二苯乙烯苷磷脂复合物的制备、表征及体外透皮性的研究

Preparation，characterization and physicochemical properties of 2，3，5，4'-tetrahydroxystilbene-2-O- β -d-glucoside phospholipid complex

摘要

目的 制备二苯乙烯苷磷脂复合物（2， 3， 5， 4'-tetrahydroxystilbene-2-O-β-d-glucoside phospholipid complex， TSG-PC）以提高透皮性能，并对其理化性质进行研究。 方法 采用溶剂挥发法制备TSG-PC， 以Box-Behnken响应面法优选其制备工艺，采用X射线衍射（X-ray diffraction， XRD）、差示扫描量热法（differential scanning calorimetry， DSC）、红外光谱（infrared spectroscopy， IR）、扫描电镜（scanning electron microscope， SEM）和透射电镜（​transmission electron microscope， TEM）考察其理化性质，并进行溶解度测定及经皮渗透性考察。 结果 最佳制备工艺为：采用大豆卵磷脂作为复合载体，以无水乙醇作为反应溶剂， TSG与PC的比例为1∶1。通过Box-Behnken响应面法优选的反应温度为43.5 ℃，反应时间为70 min，二苯乙烯苷的质量浓度为20 mg·mL^-1。该工艺显著提高了TSG-PC在正辛醇中的溶解度，从24.28 mg·mL^-1增加到93.93 mg·mL^-1，表明其脂溶性显著增加。体外经皮渗透性实验结果显示， TSG-PC在24 h内的累积渗透药量比TSG显著提高，这表明其在皮肤渗透方面具有更好的表现。 结论 磷脂复合物的形成可改善二苯乙烯苷的理化性质和体外经皮性能。

Abstract

Objective To prepare 2，3，5，4'-tetrahydroxystilbene-2-O-β-d-glucoside phospholipid complex （TSG-PC） to improve the skin permeability and to investigate its properties. Methods Solvent evaporation method was used to prepare TSG-PC. The preparation technology was optimized by Box-Behnken response surface methodology. The formation of TSG-PC was confirmed by X-ray diffraction （XRD）， differential scanning calorimetry （DSC）， infrared spectroscopy （IR）， scanning electron microscopy （SEM） and transmission electron microscope （TEM）. Results The preparation process was optimized as follows： soybean lecithin was used as the composite carrier， absolute ethanol as the reaction solvent， the mass ratio of TSG to PC was 1∶1， the temperature was 43.5 ℃， the time was 70 min， and the drug concentration was 20 mg·mL^-1. This optimized process significantly enhanced the solubility of TSG-PC in n-octanol， increasing from 24.28 mg·mL^-1 to 93.93 mg·mL^-1， indicating a remarkable improvement in its liposolubility. In vitro release study revealed that TSG-PC exhibited sustained release behavior. Conclusion The formation of phospholipid complexes can improve the physicochemical properties and in vitro transdermal performance of TSG.

Graphical abstract

关键词

二苯乙烯苷 / 磷脂复合物 / 结构表征 / 溶解度 / 经皮渗透

Key words

2，3，5，4'-tetrahydroxystilbene-2-O-β-d-glucoside / phospholipid complex / structural characterization / solubility / transdermal permeability

二苯乙烯苷，化学名为2，3，5，4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-d-葡萄糖苷（2，3，5，4'-tetrahydroxystilbene-2-O-β-d-glucoside， TSG），是蓼科植物何首乌的主要活性成分，属于多羟基酚类化合物，具有较强的抗氧化、抗炎、抗衰老及抗骨质疏松等药理作用^［1-4］。现代药理学研究发现，二苯乙烯苷可以促进黑色素瘤细胞合成黑色素，表明其可对白癜风皮损或其他白斑类损害的皮肤起到黑化作用，可用于白癜风的治疗，且毒性和不良反应均较小^［5-7］。然而，二苯乙烯苷水溶性较大导致药物外用易挥发且难以穿透皮肤屏障，无法有效渗透保留，不能持久地发挥药效。

