基于高效液相色谱指纹图谱结合化学计量学的青海枸杞芽茶质量控制的研究

Quality control of Lycium barbarum Bud Tea from Qinghai based on high-performance liquid chromatography fingerprints combined with chemometrics

摘要

目的 建立青海枸杞芽茶高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）指纹图谱，分析青海省不同产地枸杞芽茶的化学质量特征，为其质量控制与产地溯源提供科学依据。 方法 以体积分数0.1%甲酸水溶液-甲醇为流动相，采用梯度洗脱法建立30批次青海省不同产地枸杞芽茶的HPLC指纹图谱；采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）进行相似度分析；结合SPSS 19.0和SIMCA 14.1软件，采用层次聚类分析（hierarchical cluster analysis，HCA）、主成分分析（principal component analysis，PCA）和偏最小二乘判别分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）对不同产地的枸杞芽茶进行化学模式识别及差异性分析。 结果 建立的枸杞芽茶HPLC指纹图谱共标定出13个共有峰，并指认出绿原酸（峰10）、芦丁（峰11）2个特征成分；30批次样品的相似度为0.996~0.999；HCA、PCA、PLS-DA分析结果显示，青海省不同产地枸杞芽茶的化学组成整体均一，无显著地域差异性。 结论 建立的HPLC指纹图谱可全面表征青海枸杞芽茶的化学质量特征，方法简便、重复性好；结合化学计量学的分析结果，为青海枸杞芽茶的质量控制、品质评价及产地溯源提供了科学依据。

Abstract

Objective To establish high-performance liquid chromatography （HPLC） fingerprint for Lycium barbarum Bud Tea from Qinghai Province and to analyze the chemical quality characteristics of samples from different producing areas， thereby providing a scientific basis for quality control and geographical traceability. Methods HPLC fingerprint was established for 30 batches of Lycium barbarum Bud Tea from various regions in Qinghai， using a mobile phase of 0.1% aqueous formic acid solution-methanol with gradient elution. The Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of Traditional Chinese Medicine （2012 Edition） was employed for similarity analysis. Hierarchical cluster analysis （HCA）， principal component analysis （PCA）， and partial least squares discriminant analysis （PLS-DA） were performed by SPSS 19.0 and SIMCA 14.1 software to conduct chemometric pattern recognition and differential analysis on samples from different origins. Results The established HPLC fingerprint marked a total of 13 common peaks and identified 2 characteristic components： chlorogenic acid （peak 10） and rutin （peak 11）. The similarity of the 30 batches ranged from 0.996 to 0.999. The results of HCA， PCA， and PLS-DA indicated that the chemical compositions of Lycium barbarum Bud Tea from different areas in Qinghai Province were homogeneous overall， with no significant regional differences. Conclusion The established HPLC fingerprint can comprehensively characterize the chemical quality of Qinghai Lycium barbarum Bud Tea and is a simple method with good reproducibility. The analytical results， combined with chemometrics， provide a scientific basis for quality control， quality evaluation， and geographical traceability of Qinghai Lycium barbarum Bud Tea.

Graphical abstract

关键词

枸杞芽茶 / 高效液相色谱（HPLC） / 指纹图谱 / 相似度 / 化学计量学 / 产地溯源

Key words

Lycium barbarum Bud Tea / high-performance liquid chromatography （HPLC） / fingerprint / similarity / chemometrics / geographical traceability

枸杞为我国传统名贵中药材，具有补肾生精、养肝明目、坚筋骨、祛疲劳、泽颜色、安神益智、延年益寿的功效，同时也是青海省特色药食同源产品。现代研究表明，除枸杞果实外，其芽叶部位也具有一定的药用价值。《本草纲目》中将枸杞芽称为天精草，记载其味苦甘、性凉，入心肺脾肾四经，具有明目、安神、补钙、降血糖等功效。枸杞芽茶是以枸杞枝顶端的嫩芽、嫩叶为原料制成的茶饮，其富含氨基酸、多酚、黄酮类成分，及钙、铁、锌、硒、维生素B₁、维生素B₂、维生素C等人体必需的微量元素^［1-4］，是兼具营养和保健价值的特色茶饮。

