolonged PT and APTT， reduced levels of D-dimer， TNF-α， IL-6， IL-1β， and MDA， decreased mRNA expression of NF-κB and COX-2， lowered protein expression of p-NF-κB/NF-κB and COX-2， and increased SOD activity （P<0.05）. Conclusion “Fangshuan-1” can inhibit the formation of DVT in the lower extremities， alleviate inflammation， and reduce oxidative stress， potentially through suppression of the NF-κB/COX-2 signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

“防栓1号” / 下肢深静脉血栓 / 核因子-κB/环氧合酶-2信号通路 / 炎症反应 / 氧化应激

Key words

“Fangshuan-1” / deep vein thrombosis in the lower limbs / nuclear factor-κB/cyclooxygenase-2 signaling pathway / inflammatory response / oxidative stress

深静脉血栓（deep vein thrombosis， DVT）是因血液异常凝结导致下肢静脉回流障碍的疾病，临床表现为下肢肿胀、疼痛，若未及时干预，血栓可累及肢体深静脉主干，严重威胁患者的生命安全^［1-2］。本课题组基于多年防治下肢DVT的临床实践，认为该病多由风寒外侵、湿热下注，外邪引动内热，致气血凝滞、湿热侵于血脉，郁久为瘀。“防栓1号”由多味中药配伍而成，主治湿热瘀阻脉络证，故本研究探讨其对下肢DVT形成的干预作用。

核因子-κB（nuclear factor-κB， NF-κB）/环氧合酶-2 （cyclooxygenase-2， COX-2）信号通路是炎症反应的核心调控通路，其激活可级联放大炎症效应，从而促进凝血过程^［3］。基于此，本课题组提出假说：“防栓1号”可抑制下肢DVT形成，其作用机制可能与调控NF-κB/COX-2信号通路相关，本研究旨在验证该假说。

1 仪器与材料

1.1 仪器

C2000-4型全自动血凝仪（济南来宝医疗器械有限公司）；MR-96A型全自动酶标仪（南京贝登医疗股份有限公司）；HTY-761型匀浆仪（浙江泰林生物技术股份有限公司）。

1.2 试药

白细胞介素（interleukin， IL）-1β、IL-6和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）试剂盒，均购自武汉云克隆诊断试剂研究所有限公司；丙二醛（malonaldehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）试剂盒，均购自北京百奥莱博科技有限公司；PCR引物由广州锐博生物科技有限公司合成。

1.3 实验动物

60只无特定病原体（specific pathogen free， SPF）级雄性大鼠，7~8周龄，体质量为180~200 g，购自北京北方艾特生物科技有限公司，生产许可证号：SCXK（京）2020-0005。大鼠在温度（22±2） ℃、相对湿度50%~60%、12 h/12 h明暗交替的SPF级环境中适应性饲养1周，自由摄食和饮水。

2 方法

2.1 “防栓1号”水煎液的制备

处方组成：当归15 g、玄参15 g、二花30 g、甘草6 g、黄芪30 g、黄柏12 g、苍术15 g、薏苡仁30 g、水蛭10 g、蜈蚣10 g、全蝎5 g。将上述药材加水煎煮，经纱布过滤后，置于恒温箱中浓缩至生药质量浓度为2 g·mL^-1，置于4 ℃冰箱中冷藏备用。

2.2 分组与给药

将60只大鼠随机分为假手术组，模型组，低分子肝素钠组，“防栓1号”低、中、高剂量组，每组10只。除假手术组外，其余各组大鼠均采用腹腔注射戊巴比妥钠麻醉后，仰卧位固定于鼠板上，沿腹部正中线切口，分离下腔静脉至髂静脉分叉处，以0号丝线结扎下腔静脉及双侧髂静脉。待大鼠出现双足明显肿胀、下肢皮肤青紫，提示血栓形成，下肢DVT模型制备成功^［4］。结扎6 h后拆除结扎线；假手术组仅分离下腔静脉及双侧髂静脉并挂线，不进行结扎，其余操作同模型组。

术后6 h开始干预：低分子肝素钠组皮下注射低分子肝素100 IU·kg^-1·d^-1［5］；“防栓1号”低、中、高剂量组分别灌胃给予“防栓1号”水煎液0.001、0.005、0.010 mL·g^-1；假手术组、模型组给予等量生理盐水。各组均每日干预1次，连续干预7 d。

