基于液相色谱-串联质谱法的血清卡马西平浓度检测方法的建立与验证

Establishment and validation of a liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for serum carbamazepine concentration detection

摘要

目的 建立能快速检测血清中卡马西平浓度的液相色谱-串联质谱法，为临床卡马西平治疗药物的监测提供技术支撑。 方法 采用有机试剂蛋白沉淀法处理血清样本，制备提取液；以卡马西平-d₁₀为内标，C₁₈色谱柱（50 mm×3 mm，5 μm）为分离柱，水-甲醇为流动相进行梯度洗脱，实现目标成分与杂质的有效分离；采用电喷雾离子源（electrospray ionization，ESI）正离子模式，多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）模式扫描定量分析。 结果 该方法检出限为0.1 μg·mL^-1，定量限为1.25 μg·mL^-1；在1.25~40.00 μg·mL^-1质量浓度范围内线性关系良好（r>0.990 0）；加标回收率为91.8%~106.5%，日内和日间精密度均<10%；基质因子为91.8%~104.6%，无明显基质效应；无明显携带污染现象；临床样本检测相对偏差为-5.09%~8.05%。 结论 该方法操作简便、分析性能稳定、灵敏度高、成本低廉，适用于大批量血清样本中卡马西平浓度的快速检测，可为临床卡马西平治疗药物浓度监测提供依据。

Abstract

Objective To establish a rapid analytical method for the determination of carbamazepine concentration in serum using liquid chromatography-tandem mass spectrometry， providing technical support for clinical carbamazepine therapeutic drug monitoring. Methods The serum samples were treated by the organic reagent protein precipitation method to prepare the extraction solution. Carbamazepine-d₁₀ was used as the internal standard， and a C₁₈ chromatographic column （50 mm×3 mm， 5 μm） was employed as the separation column. Gradient elution was performed by using water-methanol as the mobile phase to achieve effective separation of target components from impurities. The electrospray ionization （ESI） positive ion mode was adopted， and multiple reaction monitoring （MRM） mode scanning was used for quantitative analysis. Results The detection limit of this method was 0.1 μg·mL^-1， and the quantification limit was 1.25 μg·mL^-1. The linear relationship was good within the concentration range of 1.25-40.00 μg·mL^-1 （r>0.990 0）. The recovery rate was 91.8%-106.5%， and both intra-day and inter-day precisions were <10%. The matrix factor was 91.8%-104.6%， with no significant matrix effect observed. There was no evident carryover contamination. The relative deviation for clinical sample detection was -5.09%-8.05%. Conclusion This method is simple to operate， with stable analytical performance， high sensitivity， and low cost. It is suitable for rapid detection of carbamazepine concentration in large quantities of serum samples， providing a basis for clinical monitoring of carbamazepine therapeutic drug concentration.

Graphical abstract

关键词

液相色谱-串联质谱法 / 卡马西平 / 血清 / 治疗药物监测 / 浓度检测

Key words

liquid chromatography-tandem mass spectrometry / carbamazepine / serum / therapeutic drug monitoring / concentration detection

卡马西平（carbamazepine，CBZ）是临床治疗癫痫的一线药物，同时亦可用作情感稳定剂，广泛用于癫痫发作、躁狂症等疾病的治疗。其口服后吸收缓慢且不规则，有效治疗浓度窗较窄，且个体间吸收、代谢存在显著差异，临床疗效与毒性、不良反应均与血药浓度密切相关，单纯依靠临床症状观察难以精准评估疗效及预判不良反应。研究发现，开展卡马西平治疗药物监测（therapeutic drug monitoring，TDM）可显著提升治疗有效性，为制订个性化给药方案提供依据，进而降低肾毒性风险，减少神经系统、心血管系统不良反应发生率，具有重要的临床应用价值与疗效判定意义^［1-5］。

