基于钠加合物与缓冲体系优化的血浆中地西他滨液相色谱-串联质谱检测方法的建立

Establishment of a LC-MS/MS method for the determination of decitabine in plasma based on optimization of sodium adduct and buffer system

摘要

目的 建立可有效克服血浆中2’-脱氧胞苷与地西他滨共洗脱问题的液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry， LC-MS/MS）检测方法，提升地西他滨血浆定量检测的特异性与灵敏度。 方法 以¹⁵N₄-地西他滨为内标，血浆样本经含体积分数1%甲酸的乙腈溶液蛋白沉淀预处理后，取上清液进样分析。采用ZORBAX Eclipse Plus C₁₈色谱柱（100 mm×3 mm， 3.5 μm），以含0.02 mmol·L^-1乙酸铵水溶液（A）-含0.02 mmol·L^-1乙酸铵甲醇溶液（B）为流动相，梯度洗脱；流速为0.3 mL·min^-1；采用正离子多反应监测（multiple reaction monitoring， MRM）模式检测，地西他滨钠加合物、¹⁵N₄-地西他滨钠加合物、2’-脱氧胞苷的监测离子对质荷比（mass-to-charge ratios， m/z）分别为251.0→135.0、255.2→138.9、250.0→134.0。 结果 所建立的方法灵敏度与选择性均显著提升，血浆定量下限（lower limit of quantification， LLOQ）达0.5 ng·mL^-1，地西他滨与2’-脱氧胞苷的色谱分离度得到明显改善；地西他滨在0.5~125.0 ng·mL^-1定量范围内线性关系良好（r=0.999）。日内精密度相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为3.75%~9.31%、日内准确度相对误差（relative error， RE）为-8.80%~-5.46%；日间精密度RSD为4.53%~6.15%、日间准确度RE为-9.60%~-5.20%。地西他滨在血浆中各项稳定性指标均符合生物样品检测要求。 结论 通过联合应用钠加合物监测与乙酸铵缓冲液，同时在样本前处理中加入体积分数1%甲酸，既有效缓解了离子抑制效应，又显著提高了地西他滨与2’-脱氧胞苷的色谱分离度，优化后的LC-MS/MS方法显著提高了地西他滨定量检测的选择特异性与灵敏度，可用于地西他滨血浆药物浓度的监测。

Abstract

Objective To establish a liquid chromatography-tandem mass spectrometry （LC-MS/MS） method capable of overcoming the co-elution issue of 2’-deoxycytidine and decitabine in plasma. Methods Using ¹⁵N₄-decitabine as the internal standard， plasma samples were pretreated by protein precipitation with acetonitrile （containing 1% formic acid）， and the supernatant was injected for analysis. Separation was achieved on a ZORBAX Eclipse Plus C₁₈ column （100 mm×3 mm， 3.5 μm） with a gradient elution using water （containing 0.02 mmol·L^-1 ammonium acetate） and methanol （containing 0.02 mmol·L^-1 ammonium acetate） as the mobile phase at a flow rate of 0.3 mL·min^-1. Detection was performed under positive ion multiple reaction monitoring （MRM） mode. The mass-to-charge ratios （m/z） for the sodium adducts of decitabine and ¹⁵N₄-decitabine were 251.0→135.0 and 255.2→138.9， respectively， while that for 2’-deoxycytidine was 250.0→134.0. Results The method demonstrated significantly improved sensitivity and selectivity. The lower limit of quantification （LLOQ） in plasma reached 0.5 ng·mL^-1， with markedly improved resolution from 2’-deoxycytidine. The linear range was 0.5-125.0 ng·mL^-1 with good linearity （r=0.999）. The intra-day precision lower limit of quantification （LLOQ） ranged from 3.75% to 9.31%， and intra-day accuracy relative error （RE） ranged from -5.46% to -8.80%. The inter-day precision （RSD） was between 4.53% and 6.15%， and inter-day accuracy （RE） ranged from -5.20% to -9.60%. The stability of decitabine in plasma met the required criteria. Conclusion The combined use of sodium adducts and an ammonium acetate buffer， along with the addition of 1% formic acid during sample pretreatment， effectively alleviated ion suppression and significantly enhanced resolution. The optimized LC-MS/MS method improves the selectivity， specificity， and sensitivity for the quantitative detection of decitabine.