目前关于枸杞的研究主要集中在果实部位，对枸杞叶、枸杞芽的研究相对较少。现有枸杞芽茶的相关研究多为总黄酮、氨基酸、多酚等大类成分的含量测定^［5-7］，缺乏能整体表征其化学特征的质量控制手段。指纹图谱是表征样品化学组成整体性的有效方法，能全面反映样品中的化学成分种类和相对含量，是全面、整体控制中药材及药食同源产品质量的核心手段之一^［8-10］。目前尚未见基于高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）指纹图谱对枸杞芽茶质量控制的相关报道，因此，本研究以青海省5个产地的30批枸杞芽茶为研究对象，建立其HPLC^［11-13］指纹图谱，并结合化学计量学^［14-17］方法进行数据分析，以期为枸杞芽茶的质量控制、真伪鉴定及产地溯源提供科学参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

e2695型液相色谱仪（配2998型二极管阵列检测器，美国Waters公司）；5810R型高速离心机（德国Eppendorf公司）；TU-1901型双光束紫外-可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；ME204/02型电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；Milli-Q型超纯水纯化系统（德国默克集团）；KQ-500DA型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药

对照品：绿原酸（批号1503017，质量分数≥98%）；芦丁（批号19120105，质量分数≥98%），均购自成都康邦生物科技有限公司；乙腈（色谱纯）、甲醇（色谱纯）、乙醇（色谱纯）、甲酸（分析纯），均购自德国默克公司；超纯水（Milli-Q超纯水纯化系统制得）。

枸杞主产于我国西北地区，青海省因日照时间长、昼夜温差大，是枸杞的优质产地，枸杞芽茶也是当地特色产业。本研究收集青海省诺木洪、都兰县、格尔木市、海东市、海南州5个产地的30批次枸杞芽茶产品作为研究对象，编号为S1~S30。样品来源信息见表1。

2 方法

2.1 色谱条件

采用WAT097958 Waters Symmetry型C₁₈反相色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇（A）-体积分数0.1%甲酸水溶液（B），检测波长为270 nm；柱温为30 ℃；流速为0.7 mL·min^-1；进样量为10 μL，梯度洗脱程序见表2。

2.2 供试品溶液的制备

精密称取枸杞芽茶样品1.0 g，置于50 mL离心管中，加入体积分数为80%的甲醇10 mL，摇匀，超声提取25 min，以8 000 r·min^-1离心5 min，取上清液，置于另外一支离心管中；残渣中再加入体积分数为80%的甲醇10 mL，重复上述提取操作，合并两次上清液，置于25 mL量瓶中，定容至刻度，摇匀，经0.45 µm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。

2.3 混合对照品溶液的制备

精密称取芦丁和绿原酸对照品各10.0 mg，分别置于10 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得1 mg·mL^-1的对照品储备液。精密吸取上述对照品储备液各0.1 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，制得芦丁、绿原酸质量浓度均为10 μg·mL^-1的混合对照品溶液。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度考察

取样品（S7）适量，精密称定，按照2.2项下方法制备供试品溶液，按照2.1项下色谱条件连续进样6次，以芦丁为参照峰，计算共有峰的相对保留时间和相对峰面积的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。

2.4.2 稳定性考察

取样品（S7）适量，精密称定，按照2.2项下方法制备供试品溶液，按照2.1项下色谱条件，分别于0、2、4、6、8、10、12、24 h进样检测，以芦丁为参照峰，计算共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD。

2.4.3 重复性考察

取样品（S7）6份，各0.1 g，按照2.2项下方法制备供试品溶液，按照2.1项下色谱条件进样检测，以芦丁为参照峰，计算共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD。

2.5 枸杞芽茶指纹图谱的建立

取30批次枸杞芽茶样品适量，按照2.2项下方法制备供试品溶液，按照2.1项下色谱条件进样检测，记录色谱图。将30批次枸杞芽茶的HPLC图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版），以S1批次样品为参照图谱，时间窗宽度设为0.2 min，采用中位数法生成枸杞芽茶的共有模式指纹图谱，并计算各批次样品与共有模式的相似度。

2.6 化学计量学数据的分析

以30批枸杞芽茶样品的共有峰峰面积为原始数据，采用SPSS 19.0软件进行层次聚类分析（hierarchical cluster analysis，HCA），采用组间联接法，以欧氏距离为度量标准；利用SIMCA 14.1软件进行主成分分析（principal component analysis，PCA）和偏最小二乘判别分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）。进行无监督和有监督模式识别，分析不同产地枸杞芽茶的化学特征差异^［18-20］。

3 结果

3.1 指纹图谱方法学考察

以芦丁（11号峰）为参照峰，计算13个共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD，结果见表3。由表3可知，精密度、重复性、稳定性考察中，各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均<3%，表明仪器的精密度良好、重复性好，供试品溶液在24 h内稳定性良好，符合HPLC指纹图谱的分析要求。

