吴茱萸碱调节高迁移率族蛋白B1/Toll样受体4信号通路对带状疱疹后神经痛大鼠背根神经节神经元焦亡的影响

Effect of evodiamine on pyroptosis of dorsal root ganglion neurons in rats with postherpetic neuralgia by modulating high mobility group protein B1/Toll-like receptor 4 signaling pathway

摘要

目的 探讨吴茱萸碱（evodiamine， Evo）通过调控高迁移率族蛋白B1（high mobility group protein B1， HMGB1）/Toll样受体4（Toll-like receptor 4， TLR4）信号通路，对带状疱疹后神经痛（postherpetic neuralgia， PHN）大鼠背根神经节神经元焦亡的干预作用及机制。 方法 采用树脂毒素（resiniferatoxin， RTX）诱导构建PHN大鼠模型；斯普拉格-道利（Sprague-Dawley， SD）大鼠腹腔注射RTX 200 μg·kg^-1，造模成功后随机分为PHN组、低剂量Evo（low dose-Evo， L-Evo）组、高剂量Evo（high dose-Evo， H-Evo）组、HMGB1/TLR4通路激活剂右美托咪定（dexmedetomidine， DEX）组，每组6只。L-Evo组、H-Evo组每日分别灌胃Evo 10、40 mg·kg^-1， DEX组在灌胃Evo 40 mg·kg^-1的基础上，腹腔注射DEX 2.5 μg·kg^-1，均连续干预10 d；另取6只健康SD大鼠作为对照组，灌胃等量生理盐水。检测各组大鼠缩爪机械阈值（paw withdrawal mechanical threshold， PWMT）、缩爪热潜伏期（paw withdrawal thermal latency， PWTL）；采用GatWaik步态分析仪测定足印面积、摆动速度、步幅、持续时间等步态参数；蛋白印迹法检测背根神经组织中HMGB1、TLR4、NOD样受体蛋白3（NOD-like receptor protein 3， NLRP3）、消皮素D蛋白N端结构域（N-terminal gasdermin D， GSDMD-N）、半胱天冬酶-1（Caspase-1）蛋白表达；酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA）检测血清肿瘤坏死因子-γ（tumor necrosis factor-γ， TNF-γ）、白细胞介素（interleukin， IL）-1β、IL-6水平。分离大鼠背根神经节神经元并经免疫荧光鉴定，分为正常组、RTX组（100 nmol·L^-1 RTX干预）、Evo低浓度组（Evo-L组，100 nmol·L^-1 RTX+5 μmol·L^-1 Evo干预）、Evo高浓度组（Evo-H组，100 nmol·L^-1 RTX+10 μmol·L^-1 Evo干预）、Evo-H+pcDNA组（100 nmol·L^-1 RTX+10 μmol·L^-1 Evo+转染pcDNA空载体干预）、Evo-H+pcHMGB1组（100 nmol·L^-1 RTX+10 μmol·L^-1 Evo+转染pcDNA-HMGB1过表达载体干预）。细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8， CCK-8）检测细胞存活率；蛋白印迹法检测神经元中HMGB1、TLR4、NLRP3、GSDMD-N、Caspase-1蛋白表达；ELISA检测背根神经元上清液IL-1β、IL-18水平。 结果 与对照组比较，PHN组大鼠的PWTL及HMGB1、TLR4、NLRP3、GSDMD-N、Caspase-1蛋白表达，TNF-γ、IL-6、IL-1β水平均显著升高，足印面积、摆动速度、步幅、地面接触持续时间以及PWMT水平均显著降低（P<0.05）；与PHN组比较，L-Evo组、H-Evo组的PWTL及HMGB1、TLR4、NLRP3、GSDMD-N、Caspase-1蛋白表达，TNF-γ、IL-6、IL-1β水平均显著降低，且H-Evo组均显著低于L-Evo组；足印面积、摆动速度、步幅、地面接触持续时间以及PWMT均显著升高，且H-Evo组均显著高于L-Evo组（P<0.05）；与H-Evo组比较，DEX组的PWTL及HMGB1、TLR4、NLRP3、GSDMD-N、Caspase-1蛋白表达，TNF-γ、IL-6、IL-1β水平均显著升高，足印面积、摆动速度、步幅、地面接触持续时间以及PWMT均显著降低（P<0.05）。细胞实验中，与正常组比较，RTX组的细胞存活率显著下降，HMGB1、TLR4、NLRP3、GSDMD-N、Caspase-1蛋白表达及IL-18、IL-1β水平均显著升高（P<0.05）；与RTX组比较，Evo-L组和Evo-H组的细胞存活率均显著升高，且Evo-H组显著高于Evo-L组；HMGB1、TLR4、NLRP3、GSDMD-N、Caspase-1蛋白表达及IL-18、IL-1β水平均显著降低，且Evo-H组显著低于Evo-L组（P<0.05）；与Evo-H组、Evo-H+pcDNA组比较，Evo-H+pcHMGB1组的细胞存活率显著降低，HMGB1、TLR4、NLRP3、GSDMD-N、Caspase-1蛋白表达及IL-18、IL-1β水平均显著升高（P<0.05）。 结论 Evo可通过抑制HMGB1/TLR4通路的激活，下调炎症因子释放及焦亡相关蛋白（NLRP3、GSDMD-N、Caspase-1）的表达，从而抑制PHN大鼠背根神经节神经元焦亡，改善神经痛症状。