目前临床检测卡马西平浓度多采用免疫法，但该方法易受代谢产物、结构类似物干扰，定量准确性欠佳^［6］。虽有研究建立了液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）检测方法，但多采用固相萃取、超声辅助离子液体-分散液液微萃取等前处理技术，操作繁琐、检测成本较高，不利于临床推广和应用^［7-8］。本研究结合国内外相关文献^［9-12］，依托自主研发的卡马西平检测试剂盒，建立了基于LC-MS/MS法的血清中卡马西平浓度的检测方法，并完成系统的方法学验证^［13］。该方法前处理简便，快速（仅需8~10 min），无需固相萃取等繁琐步骤，且样本需求量少（50 μL血清即可实现精准定量），适用于大批量样本检测，为该方法的临床普及奠定了基础。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

AB SCIEX Triple Quad^TM 4500MD型液相色谱串联质谱检测系统（美国AB SCIEX公司）；QL-866型涡旋振荡仪（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；SORVALL Legend Micro17型医用离心机（美国赛默飞公司）。

1.2 试药

胆固醇对照品（批号111618-202103，质量分数为99.90%）、胆红素对照品（批号100077-202009，质量分数为98.80%），均购自中国食品药品检定研究院；血红蛋白（批号C14640172，上海麦克林生化科技股份有限公司）；卡马西平检测试剂盒（批号SH22102601，青岛惠安康生物工程有限公司）；丙戊酸和卡马西平检测试剂盒（批号2023030901，江西美康盛德生物科技有限公司）；甲醇（色谱纯，批号F23N59204，美国赛默飞公司）；卡马西平标准物质（批号100142-201706，化学对照品，中国食品药品检定研究院）；蒸馏水（广州屈臣氏食品饮料有限公司）。

2 方法

2.1 校准曲线和质控品的配制

按照试剂盒说明书，配制校准曲线各梯度溶液及低值、高值质控品，涡旋充分混匀后备用。

2.2 含标志物释放液的配制

取内标液按1∶100的比例加入释放液中，充分混匀，备用。

2.3 样本前处理

取50 µL血清样本、校准曲线各梯度质量浓度溶液及高、低值质控品，分别置于2 mL离心管中，各加入300 µL含标志物释放液，涡旋混匀后，在4 ℃条件下以10 000 r·min^-1离心5 min，取上清液，用蒸馏水稀释20倍，供LC-MS/MS分析。

2.4 色谱条件

采用HAK C₁₈色谱柱（3 mm×50 mm，5 μm）；以含体积分数0.2%甲酸的水溶液（A）-含体积分数0.2%甲酸的甲醇溶液（B）为流动相，梯度洗脱；流速为0.6 mL·min^-1；柱温为45 ℃；梯度洗脱程序见表1。

2.5 质谱条件

采用电喷雾离子源（electrospray ionization，ESI），正离子扫描模式，多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）模式定量分析。CZB及内标CZB-d₁₀的质谱检测参数见表2。

2.6 分析性能的验证

2.6.1 基质效应

使用空白基质制备3个质量浓度（3.78、10.00、13.70 μg·mL^-1）的加标基质样本，每个质量浓度的样本分为5份，每份样本重复测定3次；使用溶剂甲醇配制3个同样质量浓度的加标溶剂样本，将加标基质样本与相同质量浓度的加标溶剂样本一同进样分析，比较响应值。

采用基质因子评价基质效应，按下述公式计算基质因子。基质因子（%）=［（基质样本响应值－溶剂样本响应值）/溶剂样本响应值］×100%。验证要求基质因子范围为85.0%~115.0%，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）≤15.0%^［13］。

