明目蒺藜丸质量标准提升的研究

Study on the improvement of quality standard for Mingmu Jili Pills

摘要

目的 完善明目蒺藜丸的质量控制体系，提升其质量标准。 方法 采用薄层色谱法（thin-layer chromatography，TLC），建立川芎、当归、白芷、黄芩、黄柏、黄连、赤芍、栀子8味药材的定性鉴别方法。采用高效液相色谱法（high-performance liquid chromatography，HPLC），建立制剂中栀子苷、芍药苷的同步含量测定方法。 结果 8味药材的TLC色谱图斑点清晰、分离度良好，阴性样品无干扰；栀子苷在4.93~98.69 μg·mL^-1、芍药苷在3.39~67.88 μg·mL^-1范围内线性关系良好（r均=0.999 9）；栀子苷的平均加样回收率为99.98%，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为0.86%（n=9）；芍药苷的平均加样回收率为102.22%，RSD为0.76%（n=9）；3批市售样品中栀子苷的含量为1.02~1.23 mg·g^-1，芍药苷含量为0.61~0.71 mg·g^-1。 结论 建立的TLC定性鉴别与HPLC定量测定方法专属性强、准确性高、重复性好，可全面提升明目蒺藜丸的质量控制水平，为其质量标准提升提供科学依据。

Abstract

Objective To improve the quality control system and upgrade the quality standard of Mingmu Jili Pills. Methods A thin-layer chromatography （TLC） method was established for the qualitative identification of 8 medicinal materials including Chuanxiong Rhizoma， Angelicae Sinensis Radix， Angelicae Dahuricae Radix， Scutellariae Radix， Phellodendri Chinensis Cortex， Coptidis Rhizoma， Paeoniae Radix Rubra and Gardeniae Fructus. High-performance liquid chromatography （HPLC） was established for simultaneous quantitative determination of geniposide and paeoniflorin in the preparation. Results The TLC chromatograms of the 8 medicinal materials showed clear spots with good resolution， and no interference was observed in negative samples. Geniposide presented a good linear relationship in the range of 4.93-98.69 μg·mL^-1 and paeoniflorin in 3.39-67.88 μg·mL^-1 （both r=0.999 9）. The average sample recovery rate of geniposide was 99.98% with relative standard deviation （RSD） of 0.86% （n=9）， and that of paeoniflorin was 102.22% with RSD of 0.76% （n=9）. The contents of geniposide and paeoniflorin in 3 batches of commercial samples were 1.02-1.23 mg·g^-1 and 0.61-0.71 mg·g^-1， respectively. Conclusion The established TLC qualitative identification and HPLC quantitative determination methods are specific， accurate， and reproducible，which can comprehensively improve the quality control level of Mingmu Jili Pills and provide scientific basis for the upgrading of its quality standard.

Graphical abstract

关键词

明目蒺藜丸 / 薄层色谱（TLC） / 高效液相色谱（HPLC） / 定性鉴别 / 含量测定 / 质量标准

Key words

Mingmu Jili Pills / thin-layer chromatography （TLC） / high-performance liquid chromatography （HPLC） / qualitative identification / content determination / quality standard

明目蒺藜丸由黄连、川芎、白芷等23味中药材组成，具有清热散风、明目退翳的功效，临床主要用于治疗上焦火盛引起的暴发火眼、云蒙障翳、羞明多眵、眼边赤烂、迎风流泪等症^［1］，现广泛用于干眼症、流行性结膜炎、病毒性结膜炎等眼科疾病的临床治疗^［2-4］。明目蒺藜丸现行质量标准为国家药品标准WS3-B-1155-92-1和《卫生部药品标准》中药成方制剂第六册，质量控制方法仅包含部分药味的显微鉴别、黄芩和决明子的薄层鉴别及欧前胡素的单成分含量测定，存在鉴别药味少、质量控制指标单一等问题，难以全面控制该复方制剂的质量。

为弥补现行标准的不足，有效控制该制剂的质量，本研究采用中药质量控制中常用的“一板多测”薄层色谱（thin-layer chromatography，TLC）技术^［5-14］，新增黄柏、黄连、赤芍、栀子、白芷、川芎、当归7味药材的TLC鉴别方法，并改进黄芩的TLC鉴别方法；同时建立高效液相色谱法（high-performance liquid chromatography，HPLC）同步测定制剂中栀子苷、芍药苷的含量，实现对明目蒺藜丸多药味定性、多成分定量的综合质量控制，以期为该制剂的质量标准提升提供实验依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