Abstract

Objective To investigate the effect and mechanism of evodiamine （Evo） on neuronal pyroptosis in the dorsal root ganglion of rats with postherpetic neuralgia （PHN） by modulating the high mobility group protein B1 （HMGB1）/Toll-like receptor 4 （TLR4） signaling pathway. Methods A PHN rat model induced by resiniferatoxin （RTX） was constructed； Sprague Dawley （SD） rats were intraperitoneally injected with RTX 200 μg·kg^-1. After successful modeling， they were randomly divided into PHN group， low-dose Evo （L-Evo） group， high-dose Evo （H-Evo） group， and HMGB1/TLR4 pathway activator dexmedetomidine （DEX） group， with 6 rats in each group. Among the groups， the L-Evo group and the H-Evo group were intraperitoneally injected with 10 and 40 mg·kg^-1 of Evo per day， respectively， and the DEX group was intraperitoneally injected with 2.5 μg·kg^-1 of DEX for 10 days in the basis of 40 mg·kg^-1 of Evo. 6 healthy SD rats were randomly selected as the control group and given the same amount of normal saline. The sensitivity of rats in each group to mechanical stimulation and thermal stimulation was detected. GatWaik gait analyzer was used to measure the gait parameters related to footprint area， swing speed， stride length， and duration. Western blotting was used to detect the protein expressions of HMGB1， TLR4， NOD-like receptor protein 3 （NLRP3）， N-terminal gasdermin D （GSDMD-N） and Caspase-1. Enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） was used to detect the levels of tumor necrosis factor-γ （TNF-γ）， interleukin （IL）-1β （IL-1β）， and IL-6. Rat dorsal root ganglion neurons were isolated and identified by immunofluorescence method. The neurons were divided into normal group， RTX group （100 nmol·L^-1 RTX）， EVO-L， H group （100 nmol·L^-1 RTX+5， 10 μmol·L^-1 Evo）， and EVO-H +pcDNA group （100 nmol·L^-1 RTX） RTX+10 μmol·L^-1 Evo+ transfected pcDNA）， and EVO-H +pcHMGB1 group （100 nmol·L^-1 RTX+10 μmol·L^-1 Evo+ transfected pcDNA-HMGB1）. CCK-8 was used to detect cell viability. The protein expressions of HMGB1， TLR4， NLRP3， GSDMD-N and Caspase-1 in dorsal root ganglion neurons were detected by Western blotting. The levels of IL-1β and IL-18 in dorsal root ganglion neurons were detected by ELISA. Results Compared with the control group， the paw withdrawal thermal latency （PWTL）， and the levels of HMGB1， TLR4， NLRP3， GSDMD-N， Caspase-1， TNF-γ， IL-6 and IL-1β in the PHN group were higher， while the footprint area， swing speed， stride length， ground contact duration， and PWMT were significantly reduced （P<0.05）. Compared with the PHN group， the PWTL， and the levels of HMGB1， TLR4， NLRP3， GSDMD-N， Caspase-1， TNF-γ， IL-6 and IL-1β in the L-Evo group and H-Evo group were gradually decreased， while the footprint area， swing speed， stride length， ground contact duration， and PWMT were gradually increased （P<0.05）. Compared with the H-Evo group， the PWTL， and the levels of HMGB1， TLR4， NLRP3， GSDMD-N， Caspase-1， TNF-γ， IL-6 and IL-1β in the DEX group were higher， while the footprint area， swing speed， stride length， ground contact duration， and PWMT were lower （P<0.05）. Compared with the normal group， the cell survival rate in the RTX group was decreased， while the protein expressions of HMGB1， TLR4， NLRP3， GSDMD-N， Caspase-1 and the levels of IL-18 and IL-1β were increased （P<0.05）. Compared with the RTX group， the cell survival rate in Evo-L and Evo-H groups was gradually increased， and the protein expressions of HMGB1， TLR4， NLRP3， GSDMD-N， Caspase-1 and the levels of IL-18 and IL-1β were gradually decreased （P<0.05）. Compared with the Evo-H group and Evo-H+pcDNA group， the survival rate of Evo-H+pcHMGB1 group was decreased， and the protein expressions of HMGB1， TLR4， NLRP3， GSDMD-N， Caspase-1 and the levels of IL-18 and IL-1β were increased （P<0.05）. Conclusion Evo may inhibit the expression of inflammatory factors and pyroptosis related proteins by inhibiting the HMGB1/TLR4 pathway， thereby inhibiting pyroptosis of dorsal root ganglion neurons in PHN rats.