磷脂复合物（phosphohpid complex，PC）是指在非质子传递体系溶剂中，药物与磷脂可以在一定条件下与一定结构的药物分子通过电荷迁移作用形成较为稳定的化合物或络合物。目前，国内外对根皮素、橙皮苷、水飞蓟素等天然活性成分-PC已经展开了广泛的研究^［8-12］。药物与磷脂形成复合物后，其理化性质和生物学特性均较原药物发生较大变化，如熔点、吸收系数、光谱特征等会发生明显变化，活性成分的药理作用及疗效增强，作用时间延长，透皮渗透性提高，不良反应减少。本研究通过研制TSG-PC以改善TSG的脂溶性，通过响应面法优选其制备工艺，并对复合物进行结构表征，对溶解度和体外渗透性进行考察，为TSG的开发和应用奠定基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1200型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；HH-2型数显恒温水浴锅（江苏金坛市友联仪器研究所）；超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）；AUX220型电子分析天平（精密度为0.1 mg，日本岛津公司）；RE-2000A型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；DZF-1型真空干燥箱（上海医用恒温设备厂）；DSC200F3型差示扫描量热仪（德国耐驰公司）；TENSOR27型红外光谱仪（德国布鲁尔公司）；Ultima Ⅳ型X射线衍射仪（日本Rigaku公司）；HT7700型透射式电子显微镜（日本株式会社日立高新技术那珂事业所）；ZTY型智能透皮试验仪（巩义市科瑞仪器有限公司）；SU1000型扫描电子显微镜（日本株式会社日立高新技术那珂事业所）。

1.2 试剂

二苯乙烯苷（桂林益天成生物科技有限公司）；二苯乙烯苷对照品（中国食品药品检定研究院）；大豆卵磷脂（江苏曼氏生物科技股份有限公司）；蛋黄卵磷脂［艾伟拓（上海）医学科技有限公司］；无水乙醇、二氯甲烷、丙酮、正丁醇均为分析纯；水为纯化水。

1.3 实验动物

SD雄性小鼠，SPF级，体质量为18~22 g，购自杭州医学院，许可证号为SCXK（浙）2019-0002，质量合格证号为20211111Abzz0100000117，动物实验遵循医院有关动物管理和使用的规定。

2 方法与结果

2.1 TSG-PC的制备

采用溶剂挥发法制备TSG-PC。取一定质量比的TSG和磷脂溶解于无水乙醇中，在搅拌下反应一定时间，利用溶剂挥发性减压除去反应液，在得到的反应物中加入二氯甲烷溶解，将溶液滤过，除去游离的TSG，取续滤液减压浓缩后平铺于不锈钢盘内，50 ℃真空干燥24 h，得淡黄色的TSG-PC，粉碎后过80目筛，避光保存。

2.2 评价方法的建立

利用TSG不溶于二氯甲烷而TSG-PC和磷脂均可溶于二氯甲烷的特性。将反应得到的TSG-PC溶解于二氯甲烷中，过滤收集沉淀，干燥并称质量，计算复合率。复合率（%）=［（M－M₁）/M］×100%，其中，M为TSG的投药量，M₁为沉淀的质量。

2.3 单因素影响实验

2.3.1 磷脂种类的考察

固定反应温度为60.0 ℃，反应溶剂为甲醇，反应时间为60 min，药物质量浓度为5 mg·mL^-1，TSG与PC的比例为1∶2.0，考察分别以大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂和氢化大豆卵磷脂作为载体时，对复合率的影响，结果显示，以大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂和氢化大豆卵磷脂作为载体时，复合率分别为77.40%、26.79%、24.50%。表明使用大豆卵磷脂作为载体时，TSG-PC的复合率最高。因此，选择大豆卵磷脂作为复合载体。