TLC SCANNER4型半自动点样仪、TLC VISUALIZER型薄层成像系统、TLC plateheater Ⅲ型薄层板加热器，均购自瑞士CAMAG公司；CPA225D型电子天平（德国赛多利斯公司）；Elmasonic P型超声波清洗仪（德国Elma公司）；DK-98-Ⅱ型恒温水浴锅（天津泰斯特仪器有限公司）；e2695型高效液相色谱仪（美国Waters公司）。

1.2 试药

芍药苷对照品（批号110736-202246，质量分数为96.7%）、盐酸小檗碱对照品（批号110731-202015，质量分数为85.9%）、黄芩苷对照品（批号110715-202223，质量分数为97.2%）、异欧前胡素对照品（批号110827-202113，质量分数为99.2%）、栀子苷对照品（批号110749-202320，质量分数为98.1%）、川芎对照药材（批号120918-201813）、当归对照药材（批号120927-202118），均购自中国食品药品检定研究院。乙腈（色谱纯，德国Merck KGaA公司）；磷酸（色谱纯，美国Fisher公司）；超纯水（实验室自制）；乙醚、乙酸乙酯、环己烷、甲醇、丁酮、正丁醇、乙醇、三氯甲烷、丙酮、盐酸、甲酸、冰醋酸、三氯化铁，均为分析纯，均购自天津市科密欧化学试剂有限公司；香草醛（分析纯，上海源叶生物科技有限公司）。

明目蒺藜丸样品（批号22081204、23081306，均为北京同仁堂制药有限公司；批号220527，保定中药制药股份有限公司）。明目蒺藜丸处方中23味组方饮片，购自线上及线下正规药店，经河北省药品医疗器械检验研究院段吉平主任药师鉴定，来源均符合《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）（2020年版）规定。

2 方法与结果

2.1 TLC鉴别

2.1.1 当归、川芎、白芷的同步鉴别

取明目蒺藜丸粉末10 g，加乙醚20 mL，超声提取（功率250 W，频率50 kHz）20 min，滤过，滤渣备用，滤液挥干，残渣加乙酸乙酯1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取当归、川芎对照药材各0.5 g，同法制成对照药材溶液；取异欧前胡素对照品，加甲醇制成1 mg·mL^-1的对照品溶液；按照处方工艺分别制备缺当归、川芎、白芷的阴性样品，同法制备阴性样品溶液^［15-16］。按照《中国药典》（2020年版）四部通则0502薄层色谱法，分别吸取上述对照药材溶液、对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液各5 μL，点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯（4∶1）为展开剂，展开、取出、晾干，置于紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与当归、川芎对照药材和异欧前胡素对照品色谱相应的位置，显相同颜色的荧光斑点；阴性样品色谱在相应位置无斑点，无干扰。见图1。

2.1.2 黄芩的鉴别

取2.1.1项下备用滤渣，挥干残留乙醚，加乙醇40 mL，加热回流1 h，滤过，滤液蒸干，残渣加0.5 mol·L^-1盐酸溶液20 mL使溶解，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次20 mL，水相溶液备用，合并乙酸乙酯提取液，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取黄芩苷对照品，加甲醇制成1 mg·mL^-1的对照品溶液。按照处方工艺制备缺黄芩的阴性样品，同法制备阴性样品溶液^［15］。按照《中国药典》（2020年版）四部通则0502薄层色谱法，分别吸取上述3种溶液各10 μL，点于同一质量分数4%乙酸钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（5∶3∶1∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以质量分数2%三氯化铁乙醇溶液。供试品色谱中，在与黄芩苷对照品色谱相应位置上显相同颜色的棕褐色斑点。阴性样品无干扰。见图2。

2.1.3 黄连、黄柏的同步鉴别

取2.1.2项下备用水相溶液，用氨试液调节pH至12，再用三氯甲烷振摇提取2次，每次20 mL，合并三氯甲烷液，蒸干，残渣加甲醇l mL使溶解，作为供试品溶液。另取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成质量浓度为0.5 mg·mL^-1的对照品溶液^［15］。按照处方工艺分别制备缺黄连、黄柏的阴性样品，同法制备阴性样品溶液。按照《中国药典》（2020年版）四部通则0502薄层色谱法，分别吸取上述3种溶液各5 μL，点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-水（7∶2∶4）为展开剂，展开，取出，晾干，置于紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与盐酸小檗碱对照品色谱相应位置上显相同颜色的荧光斑点；阴性样品无干扰。见图3。