Graphical abstract

关键词

吴茱萸碱 / 带状疱疹后神经痛 / 高迁移率族蛋白B1/Toll样受体4通路 / 神经元焦亡 / 背根神经节 / 炎症因子

Key words

evodiamine / postherpetic neuralgia / high mobility group protein B1/Toll-like receptor 4 / neuronal pyroptosis / dorsal root ganglion / inflammatory factor

带状疱疹后神经痛（postherpetic neuralgia， PHN）是带状疱疹（herpes zoster， HZ）皮疹出现后持续90 d及以上的慢性神经病理性疼痛，为HZ的常见并发症。HZ由水痘-带状疱疹病毒（varicella-zoster virus， VZV）潜伏再激活引发，美国每年新发病例超100万例，约20%的HZ患者会进展为PHN，临床表现为局限于原始皮疹部位的间歇性神经病理性疼痛，如尖锐痛、刺痛、悸动痛或灼痛^［1］。该疼痛具有持续性和剧烈性，不仅严重影响患者的生活质量，还会给家庭带来沉重的经济负担。目前HZ疫苗虽可预防PHN，但防护效果有限。临床治疗以药物和介入治疗为主，然而约50%的PHN患者接受现有治疗无效，且伴有明显不良反应与治疗风险^［2］。因此，深入探究PHN的发病机制，寻找高效低毒的治疗药物具有重要的临床意义。

吴茱萸碱（evodiamine， Evo）是一种吲哚喹唑啉生物碱，提取自芸香科吴茱萸属植物，具有抗氧化、抗细胞凋亡和抗炎等多种生物活性。已有研究证实，Evo可抑制由脂多糖诱导的髓核细胞凋亡、细胞外基质降解和炎症反应，还能减轻神经损伤和神经炎症^［3-4］，提示其可能具有干预神经病理性疼痛的潜力。