Graphical abstract

关键词

地西他滨 / 液相色谱-串联质谱 / 离子抑制 / 钠加合物 / 2’-脱氧胞苷 / 共洗脱作用

Key words

decitabine / liquid chromatography-tandem mass spectrometry （LC-MS/MS） / ion suppression / sodium adduction / 2’-deoxycytidine / co-elution

儿童白血病、淋巴瘤等血液系统恶性肿瘤通过化疗和造血干细胞移植干预后，总体治愈率已得到显著提升，但难治/复发性白血病、骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndromes， MDS）等疾病，在实现疾病缓解、争取移植机会及改善长期生存预后方面仍面临严峻挑战。地西他滨作为一种2’-脱氧胞苷类似物，是特异性脱氧核糖核酸甲基转移酶抑制剂，在高危或复杂核型MDS、复发难治性急性髓系白血病患儿的治疗中表现出独特的应用优势，为实现该类患儿的疾病缓解、争取造血干细胞移植机会及改善长期生存预后开辟了新的治疗路径^［1］。

尽管地西他滨作为去甲基化药物，其不良反应发生率低于传统化疗药物，但临床治疗过程中仍可能出现严重不良事件，常需采取停药、延迟给药或剂量调整等临床干预措施，此类干预措施均会不同程度地影响治疗效果^［2-4］。治疗药物浓度监测（therapeutic drug monitoring， TDM）是减少地西他滨经验性用药及个体差异所致不良反应的重要手段，可有效降低药物毒性并提高疗效，其中液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry， LC-MS/MS）技术是目前地西他滨定量检测的核心手段。健康人群或正常小鼠血浆中内源性2’-脱氧胞苷含量较低，通常不会对地西他滨检测构成显著干扰。但白血病、自身免疫性疾病或部分基因缺陷相关性疾病患者血浆中的2’-脱氧胞苷含量会显著升高^［5］，此类高水平内源性本底物质的存在给地西他滨的准确定量分析带来了严峻挑战。

内源性核苷酸与核苷类似物化疗药物在体内存在明确的分子竞争机制。地西他滨、吉西他滨、阿糖胞苷等核苷酸类似物可通过抑制核糖核苷酸还原酶活性，导致脱氧胞苷三磷酸（deoxycytidine triphosphate，dCTP）库耗竭；为代偿dCTP的不足，细胞会启动内源性代偿调控机制，最终导致血液中2’-脱氧胞苷水平异常升高^［6］。早在2006年，LIU Z等^［7］建立了基于LC-MS/MS技术检测血浆地西他滨的方法，并首次证实了2’-脱氧胞苷对地西他滨检测的干扰作用。为实现地西他滨与2’-脱氧胞苷的基线分离，该团队经多次对色谱条件的优化，最终采用乙腈-10 mmol·L^-1甲酸铵（5∶95）流动相体系实现分离，但地西他滨保留时间延长至12.2 min，峰形对称性不佳，且单个样本总分析时间长达40 min，检测通量极低。近年来，少量基于LC-MS/MS技术检测地西他滨血浆的方法相继被报道，但此类研究多以健康人群或正常大鼠空白血浆作为基质，未关注疾病状态下高浓度2’-脱氧胞苷的干扰问题^［8-9］。鉴于地西他滨在儿童急性髓系白血病治疗中的核心应用价值，迫切需要开发一种高选择性检测方法，能有效区分地西他滨与结构高度相似的内源性2’-脱氧胞苷，避免因疾病本身或药物治疗引起的2’-脱氧胞苷含量升高而导致地西他滨浓度被高估，保障检测结果的准确性。