2.1.4 赤芍、栀子的同步鉴别

取明目蒺藜丸粉末10 g，加甲醇40 mL，超声提取（功率250 W，频率50 kHz）30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水10 mL使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次20 mL，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇20 mL使溶解，上样至中性氧化铝柱（100~200目，5 g，柱内径为1.5 cm ），收集洗脱液，浓缩至约2 mL，作为供试品溶液。另取栀子苷、芍药苷对照品，加甲醇制成质量浓度为1 mg·mL^-1的混合对照品溶液^{［15，17］}。按处方工艺分别制备缺赤芍、栀子的阴性样品，同法制备阴性样品溶液。按照《中国药典》（2020年版）四部通则0502薄层色谱法，分别吸取上述混合对照品溶液5 μL，供试品溶液15 μL、阴性样品溶液15 μL，点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丙酮-水（5∶5∶0.6）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以体积分数5%香草醛硫酸乙醇溶液，105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与栀子苷、芍药苷对照品色谱相应的位置上，分别显相同颜色的斑点。阴性样品无干扰。见图4。

2.2 HPLC同时测定栀子苷、芍药苷的含量

2.2.1 色谱条件

采用Kromasil 100-5-C₁₈色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈-体积分数0.1%磷酸溶液（11∶89）；流速为1 mL·min^-1；柱温为30 ℃；检测波长为230 nm；进样量为10 μL。

2.2.2 溶液的制备

2.2.2.1 混合对照品溶液

取栀子苷、芍药苷对照品适量，精密称定，置于棕色量瓶中，加体积分数为50%的甲醇溶解并定容至刻度，制得含栀子苷98.69 μg·mL^-1、芍药苷67.88 μg·mL^-1的混合对照品储备液；精密量取混合对照品储备液适量，加体积分数为50%的甲醇稀释5倍，摇匀，制成混合对照品溶液。

2.2.2.2 供试品溶液

取明目蒺藜丸粉末约1.0 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入体积分数为50%的甲醇50 mL，密塞，称定质量，超声提取（功率250 W，频率50 kHz）30 min，放冷至室温，用体积分数为50%的甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.2.3 阴性样品溶液

按照处方工艺制备缺赤芍、栀子的阴性样品，同法制备阴性样品溶液。

2.2.3 方法学考察

2.2.3.1 专属性考察

取2.2.2项下混合对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液，按照3.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果显示，栀子苷、芍药苷色谱峰峰形对称，分离度良好；阴性样品溶液在栀子苷、芍药苷峰相应保留时间无色谱峰，表明方法专属性良好。见图5。

2.2.3.2 线性关系考察

精密量取混合对照品储备液，加体积分数为50%的甲醇梯度稀释，制得含栀子苷4.93、9.87、19.74、49.34、98.69 μg·mL^-1，芍药苷3.39、6.79、13.58、33.94、67.88 μg·mL^-1的系列混合对照品溶液，分别进样测定，以峰面积为纵坐标（y），对照品质量浓度（μg·mL^-1）为横坐标（x），进行线性回归。结果显示，两个成分在各自质量浓度范围内线性关系良好（r均=0.999 9）。见表1。

2.2.3.3 精密度实验

取同一供试品溶液（批号22081204），按照2.2.1项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积，计算得栀子苷、芍药苷峰面积的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）分别为0.27%、0.44%，表明仪器的精密度良好。

2.2.3.4 重复性实验

取同一批次明目蒺藜丸（批号22081204），按照2.2.2.2项下供试品溶液制备方法平行制备6份，按照2.2.1项下色谱条件进样测定，计算栀子苷、芍药苷的含量，得RSD分别为0.88%、0.98%，表明方法的重复性良好。

2.2.3.5 稳定性实验

取同一供试品溶液（批号22081204），按照2.2.1项下色谱条件，分别于0、4、8、12、24 h进样测定，记录峰面积，计算得栀子苷、芍药苷峰面积的RSD分别为0.81%、0.80%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.2.3.6 加样回收率实验