高迁移率族蛋白B1（high mobility group protein B1， HMGB1）作为关键促炎介质，在神经炎症的发生、发展中发挥关键调控作用。HMGB1与Toll样受体4（Toll-like receptor 4， TLR4）相互作用后，可启动下游信号通路，促进促炎细胞因子释放。细胞焦亡是由消皮素（gasdermin， GSDM）家族蛋白介导的程序性细胞死亡，其核心机制为NOD样受体蛋白3（NOD-like receptor protein 3， NLRP3）炎症小体激活，使消皮素D（gasdermin D， GSDMD）被剪切为GSDMD-N和GSDMD-C，其中GSDMD-N作为细胞焦亡的效应分子，介导细胞膜穿孔，释放炎症因子^［5］。已有研究证实，抑制HMGB1/TRL4通路可减轻神经炎症，进而改善小鼠糖尿病神经性疼痛^［6-7］。但关于HMGB1/TLR4通路调控PHN大鼠背根神经节神经元焦亡的研究较少，且Evo是否通过该通路干预PHN的作用机制尚未明确。

因此，本研究以树脂毒素（resiniferatoxin， RTX）诱导的PHN大鼠为模型，探究Evo对背根神经节神经元焦亡的干预作用及其调控HMGB1/TLR4通路的内在机制，为PHN的临床治疗提供新的实验依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Varioskan LUX型多功能酶标仪（美国Thermo Fisher公司）； ChemiDoc™型化学发光成像仪、PowerPac™型电泳仪，均购自美国Bio-Rad公司；GatWaik步态分析系统（荷兰Noldus公司）。

1.2 试药

RTX（批号RG-A260803，上海优宁维生物科技股份有限公司）；HMGB1/TLR4通路激活剂右美托咪定（dexmedetomidine，DEX，批号SML0956，德国Merck公司）；Evo标准品（批号1031421，质量分数≥98%，上海晶风生物科技有限公司）；细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8，CCK-8，货号CA1210-500T，上海吉至生化科技有限公司）；HMGB1、TLR4、GSDMD-N、NLRP3、半胱天冬酶-1（cysteine-dependent aspartate-specific protease-1， Caspase-1）、山羊抗鼠免疫球蛋白G（immunoglobulin G， IgG）H&L、山羊抗兔IgG H&L、β-tubulin（批号分别为3935S、14358S、36425S、15101S、2225S、91196、35401、2146S），均购自美国CST公司；白细胞介素（interleukin， IL）-1β、肿瘤坏死因子-γ（tumor necrosis factor-γ， TNF-γ）、IL-6酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA）试剂盒（批号分别为ml002859、ml027464、ml102828），均购自上海酶联生物科技有限公司；磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline， PBS）、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid， BCA）蛋白测定试剂盒（批号分别为C0221A、P0012S），均购自上海碧云天生物技术股份有限公司；全蛋白提取试剂盒（批号为BC3710，北京索莱宝科技有限公司）；增强化学发光（enhanced chemiluminescence， ECL）试剂盒（批号为1705060，美国Bio-Rad公司）。

1.3 实验动物与细胞

斯普拉格-道利（Sprague-Dawley， SD）大鼠，生产许可证号：SYXK（苏）2023-0093，购自江苏恒生检测有限公司，适应性喂养1周后进行实验。采用3只雌性大鼠和1只雄性大鼠合笼繁殖，取出生1 d的幼年大鼠，用于背根神经节神经元的分离和培养。本研究经医院动物伦理委员会审核、批准。

2 方法

2.1 造模、分组与给药

SD大鼠适应性喂养1周后，进行GatWaik步态分析系统适应性训练，为期2周，筛选出3次均能顺利通过通道且无停顿的大鼠用于造模。采用RTX诱导构建PHN大鼠模型，大鼠经麻醉后，腹腔注射RTX 200 μg·kg^-1［8］。造模后3~4 d，检测大鼠机械敏感性与热刺激敏感性，当造模大鼠的机械阈值、热疼痛阈值与造模前出现明显差异，判定为造模成功。

将造模成功的大鼠随机分为PHN组、低剂量Evo（low dose-Evo， L-Evo）组、高剂量Evo（high dose-Evo， H-Evo）组、DEX组，每组6只。其中L-Evo组、H-Evo组每日分别灌胃Evo 10、40 mg·kg^{-1 ［9］}，DEX组在灌胃Evo 40 mg·kg^-1的基础上，腹腔注射DEX 2.5 μg·kg^{-1 ［10］}，均连续干预10 d；另取6只健康SD大鼠作为对照组，每日灌胃等量生理盐水。