2.3 凝血功能相关指标的检测

干预结束后，采集各组大鼠股静脉血2 mL，加入质量分数3.8%枸橼酸钠溶液抗凝，以5 000 r·min^-1离心5 min，分离血浆。采用全自动血凝仪检测凝血相关物质D-二聚体、凝血酶原时间（prothrombin time， PT）和活化部分凝血活酶时间（activated partial thromboplastin time， APTT）。

2.4 炎症因子和氧化应激指标的检测

取2.3项下分离的血浆，严格按照酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA）试剂盒说明书操作，检测TNF-α、IL-1β和IL-6炎症因子水平，以及氧化应激指标SOD活性和MDA含量。

2.5 NF-κB、COX-2 mRNA表达水平的检测

取大鼠血栓形成部位静脉组织，研磨成匀浆后，加入Trizol试剂提取总核糖核酸（ribonucleic acid， RNA）。按照逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录成互补DNA（complementary DNA， cDNA），进行PCR扩增。反应程序：95 ℃预变性30 s；95 ℃解链30 s、56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环；72 ℃终止延伸5 min。采用2^-△△CT法计算NF-κB、COX-2 mRNA的相对表达量，以GAPDH为内参基因，引物序列见表1。

2.6 NF-κB、p-NF-κB、COX-2蛋白表达水平的检测

取大鼠血栓形成部位静脉组织，研磨成组织匀浆后，加入蛋白裂解液裂解，4 ℃下以12 000 r·min^-1离心10 min，提取上清液并检测蛋白浓度。取50 μg蛋白样品进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis， SDS-PAGE），湿转至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride， PVDF）膜上，室温封闭1 h后，加入NF-κB、p-NF-κB、COX-2一抗（1∶1 000），4 ℃孵育过夜。次日加入二抗（1∶5 000），室温孵育1 h，洗膜后曝光显影。采用Image J软件分析条带灰度值，以GAPDH为内参，计算目的蛋白相对表达量及p-NF-κB/NF-κB值。

2.7 统计学方法

用SPSS 21.0软件分析数据。计量资料以（\overline{x}±s）表示，检验多样本计量资料用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 凝血功能相关指标的比较

与假手术组比较，模型组的PT、APTT均显著缩短，D-二聚体水平显著升高（P<0.05）；与模型组比较，低分子肝素钠组及“防栓1号”低、中、高剂量组的PT、APTT均显著延长，D-二聚体水平均显著降低（P<0.05）。见表2。

3.2 炎症因子的比较

与假手术组比较，模型组的TNF-α、IL-6和IL-1β水平均显著升高（P<0.05）；与模型组比较，低分子肝素钠组及“防栓1号”低、中、高剂量组的TNF-α、IL-6和IL-1β水平均显著降低（P<0.05）。见表3。

3.3 氧化应激指标的比较

与假手术组比较，模型组的SOD活性显著降低，MDA含量显著升高（P<0.05）；与模型组比较，低分子肝素钠组及“防栓1号”低、中、高剂量组的SOD活性均显著升高，MDA含量均显著降低（P<0.05）。见表4。

3.4 NF-κB、COX-2 mRNA表达水平的比较

与假手术组比较，模型组的NF-κB、COX-2 mRNA相对表达量均显著升高（P<0.05）；低分子肝素钠组及“防栓1号”低、中、高剂量组的NF-κB、COX-2 mRNA相对表达量均显著降低（P<0.05）。见表5。

3.5 p-NF-κB/NF-κB值和COX-2蛋白表达水平的比较

与假手术组比较，模型组的p-NF-κB/NF-κB值和COX-2蛋白表达量均显著升高（P<0.05）；低分子肝素钠组及“防栓1号”低、中、高剂量组的p-NF-κB/NF-κB值和COX-2蛋白表达量均显著降低（P<0.05）。见表6、图1。

4 讨论

DVT具有临床表现滞后、进展迅速、致死率高的特点，目前临床物理预防和药物预防手段均存在局限性，亟需研发安全、有效的防治药物。中医学将DVT归属于“股肿”“瘀证”范畴，《素问·阴阳应象论》提出“气伤痛，形伤肿”，认为肢体损伤后气血逆乱、瘀血阻滞脉络是核心病机^［6］，治疗应以清热解毒、理脾祛湿、利水消肿、化瘀通络为原则。“防栓1号”组方中，黄芪益气活血，使气鼓而血充；二花清热解毒，疗痈肿蕴毒；黄柏、苍术、薏苡仁清热祛湿、健脾消肿；当归补血养血，与甘草配伍可缓急解挛、和营止痛；玄参凉血滋阴、泻火解毒；水蛭、蜈蚣、全蝎等虫类药善走窜、引瘀而行，均有通络消瘀、攻毒散结的功效，全方以清热袪湿、益气化瘀为主要功效，契合DVT湿热瘀阻脉络的核心病机，本研究聚焦其对DVT的干预作用及具体机制。