2.3.2 反应溶剂的选择

固定TSG与PC的比例为1∶2.0，反应温度为60.0 ℃，反应时间为60 min，药物质量浓度为5 mg·mL^-1，考察使用体积分数75%乙醇、无水乙醇、丙酮和甲醇对复合率的影响。结果显示，使用体积分数75%乙醇、无水乙醇、丙酮和甲醇作为反应溶剂时复合率分别为40.37%、88.12%、9.10%、77.40%。表明以无水乙醇作为反应溶剂的复合率最高，故选择无水乙醇作为反应溶剂。

2.3.3 反应温度的考察

固定反应时间为60 min，反应溶剂为无水乙醇，TSG与PC的比例为1∶2.0，药物质量浓度为5 mg·mL^-1，考察以20.0、40.0、60.0、80.0 ℃为反应温度时的复合率。结果显示，以20.0、40.0、60.0、80.0 ℃为反应温度时的复合率分别为50.68%、92.75%、68.40%、55.60%。表明随着反应温度的升高，复合率呈下降的趋势，这可能与TSG在高温下出现降解有关。基于复合率的最大化以及避免高温导致的TSG降解，选择反应温度为40.0 ℃。

2.3.4 反应时间的考察

固定反应溶剂为无水乙醇，TSG与PC的比例为1∶2.0、反应温度为40.0 ℃，药物质量浓度为5 mg·mL^-1，考察反应时间为30、60、90、120 min的复合率。结果显示，反应时间为30、60、90、120 min时复合率分别为80.99%、98.79%、97.95%、96.51%。表明当反应时间大于60 min后复合率受时间影响较小，故选择反应时间为60 min。

2.3.5 药物质量浓度的影响

固定反应温度为40.0 ℃，反应溶剂为无水乙醇，反应时间为60 min，TSG与PC的比例为1∶2.0，考察药物质量浓度为5、10、20、30 mg·mL^-1时的复合率。结果显示，药物质量浓度为5、10、20、30 mg·mL^-1时的复合率分别为65.79%、81.42%、98.55%、97.60%。表明药物质量浓度为20 mg·mL^-1时复合率最高，选择药物质量浓度为20 mg·mL^-1。

2.3.6 TSG与PC比例的考察

固定药物质量浓度为20 mg·mL^-1，反应温度为40.0 ℃，反应溶剂为无水乙醇，反应时间为60 min，考察药物载体比为1∶0.5、1∶1.0、1∶1.5、1∶2.0、1∶2.5时的复合率。结果显示，药物载体比为1∶0.5、1∶1.0、1∶1.5、1∶2.0、1∶2.5时的复合率分别为0、98.55%、96.29%、98.81%、98.34%。表明当药物载体比为1∶0.5时，复合物无法成型，而随着磷脂用量的增加，复合率变化不大，最终选择药物载体比为1∶1.0。

2.4 Box-Behnken响应面法优化TSG-PC的制备工艺

2.4.1 实验设计

根据Box-Behnken响应面法，在单因素考察及预实验结果的基础上，选用反应时间（x₁）、反应温度（x₂）、药物质量浓度（x₃）为考察因素，以复合率为指标进行实验考察。以Design-Expert12.0软件进行响应面设计，因素与水平见表1，实验设计方案和结果见表2。实验组1~12为析因实验，实验组13~17为中心实验，实验重复5次^［13-14］。

2.4.2 响应面优化与预测

选用Design-Expert12.0软件进行三维效应面和二维等高图的绘制，以2个影响显著的因素为自变量，提取率为因变量（另一个自变量设为中心点值），见图1。对上述17组响应曲面实验数据进行分析和处理，获得复合率和各个因素之间的关系，回归方程为：y=-203.84+0.18x₁+11.72x₂+3.08x₃+0.000 56x₁x₂+0.000 42x₁x₃-0.02x₂x₃-0.001 5x₁²-0.13x₂²-0.05x₃²。方差分析结果见表3。由表3可知，反应温度对实验结果的影响显著，模型方程高度显著（P<0.01），模拟预测值与实际值之间具有很高的相关性，模拟失拟度并无明显差异。