血液中地西他滨检测面临两大主要难点：一是地西他滨与内源性2’-脱氧胞苷的分子量差异不足1 Da，且二者子离子断裂位点高度一致，质谱选择区分难度大；二是地西他滨的分子结构中，芳香杂环上的氮原子为主要质子化位点，该位点电子云密度较低，导致其气相质子亲和力弱、质子竞争性结合能力差，［M+H］⁺离子生成效率低下，检测过程中易出现严重离子抑制效应。地西他滨、¹⁵N₄-地西他滨及2’-脱氧胞苷的化学结构式见图1。

本研究旨在建立一种可实现地西他滨与2’-脱氧胞苷完全分离、同时改善地西他滨电离效率的LC-MS/MS检测方法，为临床地西他滨TDM提供简便、快速、准确的技术方案。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters ACQUITY TQ-S型串联四极杆液质联用仪（美国Waters公司）；AL204型电子天平（美国梅特勒-托利多仪器有限公司）；Milli-Q-Direct-Q5型超纯水仪（德国默克公司）；VORTEX-5型涡旋混合器（中国其林贝尔仪器制造有限公司）；Fresco 21型微量离心机（美国Thermo Fisher Scientific公司）。

1.2 试药

地西他滨对照品（批号A796950）、¹⁵N₄-地西他滨对照品（批号A796952），均购自加拿大TRC公司；2’-脱氧胞苷对照品（批号0000365699）、甲醇（色谱纯，批号11415507519）、乙腈（色谱纯，批号11232830236），均购自美国Sigma-Aldrich公司；乙酸铵（色谱纯，批号C12339456）、二甲基亚砜（色谱纯，批号C13178610），均购自中国麦克林公司；去离子水经Milli-Q-Direct-Q5超纯水仪纯化制备。

2 方法

2.1 色谱条件

采用Agilent ZORBAX Eclipse Plus C₁₈色谱柱（100 mm×3 mm，3.5 μm）。以含0.02 mmol·L^-1乙酸铵水溶液（A）-含0.02 mmol·L^-1乙酸铵甲醇溶液（B）为流动相，梯度洗脱程序：0~0.2 min，90% A；0.2~1.2 min，90% A→10% A；1.2~2.5 min，10% A；2.5~2.51 min，10% A→90% A；2.51~3.0 min，90% A。流速为0.3 mL·min^-1。柱温为40 ℃。进样量为2 μL。

2.2 质谱条件

离子源为电喷雾离子源；扫描模式为正离子模式；检测模式为多反应监测（multiple reaction monitoring， MRM）；离子喷雾电压为3 000 V，离子源温度为600 ℃；脱溶剂气流速为800 L·h^-1；定量分析离子对及质谱参数：地西他滨钠加合物质荷比（mass-to-charge ratios，m/z）251.0→135.0，锥孔电压为50 V，碰撞电压为10 V，扫描时间为0.17 s；¹⁵N₄-地西他滨钠加合物m/z 255.2→138.9，锥孔电压为40 V，碰撞电压为10 V，扫描时间为0.17 s；2’-脱氧胞苷钠加合物m/z 250.0→134.0，锥孔电压为50 V，碰撞电压为10 V，扫描时间为0.17 s。

2.3 对照品储备液及工作液的制备

2.3.1 对照品储备液

取地西他滨、¹⁵N₄-地西他滨对照品适量，精密称定，以二甲基亚砜为溶剂分别配制质量浓度为1.0 mg·mL^-1的对照品储备液；取2’-脱氧胞苷对照品适量，精密称定，以超纯水为溶剂配制质量浓度为1.0 mg·mL^-1的对照品储备液，所有储备液分装后于-80 °C冰箱中避光保存。

2.3.2 系列地西他滨对照品溶液

采用体积分数80%甲醇溶液对地西他滨储备液进行逐级稀释，制备质量浓度分别为5.0、10.0、25.0、50.0、125.0、250.0、500.0、1 250.0 ng·mL^-1的系列对照品溶液，现配现用。