2.6.2 检出限、定量限与线性范围

以信噪比（signal-to-noise ratio，S/N）≥3且满足检测需求的最低质量浓度为检出限（limit of detection，LOD）。制备3个质量浓度水平的卡马西平低值样本，每个质量浓度重复测定5次，以RSD≤20.0%且相对偏差在±15.0%范围内的最低质量浓度为定量限（limit of quantification，LOQ）。参考《中国精神科治疗药物监测临床应用专家共识（2022年版）》^［14］和《神经精神药理学治疗药物监测共识指南：2017版》^［15］，设定校准曲线质量浓度梯度为1.25、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00 μg·mL^-1，该范围覆盖卡马西平情感稳定剂（4.0~10.0 μg·mL^-1）与抗癫痫（4.0~12.0 μg·mL^-1）的临床治疗质量浓度区间。以卡马西平质量浓度/内标质量浓度值为横坐标（x），卡马西平峰面积/内标峰面积值为纵坐标（y），采用1/x权重拟合标准曲线，要求相关系数r≥0.99。

2.6.3 准确度与精密度

采用加标回收实验评估方法的准确度，以回收率表示；通过日内、日间重复测定评估精密度。取空白血清样本作为基质，分别加入低、中、高3个质量浓度的卡马西平对照品溶液（加入体积<总体积的10%），制备加标样本。每个质量浓度设5份样本，每份重复测定3次，连续检测3 d；计算各质量浓度样本的回收率及RSD^［12］。要求加标回收率为85.0%~115.0%，RSD≤15.0%。

2.6.4 分析特异性

选取卡马西平高值、低值质量浓度样本为基础，考察内源性干扰物对检测结果的影响，选取血红蛋白（20 g·L^-1）、未结合胆红素（342 μmol·L^-1）和胆固醇（13 mmol·L^-1）作为内源性干扰物。制备干扰物储备液、对照样本（无干扰物）和干扰样本（含干扰物），每个样本重复测定3次，记录测量结果，计算干扰样本和对照样本的均值差。要求低值样本均值差在靶值的±20.0%以内，高值样本均值差在靶值的±15.0%以内。

2.6.5 稳定性实验

考察样本在不同储存条件下的稳定性。实验分组：室温条件（15~25 ℃）放置0、4、8 h；冷藏条件（2~8 ℃）放置1、2、7 d；冷冻条件（-18 ℃以下）放置30、60、90 d。选取低、中、高3个质量浓度的血清样本，每个质量浓度重复测定3次，将不同储存条件下的检测结果与初始样本比较，计算相对偏差。要求相对偏差在±15.0%范围内。

2.6.6 携带污染

评估进样系统的携带污染效应：依次进样标准曲线最高质量浓度样本、空白样本，测定空白样本中卡马西平及内标的残留量。要求分析物残留≤20.0% LOQ，内标残留峰面积≤5.0%内标定量下限峰面积。

2.6.7 临床样本检测

收集20例符合纳入标准和排除标准的患者血清样本，采血时间为首次用药1周且达稳态谷浓度后、下次给药前。采用本研究建立的方法与第三方商品化检测试剂盒同步检测样本，每个样本平行检测3次，计算两种方法检测结果的相对偏差。要求相对偏差在±10.0%范围内。

3 结果

3.1 实验方法的优化

比较不同流动相体系（乙腈-水、甲醇-水）的分离效果：乙腈-水流动相洗脱能力较强，导致卡马西平出峰时间偏早，且乙腈成本较高；甲醇-水流动相可获得更理想的峰型和响应值，故确定其为流动相。考察不同柱温（35、40、45、50 ℃）对分离效果的影响，当将柱温设置为45 ℃时，色谱峰对称性最佳、分离度最高。样品前处理采用经甲醇-乙腈（体积比1∶1）混合溶液沉淀蛋白，该方法提取效率高、操作简便快速、成本低廉，适用于大批量样本的快速检测。