通过分析响应曲面，可得最优制备条件，即反应温度为43.31 ℃，反应时间为70.06 min，TSG的质量浓度为20.66 mg·mL^-1，结合实际生产情况，最终确定反应温度为43.5 ℃，反应时间为70 min，TSG质量浓度为20 mg·mL^-1。

2.4.3 最优处方的制备

按照“2.4.2”项下最优的条件制备3批复合物，测得TSC-PC复合率为（97.10%±1.05%）。

2.5 TSG含量测定

2.5.1 色谱条件

Agilent C₁₈柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱；以乙腈-体积分数0.1%磷酸溶液（20∶80）为流动相；流速为1.0 mL·min^-1；进样量为10 μL；检测波长为320 nm；柱温为30 ℃。

2.5.2 对照品溶液的制备

精密称取14.6 mg TSG对照品，用甲醇溶解，经0.45 μm滤膜滤过，即得对照品溶液。

2.5.3 TSG-PC供试品溶液的制备

精密称取14.9 mg TSG-PC样品，用甲醇溶解，经0.45 μm滤膜滤过，即得供试品溶液。

2.5.4 阴性样品溶液的制备

精密称取15.3 mg大豆卵磷脂，用甲醇溶解，经0.45 μm滤膜滤过，即得阴性样品溶液。

2.5.5 专属性实验

精密量取TSG对照品、TSG-PC供试品及阴性样品溶液各10 μL，按照“2.5.1”项下条件进样测定，见图2。结果显示，本方法的专属性良好。

2.5.6 线性关系考察

取“2.5.2”项下对照品溶液适量，用甲醇稀释为质量浓度分别为29.2、58.4、116.8、292.0、584.0 μg·mL^-1的系列溶液，进行HPLC测定。以峰面积为纵坐标（y），TSG质量浓度为横坐标（x）进行线性回归，得回归方程为y=21.64x－144.60，R=0.999 5。稀释对照品溶液，按信噪比为10∶1的进样量得定量限为7.1 μg·mL^-1，信噪比3∶1得检测限为6.8 μg·mL^-1。

2.5.7 精密度实验

取“2.5.2”项下对照品溶液，按照“2.5.1”项下色谱条件进行HPLC测定，连续进样6次。结果显示，RSD为0.74%，表明仪器的精密度良好。

2.5.8 重复性实验

取“2.5.3”项下供试品溶液，按照“2.5.1”项下色谱条件进行HPLC测定，每隔2 h测定1次，共测定6次。结果显示，RSD为2.20%，表明本方法的重复性良好。

2.5.9 稳定性实验

取“2.5.3”项下供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、10 h进样，经HPLC测得峰面积，结果显示，RSD为2.09%，表明供试品溶液在10 h内稳定性良好。

2.5.10 加样回收率实验

精密吸取9份“2.5.3”项下供试品溶液1 mL，分别加入低、中、高3种质量浓度（50.0、100.0、150.0 μg·mL^-1）对照品溶液。结果显示，回收率分别为102.30%、101.71%、99.43%、101.60%、103.01%、102.01%、99.33%、102.70%、100.60%，平均回收率为101.41%，RSD为1.32%，表明本方法的回收率较高。

2.6 TSG的结构表征

2.6.1 X射线衍射分析（x-ray diffraction， XRD）

工作条件：电压为36 kV，电流为20 mA，单色器为Cu-Kα。扫描范围为5º~80°，速度为10°·min^-1。使用X射线衍射仪检测TSG、大豆卵磷脂、物理混合物和TSG-PC的晶体结构并进行表征分析，见图3。二苯乙烯苷的衍射图在5º~30°处显示出衍射峰，表明二苯乙烯苷具有良好的结晶性。物理混合物中的峰形和位置未发生改变，表明简单的物理混合物不影响其结构。与物理混合物相比，复合物中TSG的结晶峰消失，表明TSG的晶体结构发生了显著变化。二苯乙烯苷以无定型状态分散在磷脂中，形成了复合物。