2.2 机械刺激敏感性的检测

采用von Frey细丝机械痛阈检测法，参照常成等^［8］的研究方法并稍作优化，通过“向上-向下”方法检测大鼠后爪的机械退缩阈值（paw withdrawal mechanical threshold， PWMT），以量化评估其机械刺激敏感性。

将大鼠单独放置于底部为金属网状地板的悬挂室中，在安静、无干扰环境下适应30 min，以消除应激反应对检测结果的影响。随后，手持von Frey细丝垂直轻触大鼠双侧后爪足底中部（避开爪垫边缘），施加适度压力使细丝弯曲，持续刺激6 s。以大鼠出现快速缩爪、后爪退缩或舔舐后爪行为作为阳性反应。若大鼠未出现阳性反应，立即更换强度更高的von Frey细丝进行刺激。若出现阳性反应，则更换强度更低的细丝继续检测，逐步缩小阈值范围。每只大鼠每个刺激强度重复测试5次，以出现≥3次阳性反应的最低刺激强度作为该大鼠的PWMT。

2.3 热刺激敏感性的检测

将大鼠置于30 ℃有机玻璃箱中适应30 min，启动热源装备，将热源光束聚焦于大鼠后爪足底，记录大鼠缩爪时间（最长照射时间为30 s，以避免组织损伤）。间隔2 min重复检测5次，取后3次检测结果的平均值作为缩爪热潜伏期（paw withdrawal thermal latency， PWTL）。

2.4 GatWaik步态参数检测

在无进食、无饮水等外界干扰的条件下，采用GatWaik步态分析仪测量大鼠单爪与地面接触持续时间（s）、足印面积（cm²）、摆动速度（cm·s^-1）、步幅（同一只爪两次着地的间隔距离，cm）等参数，分析疼痛相关行为学改变。

2.5 脊髓组织相关蛋白表达的检测

大鼠经麻醉处死后，冰上分离L4~6腰段脊髓组织（部分留作ELISA检测），采用全蛋白提取试剂盒提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。经蛋白变性、垂直电泳、转膜、脱脂奶粉封闭后，加入HMGB1（1∶1 000）、TLR4（1∶1 000）、GSDMD-N（1∶500）、NLRP3（1∶1 000）、Caspase-1（1∶1 000）、β-tubulin（1∶1 000）一抗，4 ℃孵育过夜；次日加入二抗（1∶5 000），室温孵育1 h；ECL化学发光显色，化学发光成像仪采集图像并分析蛋白相对表达量。

2.6 脊髓组织炎症因子水平的检测

将2.5项下预留的脊髓组织研磨制成匀浆，离心取上清液，严格按照IL-6、TNF-γ、IL-1β ELISA试剂盒说明书进行操作，多功能酶标仪测定吸光度值，计算各炎症因子的水平。

2.7 背根神经节神经元的分离、培养和鉴定

出生1 d的幼年大鼠经体积分数75%乙醇消毒后，无菌条件下剥离背根神经节并剪碎，加入体积分数0.25%胰蛋白酶消化40 min，加入体积分数10%胎牛血清终止消化。反复吹打后，经70 μm细胞过滤器过滤，以2 000 r·min^-1离心5 min，沉淀用含体积分数10%胎牛血清的高糖杜尔贝科改良伊格尔（Dulbecco’s modified eagle medium， DMEM）培养基重悬，接种于6孔板（2×10⁵个·孔^-1）。6 h后更换为神经元专用培养基，置于37 ℃、含体积分数5% CO₂培养箱中培养^［11］，常规换液、传代，倒置显微镜观察细胞形态并采集图像。

采用微管相关蛋白2（microtubule-associated protein 2， MAP2）免疫荧光染色鉴定分离的背根神经节神经元：将盖玻片放入6孔板，接种背根神经节神经元，在37 ℃、含体积分数5% CO₂培养箱中培养6 h后，用体积分数4%多聚甲醛固定30 min， PBS洗涤3次；加入50 μL体积分数0.2% Triton X-100破裂细胞，PBS洗涤3次；体积分数1% BSA封闭1 h后，加入一抗MAP2室温孵育2 h，山羊抗小鼠IgG H&L（Alexa Fluor® 647）室温孵育1.5 h；PBS洗涤后，4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染核10 min，激光共聚焦显微镜观察并采集图像。