3.2 分析性能验证

3.2.1 基质效应

低、中、高3个质量浓度样本的基质因子为89.5%~113.0%，RSD为3.68%~4.23%，均符合要求，表明基质对检测结果无显著干扰。见表3。

3.2.2 LOD、LOQ与线性范围

本方法的LOD为0.1 μg·mL^-1，LOQ为1.25 μg·mL^-1，在1.25~40 μg·mL^-1质量浓度范围内，标准曲线线性关系良好（R²=0.998 6>0.990 0），满足定量检测要求。见图1、图2。

3.2.3 准确度与精密度

低、中、高3个质量浓度样本的加标回收率为91.8%~106.5%，日内RSD为3.02%~3.87%，日间RSD为3.15%~3.56%，均符合RSD≤15.0%的要求，表明该方法的准确度与精密度良好。见表4。

3.2.4 分析特异性

未结合胆红素、血红蛋白、胆固醇3种内源性物质对低、高质量浓度卡马西平的检测无显著干扰，干扰样本与对照样本的相对偏差为-2.25%~4.30%，均在要求范围内。见表5。

3.2.5 稳定性实验

不同储存条件下，低、中、高3个质量浓度样本的检测，相对偏差均在±15.0 %范围内，满足分析性能要求。见表6。

3.2.6 携带污染

空白样本中卡马西平残留量为定量下限的1.50%，内标残留峰面积为定量下限峰面积的0.17%，均远低于要求的阈值，表明该方法无明显携带污染效应。

3.2.7 临床样本检测

20例临床样本的第三方商品化试剂盒和验证方法检测结果的相对偏差为-5.09%~8.05%，均在±10%范围内，表明本研究建立的方法与商品化试剂盒检测结果一致性良好。见表7。

4 讨论

本研究结合自主研发的卡马西平检测试剂盒（液相色谱-串联质谱法），建立了血清中卡马西平的快速检测方法，并完成全面的分析性能验证。该方法样品前处理简单、快速，采用甲醇-乙腈混合溶液沉淀蛋白沉淀，相比固相萃取法，无需萃取柱的活化、上样、洗脱等步骤，操作时间短，且试剂成本更低，适合临床大批量样本的快速检测；检测效率高，单个样本上机检测仅需3~4 min，可满足临床治疗药物监测的时效性需求；定量准确、可靠，采用基质匹配校准曲线结合同位素内标法，有效消除基质效应干扰，各项性能验证指标均符合临床检测要求，且与商品化试剂盒检测结果一致性良好。

液相色谱-串联质谱技术凭借高灵敏度、高特异性的优势，近年来在临床治疗药物监测领域的应用日益广泛，尤其为精神类药物、抗肿瘤药物等的精准定量提供了技术支撑。随着国内体外诊断试剂行业的发展及相关法规的完善，该技术逐步突破传统检验技术的局限，成为临床精准诊疗的重要手段^［16-17］。

但目前液相色谱-串联质谱技术的临床应用仍面临诸多挑战：一是仪器设备依赖进口，购置与维护成本较高；二是自动化程度偏低，前处理环节仍需人工操作，制约检测通量的提升；三是专业技术人员短缺，方法开发与性能验证需兼具质谱技术与临床检验知识的复合型人才；四是部分内源性物质的离子抑制、基质干扰等问题尚未完全解决，需进一步优化前处理方法与色谱分离条件^［18］。

综上所述，本研究建立的血清中卡马西平液相色谱-串联质谱检测方法，兼具准确性与实用性，可为临床卡马西平治疗药物监测提供技术参考。未来可进一步优化方法的自动化程度，降低检测成本，并拓展至更多精神类药物的联合检测，为临床精准用药提供更全面的支持。

参考文献

[1] 李姿颖，谢洁，屈子裕，等 ．基于液相色谱-串联质谱技术的治疗药物监测方法研究进展［J］．中华检验医学杂志，2024，47（3）：332-340．

[2] LI Ziying， XIE Jie， QU Ziyu，et al ．Advances in therapeutic drug monitoring methods based on liquid chromatography-tandem mass spectrometry［J］．Chinese Journal of Laboratory Medicine，2024，47（3）：332-340．