2.6.2 差示扫描量热法分析（differential scanning calorimetry，DSC）

将样品放置于铝锅内，在氮气氛围下，以10 ℃·min^-1的速率，将温度从20 ℃升至350 ℃，使用差示扫描量热仪记录TSG、大豆卵磷脂、物理混合物和TSG-PC的热分析图，见图4。TSG的DSC曲线在70、177、230、297 ℃有吸收峰，表明TSG为结晶状态且TSG晶体在高温下发生形态转变。大豆卵磷脂在267 ℃处出现的吸热峰是由于磷脂从胶态转变为液态所致。物理混合物的DSC图在110、264、277 ℃处的吸热峰相较于TSG向较低温度略有偏移，可能是当温度升高到一定程度时，TSG在较高的温度下和磷脂部分形成复合物。TSG-PC的吸热峰仅为277 ℃，表明TSG均匀地分散在复合物中，可能是由于复合物中存在弱分子力，失去结晶性。

2.6.3 红外吸收光谱分析（infrared spectroscopy，IR）

将TSG、大豆卵磷脂、物理混合物和TSG-PC分别与约200.0 mg的溴化钾混合后压片。压力约为10 000 kg·cm^-2，持续时间为30 s。压得的样品薄片连同模具置于红外分光光度计中扫描，得到红外图谱，见图5。由图5可见，TSG的特征峰在1 637 cm^-1（C=O）；磷脂的特征峰在1 741 cm^-1（C=O）、1 080 cm^-1（P—O—C）；物理混合物的图谱为TSG和磷脂的叠加，表明两者是简单的混合；TSG-PC的特征峰由1 741 cm^-1移至1 637 cm^-1，峰强显著减弱，可能是由于TSG和大豆卵磷脂之间可能存在氢键，形成了PC。

2.6.4 扫描电子显微镜（scanning electron microscope， SEM）观察

将适量样品均匀分布于铝箔表面，室温下自然干燥，使用离子溅射仪对样品进行处理。用SEM观察TSG、大豆卵磷脂、物理混合物和TSG-PC的表面形态，见图6。由图6可见，TSG呈棒状晶体结构，而磷脂呈非晶态；物理混合物中TSG被磷脂均匀地分散和包裹在图中，仍保留晶体结构；复合物光滑的表面并无晶体结构，表明TSG晶体结构已经改变并分散在磷脂中。TSG和磷脂可能在电荷转移、氢键和范德华力作用下形成了复合物。

2.6.5 透射电子显微镜（transmission electron microscope， TEM）观察

将TSG-PC混悬液滴在铜网上，用滤纸吸收多余的水分。风干后使用TEM观察，TSG-PC呈现为均匀的球状，球状颗粒排列整齐、大小一致，形成了一种均匀性较好的结构。这种结构可能是由分子间相互作用或其他物理机制所致，展现了良好的均匀性和稳定性。

2.7 溶解度测定

各取2份10 mL的pH为5.6的蒸馏水与正辛醇，分别加入过量的TSG与TSG-PC，以转速100 r·min^-1在37.0 ℃摇床上振荡24 h。以11 000 r·min^-1离心，取上清。经0.45 μm滤膜滤过，用高效液相色谱仪测得TSG的含量。本研究对TSG及TSG-PC复合物在蒸馏水与正辛醇中的溶解度进行测定（n=3， \overline{x}\pm s），结果显示，TSG在蒸馏水中的溶解度为（41.950±0.004） mg·mL^-1，在正辛醇中的溶解度为（24.280±0.021） mg·mL^-1；而TSG-PC复合物在蒸馏水中的溶解度升至（45.300±0.005） mg·mL^-1，在正辛醇中的溶解度显著增加至（93.930±0.006） mg·mL^-1。TSG和TSG-PC在蒸馏水中的溶解度比较差异无统计学意义，两者在正辛醇中的溶解度有显著差异。与TSG相比，TSG-PC复合物在蒸馏水中的溶解度小幅提升，而在正辛醇中的溶解度增加3.87倍，表明复合物的形成显著改善了二苯乙烯苷的脂溶性。