2.8 细胞的干预和分组

大鼠背根神经节神经元经0、5、10、20、40、80 μmol·L^-1 Evo处理24 h^［12］后检测细胞存活率，并计算半数抑制浓度（median inhibition concentration， IC₅₀）值，根据IC₅₀结果选择5、10 μmol·L^-1 Evo进行后续实验。大鼠背根神经节神经元用100 nmol·L^-1 RTX处理10 min后^［13］，再用5、10 μmol·L^-1 Evo培养24 h，记为Evo低浓度组（Evo-L组）、Evo高浓度组（Evo-H组）；大鼠背根神经节神经元用100 nmol·L^-1 RTX处理10 min后，先转染pcDNA或pcDNA-HMGB1，再用10 μmol·L^-1 Evo培养24 h，记为Evo-H+pcDNA组、Evo-H+pcHMGB1组；仅用100 nmol·L^-1 RTX处理的大鼠背根神经节神经元记作RTX组；正常培养的神经元作为正常组。

2.9 细胞活力的检测

将处理后的背根神经节神经元以5 000个·孔^-1的密度接种细胞于96孔板中，孵育24 h后每孔加入10 μL CCK-8溶液，继续孵育2 h，多功能酶标仪测定450 nm处的吸光度值，计算细胞存活率。

2.10 神经元相关蛋白表达的检测

采用放射免疫沉淀法裂解（radio immunoprecipitation assay， RIPA）缓冲液提取各组神经元总蛋白，参照2.5项下的实验步骤，检测HMGB1、TLR4、GSDMD-N、NLRP3、Caspase-1蛋白的相对表达量。

2.11 神经元炎症因子水平的检测

收集各组神经元细胞，离心后取上清，严格按照IL-18、IL-1β ELISA试剂盒说明书操作，用多功能酶标仪测定450 nm波长处的吸光度值，计算各炎症因子的水平。

2.12 统计学方法

采用SPSS 26.00软件进行统计分析。实验数据以（\overline{x}\pm s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组大鼠PWMT、PWTL的比较

与对照组比较，PHN组的PWMT显著降低，PWTL显著升高（P<0.05）；与PHN组比较，L-Evo组、H-Evo组的PWMT均显著升高，且H-Evo组显著高于L-Evo组；L-Evo组、H-Evo组的PWMT均显著降低，且H-Evo组显著低于L-Evo组（P<0.05）；与H-Evo组比较，DEX组的PWMT显著降低，PWTL显著升高（P<0.05）。见表1。

3.2 各组大鼠GatWaik步态参数的比较

与对照组比较，PHN组的足印面积、摆动速度、步幅、地面接触持续时间均显著下降（P<0.05）；与PHN组比较，L-Evo组、H-Evo组的上述步态参数均显著升高，且H-Evo组均显著高于L-Evo组（P<0.05）；与H-Evo组比较，DEX组的上述步态参数均显著下降（P<0.05）。见表2。

3.3 各组大鼠脊髓组织相关蛋白表达情况的比较

与对照组比较，PHN组大鼠的脊髓组织HMGB1、TLR4、NLRP3、GSDMD-N、Caspase-1蛋白均显著升高（P<0.05）；与PHN组比较，L-Evo组、H-Evo组的上述蛋白表达均逐渐降低，且H-Evo组均显著低于L-Evo组（P<0.05）；与H-Evo组比较，DEX组的上述蛋白表达均显著升高（P<0.05）。见表3、图1。

3.4 各组大鼠脊髓组织炎症因子水平的比较

与对照组比较，PHN组的TNF-γ、IL-6、IL-1β水平均显著升高（P<0.05）；与PHN组比较，L-Evo组、H-Evo组的上述炎症因子水平均显著下降，且H-Evo组均显著低于L-Evo组（P<0.05）；与H-Evo组比较，DEX组的上述炎症因子水平均显著升高（P<0.05）。见表4。