2.3.3 地西他滨质量控制（quality control，QC）溶液

采用体积分数80%甲醇溶液稀释地西他滨储备液，制备低、中、高3个质量浓度（5.0、100.0、1 000.0 ng·mL^-1）的QC溶液，分装后于-80 °C冰箱中避光保存。

2.3.4 内标（internal standard，IS）工作液

精密吸取¹⁵N₄-地西他滨储备液适量，用体积分数80%甲醇溶液稀释至质量浓度为125 ng·mL^-1的IS工作液，分装后于-80 °C冰箱中避光保存。

2.3.5 2’-脱氧胞苷对照品溶液

精密吸取2’-脱氧胞苷对照品储备液适量，用超纯水定量稀释至质量浓度为100 ng·mL^-1，分装后于-80 °C冰箱中避光保存。

2.4 样品前处理

精密吸取地西他滨对照品溶液、内标工作液、2’-脱氧胞苷对照品溶液各10 μL，置于1.5 mL EP管中，加入70 μL空白血浆，涡旋混匀1 min；加入300 μL含体积分数1%甲酸的乙腈溶液作为蛋白沉淀剂，涡旋混合5 min，于4 ℃条件下以13 000 r·min^-1离心8 min，精密吸取上清液2 μL，注入LC-MS/MS系统进行分析。

2.5 方法学验证

2.5.1 专属性

取6名健康志愿者的空白血浆混合样本，分别加入质量浓度为100 ng·mL^-1的地西他滨QC溶液，质量浓度为125 ng·mL^-1 的IS工作液以及质量浓度为100 ng·mL^-1 的2’-脱氧胞苷工作液，制备加样血浆样本。按照2.4项下方法处理后进样分析，考察空白血浆中内源性物质对分析物及内标检测的干扰情况，评估方法的专属性。

2.5.2 线性曲线和定量下限 （lower limit of quantification， LLOQ）

取1.5 mL EP管，精密加入10 μL系列质量浓度地西他滨对照品溶液，10 μL IS溶液，10 μL 2’-脱氧胞苷标准溶液，加入70 μL空白血浆，制备质量浓度分别为0.5、1.0、2.5、5.0、12.5、25.0、50.0、125.0 ng·mL^-1的地西他滨血浆标准曲线样本，按照2.4项下方法处理后进样。以血浆中地西他滨质量浓度（ng·mL^-1）为横坐标（x），以地西他滨与内标的峰面积比值为纵坐标（y），采用加权最小二乘法进行线性回归分析，绘制标准曲线并计算回归方程。

2.5.3 精密度和准确度

取1.5 mL EP管，分别加入10 μL低、中、高3个质量浓度（5.0、100.0、1 000.0 ng·mL^-1）的地西他滨QC溶液、10 μL内标工作液、10 μL 2’-脱氧胞苷标准溶液，加入70 μL空白血浆，制成质量浓度分别为0.5、10.0、100.0 ng·mL^-1的QC样本，每个质量浓度制备5份，按照2.4项下方法操作后进样，连续测定3 d。根据当日标准曲线计算各样本实测浓度，考察本方法的准确度以及日内、日间精密度。

2.5.4 稀释可靠性

制备质量浓度为定量上限5倍的地西他滨血浆样品，采用空白血浆进行5倍稀释，每个稀释样本制备3分，按照2.4项下方法处理后进样，计算稀释后样本的RE和RSD，评估高浓度样本稀释后的检测可靠性。

2.5.5 残留效应

定量上限（upper limit of quantification， ULOQ）样本进样后连续分析3针空白血浆样本，ULOQ样品之后在空白样品中的残留应不超过定量下限的20%。