血液高凝状态是DVT形成的关键病理基础。PT和APTT分别反映机体外源性和内源性凝血系统的功能，其短缩是血液高凝状态的重要标志^［7］；D-二聚体作为继发性纤溶产物，是血栓形成与溶解的特异性标志物^［8］。本研究结果显示，模型组大鼠的PT和APTT均显著缩短，且D-二聚体水平显著升高，表明造模后大鼠处于高凝状态；而“防栓1号”各剂量组的PT和APTT较模型组均显著延长，D-二聚体水平均显著降低，表明其能改善血液高凝状态，降低血栓形成风险，这与臧鹏等^［9］报道的黄芪桂枝五物汤抑制DVT形成的研究结果一致。

炎症反应在DVT的发生和发展中具有关键作用。TNF-α可诱导巨噬细胞、淋巴细胞等炎性细胞的活化，促进IL-6、IL-1β等炎症因子释放，进而损伤血管内皮功能，诱发血栓形成^［10］。本研究结果显示，模型组大鼠的TNF-α、IL-1β、IL-6水平均显著升高，而“防栓1号”各剂量组的TNF-α、IL-1β、IL-6水平较模型组均显著降低，表明其可抑制DVT相关炎症反应，这与OU M等^［11］提出的降低IL-6和C-反应蛋白水平可抑制血栓形成的结论相符。

氧化应激失衡是DVT的重要病理环节，病理状态下氧化应激可通过促进炎症因子释放、损伤血管内皮功能，加速血管系统障碍，进而促进血栓形成^［12］。SOD作为机体重要的抗氧化酶，其活性降低提示抗氧化能力减弱；MDA是脂质过氧化产物，其含量升高反映氧化损伤程度加重。本研究结果显示，模型组大鼠的SOD活性显著降低，MDA含量显著升高，而“防栓1号”各剂量组的SOD活性显著升高，MDA含量显著降低，表明其能改善氧化应激失衡，减轻血管内皮氧化损伤，从而抑制DVT形成。

NF-κB/COX-2信号通路是炎症反应与血栓形成的核心调控通路。大量炎症因子可激活NF-κB，进而级联放大炎症反应，影响血流动力学，为血栓形成提供启动信号^［13-14］。NF-κB活化可上调COX-2表达，COX-2通过促进单核细胞与内皮细胞黏附、炎症因子释放及基质金属蛋白酶活性上调，诱发血栓形成^［15］。本研究结果显示，模型组大鼠的NF-κB、COX-2 mRNA及蛋白表达水平均显著升高，而“防栓1号”各剂量组上述基因与蛋白表达显著降低，表明其能抑制NF-κB/COX-2信号通路激活，进而阻断炎症反应与血栓形成的恶性循环。

综上所述，“防栓1号”可通过改善血液高凝状态、抑制炎症反应与氧化应激失衡，从而减少大鼠下肢DVT形成，其作用机制可能与抑制NF-κB/COX-2信号通路激活相关。本研究存在一定局限性：DVT形成是多通路协同调控的复杂病理过程，本研究仅探讨了NF-κB/COX-2信号通路，未能全面揭示“防栓1号”抑制DVT形成的作用机制。后续需进一步探索其对其他潜在信号通路的影响，为临床开发更有效、安全的DVT防治策略提供更充分的理论依据。

参考文献

[1] ZHANG H， WU L， CHENG B. Preoperative Anemia and deep vein thrombosis in patients with perioperative bone trauma：A cohort study［J］. BMC Musculoskelet Disord，2022，23（1）：905．

[2] LI W， YIN Y， GU C，et al. Modified one-session endovascular treatment for deep venous thrombosis with high risk of pulmonary embolism：Short-term outcomes［J］. Phlebology，2020，35（7）：524-532．

[3] CHENG Z， JIA W， TIAN X，et al. Cotinine inhibits TLR4/NF-κB signaling pathway and improves deep vein thrombosis in rats［J］. Biosci Rep，2020，40（6）：BSR20201293．