3.5 大鼠背根神经节神经元的分离与鉴定

在倒置显微镜下观察可见，分离培养的背根神经节神经元呈圆形大胞体，伴有多个突起，可见少量神经胶质细胞和非神经元核。免疫荧光染色结果显示，MAP2的阳性表达率超过80%，表明背根神经节神经元分离成功。见图2。

3.6 Evo体外作用浓度的筛选

用0、5、10、20、40、80 μmol·L^-1 Evo处理大鼠背根神经节神经元24 h后，细胞存活率分别为100%、（99.59%±5.21%）、（98.21%±6.05%）、（86.43%±

5.36%）、（75.84%±5.26%）、（55.48%±5.06%）。与0 μmol·L^-1比较，20、40、80 μmol·L^-1 Evo显著降低细胞存活率（P<0.05），而5、10 μmol·L^-1 Evo对细胞存活率无明显影响，故选择5、10 μmol^-1进行后续实验。

3.7 各组大鼠背根神经节神经元细胞存活率的比较

与正常组比较，RTX组的细胞存活率显著下降（P<0.05）；与RTX组比较，Evo-L组、Evo-H组的细胞存活率均显著升高，且Evo-H组显著高于Evo-L组（P<0.05）；与Evo-H组、Evo-H+pcDNA组比较，Evo-H+pcHMGB1组的细胞存活率显著下降（P<0.05）。见表5。

3.8 各组大鼠背根神经节神经元细胞相关蛋白表达的比较

与正常组比较，RTX组神经元中HMGB1、TLR4、NLRP3、GSDMD-N、Caspase-1蛋白表达均显著升高（P<0.05）；与RTX组比较，Evo-L组、Evo-H组上述蛋白表达均显著下降，且Evo-H组均显著低于Evo-L组（P<0.05）；与Evo-H组、Evo-H+pcDNA组比较，Evo-H+pcHMGB1组上述蛋白表达均显著升高（P<0.05）。见表6、图2。

3.9 各组大鼠背根神经节神经元细胞中炎症因子水平的比较

与正常组比较，RTX组的IL-18、IL-1β水平均显著升高（P<0.05）；与RTX组比较，Evo-L组、Evo-H组的IL-18、IL-1β水平均显著下降，且Evo-H组均显著低于Evo-L组（P<0.05）；与Evo-H组、Evo-H+pcDNA组比较，Evo-H+pcHMGB1组的IL-18、IL-1β水平均显著升高（P<0.05）。见表7。

4 讨论

PHN属于神经病理性疾病，多发于老年人群中，主要是由于带状疱疹病毒引起的^［14-15］。PHN发生的危险因素包括年龄增长、免疫功能抑制、HZ发作期剧烈疼痛、异常性疼痛、眼部受累和糖尿病病史等^［16］，其临床治疗面临诸多挑战——症状难以完全消退，仅不足一半患者能获得显著缓解，且患者多为年老体弱群体，合并症多，现有治疗的不良反应与耐受性问题突出，故亟需开发高效低毒的干预药物。

既往研究证实，RTX作为超强瞬时受体电位香草醛1（transient receptor potential vanilloid 1， TRPV1）激动剂，可消耗辣椒素敏感传入神经，导致大鼠机械和热敏感性出现长期异常，与PHN患者的临床特征高度吻合^［17］。相较于病毒感染模型，RTX模型避免了病毒中枢神经传播导致的组织炎症、皮肤病变和瘫痪等干扰，是筛选PHN治疗药物的理想非病毒性模型^［18-19］。本研究采用RTX构建PHN大鼠模型，结果显示，与对照组比较，PHN组的步态参数（足印面积、摆动速度、步幅、持续时间等）、PWMT均显著下降，PWTL显著升高，表明PHN大鼠模型构建成功。