3.2 指纹图谱的建立与相似度分析

青海省不同产地枸杞芽茶的HPLC指纹图谱色谱峰数量基本一致，但部分色谱峰面积存在一定差异，表明不同产地样品化学成分种类基本相同，仅部分成分含量存在细微差异。通过相似度评价系统对30批次样品色谱图进行分析，共标定出13个共有峰，并结合混合对照品溶液的色谱保留时间，指认出其中绿原酸（10号峰）、芦丁（11号峰）2个特征成分。见图1、图2。

30批次枸杞芽茶样品与共有模式指纹图谱的相似度计算结果见表4，相似度为0.996~0.999，均接近1.000，表明青海省不同产地枸杞芽茶的化学组成整体均一，品质无显著差异。

3.3 化学模式识别分析

3.3.1 HCA分析

为进一步分析枸杞芽茶的化学特征差异，以13个共有峰峰面积为原始数据进行HCA分析，结果见图3。当欧氏距离为20时，30批次样本可聚为4类：S1、S2、S4~S8、S10~S14、S16~S30为一类（占绝大多数）；S3、S15、S24样品分别单独聚为一类。聚类结果显示，绝大多数不同产地的样品聚为一类，仅个别样品因部分成分含量差异单独聚为一类，表明青海省不同产地枸杞芽茶无明显的地域聚类特征，化学组成整体均一。

3.3.2 PCA分析

以13个共有峰峰面积为原始数据进行PCA分析，以特征值>1为标准，共提取出3个主成分，其累计方差贡献率为76.103%，可反映枸杞芽茶指纹图谱的大部分化学信息，能够基本表征该药材的整体化学特征。PCA得分图显示，30 批次样品的分布无明显的地域分组特征，个别样品（S3、S15、S24）略微偏离主体分布，与聚类分析结果基本一致，进一步证实青海省不同产地枸杞芽茶的化学组成无显著地域差异性，个别样品的差异可能与采收期、加工工艺、栽培管理等因素有关。见表5、图4。

3.3.3 PLS-DA分析

PLS-DA分析结果与HCA、PCA分析结果一致，30批次青海省不同产地的枸杞芽茶样品在得分图中无明显的地域分离趋势，表明其化学特征无显著的产地特异性。结合相似度分析结果可知，青海省独特的地理气候条件使当地枸杞芽茶的化学组成保持了较高的均一性，产地并非影响其品质的关键因素。

4 讨论

本研究通过优化提取溶剂和色谱条件，最终建立了青海枸杞芽茶的HPLC指纹图谱分析方法：以体积分数为80%的甲醇为提取溶剂，超声提取25 min，提取效率高、操作简便；以体积分数0.1%甲酸水溶液-甲醇为流动相进行梯度洗脱，可有效改善色谱峰的分离效果，避免了采用无酸水相导致的色谱峰数量减少、分离度下降的问题，所得指纹图谱基线平稳、主要色谱峰分离度良好、峰形对称，能全面表征枸杞芽茶的化学组成特征。

方法学考察结果表明，该方法的精密度、重复性及供试品溶液的稳定性均符合指纹图谱分析要求，为枸杞芽茶的质量控制提供了可靠的分析方法。通过相似度评价系统分析，30批次青海省不同产地枸杞芽茶的指纹图谱共标定13个共有峰，指认出绿原酸、芦丁2个特征成分，各批次样品的相似度达0.996~0.999，表明其化学成分种类基本一致，整体品质均一。

化学计量学分析进一步证实，青海省诺木洪、都兰县、格尔木市、海东市、海南州5个产地的枸杞芽茶无显著的地域化学特征差异，仅个别样品因部分成分含量细微差异单独聚类，推测该差异可能与枸杞的采收年限、栽培管理方式、芽茶加工工艺等因素有关，而非产地地域因素。这一结果与青海省独特的地理气候条件相关，该地区光照充足、昼夜温差大、土壤矿物质含量丰富，为枸杞芽茶的品质均一性提供了自然基础。

本研究建立的HPLC指纹图谱结合化学计量学的分析方法，实现了对枸杞芽茶化学组成的整体性评价，弥补了传统单一成分含量测定的局限性，为枸杞芽茶的质量控制、品质评价及原料筛选提供了科学依据。同时，研究结果表明青海省不同产地枸杞芽茶的品质均一，为其产业标准化、规模化发展提供了理论支撑。

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