2.8 TSG-PC经皮渗透性的考察

2.8.1 离体鼠皮的制备

将小鼠断颈处死后，剪去皮肤表面粗毛，用质量浓度为80 g·L^-1的硫化钠溶液脱去细毛，并去除皮下脂肪和结缔组织，将处理好的皮肤置于生理盐水中并于4.0 ℃冷藏，备用。实验前仔细检查鼠皮是否损失，以确保皮肤的完整性。

2.8.2 供试品溶液的制备

精密称取适量的TSG、二苯乙烯苷磷脂物理混合物和TSG-PC，溶解于体积分数50%乙醇中，均制成质量浓度为250.0 mg·mL^－1的供试液，备用。

2.8.3 皮肤渗透实验

取“2.8.1”项下完好的小鼠皮肤，将小鼠皮肤角质层朝上固定于Franz扩散池上，保持真皮层与接收液接触，并确保接收室内无气泡（平衡30 min）。接收池中加入体积分数50%乙醇生理盐水作为接收液，内置一磁石搅拌将接收池置于磁力搅拌器上，搅拌速率为250 r·min^-1，水浴温度为（37±1） ℃，精密移取“2.8.2”项下适量样品溶液滴到皮肤表面，于1、2、3、4、6、8、12、24 h从接收池中吸取5.0 mL，并补充5.0 mL的接收液，以满足漏槽条件。取出的接收液依法测定，用Origin 8.5软件处理数据，计算药物累计透过量（Q_n），绘制经皮渗透曲线图，见图8。结果显示，TSG-PC的经皮透过速率及累计透过量显著提高，表明PC的经皮渗透性能显著提高。

Q_n=\left(V{C}_n+{\displaystyle \sum _{i=\mathrm{1}}^{n-\mathrm{1}}}{V}_i{C}_i\right)/A

其中，C_n 为第n次取样接收液中药物的质量浓度（mg·mL^-1），C_i 为第i次取样时接收液中药物的质量浓度（mg·mL^-1），A为有效扩散面积（3.4 cm²），V为接收池体积（18.5 mL），V_i 为取样体积（5.0 mL），Q_n 为第n次药物累计透过量（mg·cm^-2）。

3 讨论

通过单因素实验结合Box-Behnken响应面法优化TSG-PC的制备工艺，重点考察了反应溶剂、反应温度、反应时间对TSG-PC复合率的影响。无水乙醇作为溶剂在药物复合物制备中具有一定的优势，因为它能够溶解多种有机物和无机物，并且是实验室常用的溶剂，无毒且无腐蚀性，可回收利用。用无水乙醇作为制备溶剂时复合率最高，可能是由于溶剂与磷脂的亲电基团与供电基团之间的电子传递会对复合率产生影响。TSG和PC形成的磷脂复合物反应是吸热反应，温度越高，其反应速率越快，反应平衡常数越大，即理论复合率越高，但由于磷脂高温时容易被氧化，反应温度过高或制备时间过长均会影响磷脂的稳定性，进而影响复合率^［15］，因此在保证复合率的前提下，结合单因素实验结果，将反应温度确定为40.0 ℃。

TSG为水溶性成分，具有高溶解性和低渗透性，药物需要具有一定的平衡溶解度和渗透性才能较好地透过生物膜被吸收^［16-17］。体外透皮实验结果表明，TSG-PC透皮率显著高于TSG及其物理混合物，具有较好的药理作用，与磷脂形成复合物后，其活性成分的药理作用及疗效增强，与皮肤有较好的亲和性，生物利用度提高，为后续的药动学、药效学等研究奠定了基础。本研究的结果显示，PC技术对TSG的溶出性具有一定改善作用，但溶出度提升幅度有限。后续可与其他新技术（固定分散体、微球、微乳等）联合应用，更好地发挥药物疗效。

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基金资助

福建医科大学启航课题(2021QH1256)