[3] 尹慧敏，丁秋勤，贾红丽 ．卡马西平治疗新诊断部分性癫痫的临床效果及对认知功能的影响［J］．临床研究，2024，32（5）：31-34．

[4] YIN Huimin， DING Qiuqin， JIA Hongli ．Clinical effect of carbamazepine in the treatment of newly diagnosed partial epilepsy and its influence on cognitive function［J］．clinical research，2024，32（5）：31-34．

[5] 陈鑫，张欣，杨洁琼，等 ．微球囊压迫与口服卡马西平治疗三叉神经痛的效果及安全性比较［J］．西北药学杂志，2023，38（5）：139-143．

[6] CHEN Xin， ZHANG Xin， YANG Jieqiong，et al ．Comparison on the efficacy and safety of microballoon compression and carbama-zepine in the treatment of trigeminal neuralgia［J］．Northwest Pharmaceutical Journal，2023，38（5）：139-143．

[7] 毕重文，杨丽，李丹青，等 ．UPLC-MS/MS法检测人血清中卡马西平浓度及其临床应用［J］．中国临床药理学杂志，2020，36（12）：1715-1718．

[8] BI Chongwen， YANG Li， LI Danqing，et al ．Quantitative determination of carbamazepine in human serum by UPLC-MS/MS and its clinical application［J］．The Chinese Journal of Clinical Pharmacology，2020，36（12）：1715-1718．

[9] 易可可，谢洁，江游，等 ．液相色谱-串联质谱技术在临床检验中的应用研究进展［J］．质谱学报，2022，43（6）：804-816．

[10] YI Keke， XIE Jie， JIANG You，et al ．Progress in the application of liquid chromatography-tandem mass spectrometry in clinical diagnosis［J］．Journal of Chinese Mass Spectrometry Society，2022，43（6）：804-816．

[11] 崔海燕，吕晨曦，师燕华，等 ．LC-MS/MS法测定血液中卡马西平及其代谢物［J］．法医学杂志，2023，39（1）：34-39．

[12] CUI Haiyan， Chenxi LÜ， SHI Yanhua，et al ．Detection of carbamazepine and its metabolites in blood samples by LC-MS/MS［J］．Journal of Forensic Medicine，2023，39（1）：34-39．

[13] 杨飞，鞠华波，刘卫，等 ．液相色谱串联质谱与通过式固相萃取结合测定人体血液和血清中的伏立康唑和卡马西平［J］．化学试剂，2022，44（2）：285-292．

[14] YANG Fei， JU Huabo， LIU Wei，et al ．Determination of voriconazole and carbamazepine in human blood and serum by liquid chromatography tandem mass spectrometry combined with pass-through solid phase extraction［J］．Chemical Reagents，2022，44（2）：285-292．

[15] 吕晨曦，路晓君，梁嘉豪，等 ．超声辅助离子液体萃取-高效液相色谱串联质谱法测定全血中卡马西平［J］．刑事技术，2021，46（5）：478-483．

[16] Chenxi LÜ， LU Xiaojun， LIANG Jiahao，et al ．Novel approach of ultrasonic-assisted ionic liquid dispersive liquid-liquid microextraction coupled with LC-MS/MS to determine blood-harbored carbamazepine［J］．Forensic Science and Technology，2021，46（5）：478-483．

[17] 杜萍，李鹏飞，刘丽宏 ．液质联用法测定人血浆中卡马西平的不确定度评价［J］．中国临床药理学杂志，2017，33（1）：56-60．

[18] DU Ping， LI Pengfei， LIU Lihong ．Measurement uncertainty evaluation for determination of carbamazepine in human plasma by LC-MS/MS［J］．The Chinese Journal of Clinical Pharmacology，2017，33（1）：56-60．