[4] 麦叶，林道斌，刘海林，等. 化瘀消肿汤对深静脉血栓形成大鼠炎症反应的影响［J］. 中国药房，2023，34（14）：1697-1702．

[5] Ye MAI， LIN Daobin， LIU Hailin，et al. Influence of Huayu Xiaozhong Decoction on inflammatory response in rats with deep vein thrombosis［J］. China Pharmacy，2023，34（14）：1697-1702．

[6] 田佳，郭旭，雷振林，等. 紫草酸对Sepsis大鼠下肢深静脉血栓的影响及作用机制［J］. 中国老年学杂志，2021，41（24）：5631-5634．

[7] TIAN Jia， GUO Xu， LEI Zhenlin，et al. Effect of lithospermic acid on deep venous thrombosis of lower limbs in sepsis rats and its mechanism［J］. Chinese Journal of Gerontology，2021，41（24）：5631-5634．

[8] 段小云，万军，曾琳琳，等. 静脉血栓方防治大鼠股骨骨折后深静脉血栓实验研究［J］. 陕西中医，2022，43（8）：1009-1013，1018．

[9] DUAN Xiaoyun， WAN Jun， ZENG Linlin，et al. Experimental study on effects of Jingmai Xueshuan Decoction on the prevention and treatment of deep venous thrombosis in rats after femoral fracture［J］. Shaanxi Journal of Traditional Chinese Medicine，2022，43（8）：1009-1013，1018．

[10] FEI J， QIN X， MA H，et al. Resveratrol ameliorates deep vein thrombosis-induced inflammatory response through inhibiting HIF-1α/NLRP3 pathway［J］. Inflammation，2022，45（6）：2268-2279．

[11] YAO X， CHEN W， LIU J，et al. Deep vein thrombosis is modulated by inflammation regulated via sirtuin 1/NF-κB signalling pathway in a rat model［J］. Thromb Haemost，2019，119（3）：421-430．

[12] 臧鹏，李进霞，李吉，等. 黄芪桂枝五物汤防治深静脉血栓形成模型大鼠的实验研究［J］. 实用临床医药杂志，2022，26（13）：12-17．

[13] ZANG Peng， LI Jinxia， LI Ji，et al. Experimental study of Huangqi Guizhi Wuwu Decoction in prevention and treatment of rats model with deep venous thrombosis［J］. Journal of Clinical Medicine in Practice，2022，26（13）：12-17．

[14] 汪姬婵，陈学明，颜靖文. 乙酰半胱氨酸联合孟鲁司特钠对上气道咳嗽综合征症状及血清TNF-α、PCT和IFN-γ水平的影响［J］. 西北药学杂志，2020，35（6）：907-910．

[15] WANG Jichan， CHEN Xueming， YAN Jingwen. Effect of acetylcystine combined with montelukast on symptoms and serum tumor necrosis factor-α，procalcitonin and interferon-γ levels in patients with upper airway cough syndrome［J］. Northwest Pharmaceutical Journal，2020，35（6）：907-910．

[16] OU M， HAO S， CHEN J，et al. Downregulation of interleukin-6 and C-reactive protein underlies a novel inhibitory role of microRNA-136-5p in acute lower extremity deep vein thrombosis［J］. Aging，2020，12（21）：21076-21090．

[17] FEI J， WANG H， HAN J，et al. TXNIP activates NLRP3/IL-1β and participate in inflammatory response and oxidative stress to promote deep venous thrombosis［J］. Exp Biol Med，2023，248（18）：1588-1597．

[18] TANG P， WANG Y， YANG X，et al. Protective role of endothelial SIRT1 in deep vein thrombosis and hypoxia-induced endothelial dysfunction mediated by NF-κB deacetylation［J］. Inflammation，2023，46（5）：1887-1900．

[19] GAN X， ZHAO H， WEI Y，et al. Role of miR-92a-3p，oxidative stress，and p38MAPK/NF-κB pathway in rats with central venous catheter related thrombosis［J］. BMC Cardiovasc Disord，2020，20（1）：150．

[20] VABEIRYUREILAI M， LALRINZUALI K， JAGETIA G C. NF-κB and COX-2 repression with topical application of hesperidin and naringin hydrogels augments repair and regeneration of deep dermal wounds［J］. Burns，2022，48（1）：132-145．

基金资助

河南省科技发展计划项目(222102310516)