Evo是从芸香科吴茱萸属植物中提取的天然吲哚喹唑啉生物碱，具有抗炎、抗菌、抗凋亡等多种药理活性，其镇痛效果显著且不良反应轻微，可有效规避阿片类药物的耐药性与成瘾性风险^［20］。既往研究已证实，Evo通过抑制炎性反应可缓解哮喘、结肠炎等炎症相关疾病^［21-22］。WANG R等^［23］研究发现，Evo能通过调节神经因子表达、抑制炎症级联反应减轻神经损伤，从而发挥缓解神经疼痛的作用。本研究体内实验结果显示，Evo可剂量依赖性升高PHN大鼠的PWMT和步态参数，同时下调焦亡相关蛋白和炎症因子水平，表明Evo能有效缓解PHN大鼠的神经痛症状并减轻神经炎症。体外实验进一步证实，Evo可提高RTX损伤的大鼠背根神经节神经元存活率，降低IL-18、IL-1β等炎症因子释放，证实其对神经元的保护作用及抗炎效应。

HMGB1作为关键促炎介质，可通过启动炎症反应参与神经炎症的发生和发展^［24-25］。已有研究表明，在脊神经结扎诱导的神经病理性疼痛大鼠模型中，抑制HMGB1表达可延缓急性神经痛向慢性转化并减轻疼痛程度，使其成为神经病理性疼痛的潜在治疗靶点^［26-27］。TLR4是HMGB1的有效受体之一，二者结合后可激活脊髓小胶质细胞，促进促炎细胞因子释放，进而介导神经病理性疼痛的进展^［28-29］。本研究结果显示，与PHN组比较，Evo处理后大鼠组织及血清中HMGB1、TLR4表达水平显著下降，TNF-γ、IL-6、IL-1β等促炎因子水平同步下降；而施加HMGB1/TLR4通路激活剂后，上述指标的下调效应备显著逆转。体外实验进一步证实，Evo可降低RTX诱导的大鼠背根神经节神经元中HMGB1、TLR4和促炎因子IL-18、IL-1β的表达，且过表达HMGB1后，Evo的上述调控作用被完全逆转。上述结果表明，Evo可能通过抑制HMGB1/TLR4通路发挥对RTX诱导的大鼠背根神经节神经元损伤相关疼痛的缓解作用。

细胞焦亡是一种与炎症因子释放密切相关的程序性细胞死亡形式，由其介导的神经元脱髓鞘损伤是神经病理性疼痛的重要发病机制之一^［30-31］。本研究针对细胞焦亡相关蛋白的检测结果显示，Evo处理后PHN大鼠背根神经节组织中HMGB1、TLR4及焦亡通路关键蛋白（NLRP3、GSDMD-N、Caspase-1）表达均显著下调，而通路激活剂可逆转该效应。已有研究证实，GSDMD作为NLRP3炎症小体的下游效应分子，被Cleaved-Caspase-1切割后产生的N-GSDMD可在细胞膜上形成孔道，促进促炎细胞因子释放并启动细胞焦亡^［32］，这与本研究中Evo通过抑制GSDMD-N生成发挥抗焦亡作用的结果一致。表明Evo可能通过抑制HMGB1/TLR4通路，下调NLRP3、GSDMD-N、Caspase-1等焦亡相关蛋白表达，减少炎症因子释放，进而抑制PHN大鼠背根神经节神经元焦亡，最终缓解PHN大鼠的神经痛症状。

本研究仍存在一定局限性：仅初步证实HMGB1/TLR4通路在Evo干预PHN中的作用，未深入探讨其与NF-κB等下游通路的调控关系^［29］；神经炎症与小胶质细胞活化密切相关^［8］，本研究未涉及Evo对脊髓小胶质细胞的影响。未来将进一步明确HMGB1、TLR4、NF-κB的调控网络，探究Evo对小胶质细胞活化的作用，完善Evo治疗PHN的分子机制。

综上所述，Evo可通过抑制HMGB1/TLR4通路，下调NLRP3、GSDMD-N、Caspase-1等焦亡相关蛋白表达，减少炎症因子释放，从而抑制背根神经节神经元焦亡，缓解PHN大鼠的神经痛症状，为PHN的临床治疗提供新的实验依据与候选药物。

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