[19] YIP V L M， MENG X， MAGGS J L，et al ．Mass spectrometric characterization of circulating covalent protein adducts derived from epoxide metabolites of carbamazepine in patients［J］．Chem Res Toxicol，2017，30（7）：1419-1435．

[20] 时欣欣，徐红蓉，储楠楠，等 ．LC-MS/MS法测定人血浆中卡马西平的浓度［J］．中国临床药学杂志，2015，24（3）：158-161．

[21] SHI Xinxin， XU Hongrong， CHU Nannan，et al ．Determination of carbamazepine in human plasma by LC-MS/MS［J］．Chinese Journal of Clinical Pharmacy，2015，24（3）：158-161．

[22] 史敏，任炳楠，吴惠珍，等 ．人血浆中左乙拉西坦和卡马西平同时测定方法的建立［J］．中国药房，2022，33（8）：987-991．

[23] SHI Min， REN Bingnan， WU Huizhen，et al ．Establishment of the method for simultaneous determination of levetiracetam and carbamazepine in human plasma［J］．China Pharmacy，2022，33（8）：987-991．

[24] 曹正，李水军，沈敏，等 ．液相色谱串联质谱临床检测方法的开发与验证［J］．检验医学，2019，34（3）：189-196．

[25] CAO Zheng， LI Shuijun， SHEN Min，et al ．Consensus of method development and validation of liquid chromatography-tandem mass spectrometry in clinical laboratories［J］．Laboratory Medicine，2019，34（3）：189-196．

[26] 中国药理学会治疗药物监测研究专业委员会，中国医师协会精神科医师分会，中国药理学会药源性疾病学委员会，等 ．中国精神科治疗药物监测临床应用专家共识（2022年版）［J］．神经疾病与精神卫生，2022，22（8）：601-608．

[27] Therapeutic Drug Monitoring Research Committee of Chinese Pharmacological Society，Psychiatric Physicians Branch of Chinese Medical Doctor Association，Drug-induced Diseases Committee of Chinese Pharmacological Society ．Expert consensus on clinical application of psychiatric therapeutic drug monitoring in China （2022 edition）［J］．Journal of Neuroscience and Mental Health，2022，22（8）：601-608．

[28] C．Hiemke，N．Bergemann，H．W．Clement，等 ．神经精神药理学治疗药物监测共识指南： 2017版［J］. 实用药物与临床，2022，25（1）：1-20．

[29] Hiemke C.，Bergemann，H， Clement H. W.，et al ．Consensus guidelines for therapeutic drug monitoring in neuropsychopharmacology：Update 2017［J］．Practical Pharmacy and Clinical Remedies，2022，25（1）：1-20．

[30] 郭欢迎，杨亚婷，王荪璇，等. HPLC-MS/MS法研究阿立哌唑不同晶型的药动学差异［J］. 西北药学杂志，2022，37（5）：15-19．

[31] GUO Huanying， YANG Yating， WANG Sunxuan，et al ．Study on the pharmacokinetic differences of different crystal forms of aripiprazole by HPLC-MS/MS［J］．Northwest Pharmaceutical Journal，2022，37（5）：15-19．

[32] 李水军，王思合. 液相色谱-串联质谱技术的临床应用进展［J］. 临床检验杂志，2016，34（12）：881-884．

[33] LI Shuijun， WANG Sihe. Progress in clinical application of liquid chromatography-tandem mass spectrometry［J］．Chinese Journal of Clinical Laboratory Science，2016，34（12）：881-884．

[34] 韩丽乔，张乔轩，黄宪章 ．液相色谱串联质谱技术定量检测的临床应用现状与挑战［J］．中华检验医学杂志，2020，43（10）：945-950．

[35] HAN Liqiao， ZHANG Qiaoxuan， HUANG Xianzhang ．Current clinical situation and challenge for liquid chromatography-tandem mass spectrometry in quantitative detection［J］．Chinese Journal of Laboratory Medicine，2020，43（10）：945-950．