取已知含量的明目蒺藜丸粉末（批号22081204）约0.5 g，精密称定，共9份，分为3组，每组3份，分别按50%、100%、150%水平精密加入栀子苷、芍药苷对照品，按照3.2.2项下供试品溶液制备方法制备溶液，按照2.2.1项下色谱条件进样测定，计算加样回收率。结果显示，栀子苷、芍药苷的平均回收率分别为99.98%、102.22%，RSD分别为0.86%、0.76%，表明方法的准确度良好。见表2。

2.2.4 样品含量的测定

取3批明目蒺藜丸样品，按照2.2.2.2项下制备方法制备供试品溶液，按照2.2.1项下色谱条件进样测定，计算栀子苷、芍药苷的含量。结果显示，3批样品中栀子苷含量为1.02~1.23 mg·g^-1，芍药苷含量为0.61~0.71 mg·g^-1，不同厂家样品间成分含量存在一定差异。

3 讨论

3.1 TLC鉴别方法的优化

TLC是中药分析领域经典且应用广泛的分析方法。随着薄层板制备、点样技术、展开技术的不断发展，以及TLC操作的规范化与仪器化程度的逐步提升，其在中药质量分析中的应用价值愈发突出。该技术具有分离速度快、分离效率高、适用性广、操作简便、仪器设备简单、显色便捷等优势，可实现药品真伪经济、快速的鉴别。本研究优化了黄芩的薄层鉴别条件，减少了取样量，并通过前处理流程的优化，有效解决了供试品溶液黏度较大、点样操作困难的技术难题。同时，新增了黄柏、黄连、赤芍、栀子、白芷、川芎、当归的TLC鉴别项，采用“一板多测”模式，显著减少了样品与试剂的用量，同时缩短了检验周期。

本研究参照《中国药典》（2020年版）一部相关方法，分别以薄荷脑为对照品、荆芥为对照药材，对样品中薄荷、荆芥的鉴别方法进行了多组实验探索，结果显示，阴性对照均有干扰；分别以5-O-甲基维斯阿米醇苷、连翘苷为对照品，以菊花为对照药材，对样品中防风、连翘、菊花的鉴别方法开展预实验，结果显示，样品与对照品（或对照药材）之间均无对应的特征斑点。

3.2 HPLC含量测定条件的优化

本研究系统考察了不同提取溶剂（体积分数30%、50%、70%甲醇和甲醇）、溶剂体积（25、50、100 mL）、提取方式（超声提取、加热回流提取）及提取时间（15、30、45 min）对明目蒺藜丸中栀子苷、芍药苷含量的影响。结果显示，体积分数50%和70%甲醇的提取效率无显著差异，超声提取与加热回流提取效率相当；当溶剂体积为50 mL、提取时间为30 min时，目标成分可提取完全。因此，最终确定供试品溶液的制备条件为体积分数为50%的甲醇50 mL，超声提取30 min。

流动相体系参考《中国药典》（2020年版）一部中“栀子”“白芍”含量测定项下的流动相配方，经优化流动相配比，最终确定乙腈-体积分数0.1%磷酸溶液（11∶89）作为流动相，该条件下栀子苷和芍药苷的色谱峰分离度良好。经紫外光谱扫描验证，栀子苷在238.9 nm波长处、芍药苷在231.8 nm波长处均有最大吸收峰，结合《中国药典》（2020年版）一部中“栀子”“白芍”含量测定项下规定的检测波长，最终确定检测波长为230 nm。

色谱柱筛选过程中，比较了Kromasil 100-5-C₁₈（250 mm×4.6 mm，5 μm）、CAPCELL PAK MG C₁₈（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Inertsil ODS-3（250 mm×4.6 mm，5 μm）3款色谱柱，结果表明，3款色谱柱的分离度均>1.5，均满足该含量测定方法的要求；其中，Kromasil 100-5-C₁₈（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱的理论塔板数更高，且芍药苷色谱峰的峰形更对称，故本实验选用该款色谱柱作为分析用色谱柱。柱温考察了25、30、35 ℃ 3个温度水平，结果表明柱温对分析结果无显著影响。

本研究建立的TLC鉴别方法简便、快速、准确、可靠，可实现对制剂中川芎、当归、白芷、黄连、黄柏、赤芍、栀子、黄芩的快速定性鉴别；建立的HPLC含量测定方法准确、可靠，可实现对制剂中栀子苷和芍药苷的精准定量分析。该方法可实现对制剂中多种药材的同步质量控制，可为明目蒺藜丸质量标准的修订与提升提供科学依据。

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基金资助

石家庄市科学技术研究与发展计划项目(2412004703)