2.5.6 稳定性

制备低、高2个质量浓度的QC溶液（5.0、1 000.0 ng·mL^-1）的地西他滨血浆样本，分别考察室温放置4 h、冻融循环3次、-80 ℃长期保存30 d的稳定性。每个条件下每个质量浓度制备3份样本，按照2.4项下方法处理后进样检测，RE及RSD均应在±15%范围内。

3 结果

3.1 前处理方法的优化

以乙腈为蛋白沉淀剂时，地西他滨与2’-脱氧胞苷保留时间相近，无法有效分离；在乙腈中加入体积分数1%甲酸后，可显著改变2’-脱氧胞苷的保留时间，提高地西他滨与2’-脱氧胞苷的分离度，避免2’-脱氧胞苷对地西他滨定量的干扰，见图2。

3.2 检测离子的优化

在相同质量浓度下，地西他滨与2’-脱氧胞苷氢加合物色谱响应偏低，峰形拖尾、展宽，不利于准确定量；优化为钠加合物后，色谱响应显著提高，峰形对称尖锐，信噪比较高，适用于准确定量。见图3。

3.3 方法学验证

3.3.1 专属性

地西他滨与¹⁵N₄-地西他滨保留时间均为1.86 min，与2’-脱氧胞苷（1.53 min）实现完全分离。空白血浆中内源性干扰成分对分析物响应无显著影响，符合要求。见图4。

3.3.2 线性与定量下限

地西他滨在0.5~125.0 ng·mL^-¹范围内线性关系良好（r>0.999），定量下限（lower limit of quantification，LLOQ）为0.5 ng·mL^-¹。

3.3.3 精密度与准确度

日内精密度相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为3.75%~9.31%、日内准确度相对误差（relative error，RE）为-8.80%~-5.46%；日间精密度RSD为4.53%~6.15%、日间准确度RE为-9.60%~-5.20%。见表1。所有参数均符合生物分析方法验证标准。

3.3.4 稀释可靠性

地西他滨稀释后RSD为6.43%，提示超限血浆样本经5倍稀释后仍可准确定量。

3.3.5 残留效应

ULOQ样本进样后，首针双空白样本在地西他滨保留时间处无明显色谱峰，响应值均小于LLOQ的2.95%。

3.3.6 稳定性

低、高质量浓度QC样本在室温放置4 h、3次冻融循环、-80 ℃保存30 d条件下均稳定，测定浓度与标示值无显著偏差，符合验证要求。见表2。

4 讨论

本研究建立了可完全分离分子量仅相差1 Da的2’-脱氧胞苷与其结构类似物地西他滨的LC-MS/MS方法，能显著降低定量下限并缩短运行时间，可完全避免2’-脱氧胞苷干扰，实现地西他滨准确定量，为TDM提供准确、快速且经济的检测方案。本研究从样品前处理、色谱条件与质谱条件3个方面对人血浆地西他滨检测方法进行系统优化。

常规反相色谱柱（尤其是C₁₈柱）为液相色谱方法开发的首选^［10］。地西他滨为logP值为-1.93的强极性化合物，在反相色谱柱上洗脱需高水相流动相，会降低LC-MS/MS检测的灵敏度；且该药物易受2’-脱氧胞苷干扰，单纯色谱优化难以实现完全分离。大鼠血浆地西他滨检测研究考察多种C₁₈柱和流动相组合，所有测试C₁₈柱均可获得满意峰形和信号响应，但无论如何优化流动相均无法实现地西他滨与2’-脱氧胞苷完全分离^［11］。该研究最终采用氨基柱，虽更适合极性化合物分析，但存在峰形畸变、分析物响应降低、基线噪声增大、定量下限升高及检测时间延长等问题。多孔石墨碳柱可在地西他滨与2’-脱氧胞苷共洗脱条件下实现分离，但色谱柱成本高、普及度低，限制临床常规检测应用^［12］。2019年相关研究采用亲水相互作用色谱柱检测地西他滨，该方法需长达10个柱体积平衡时间建立水富集层，平衡不充分可导致显著基线漂移，单个样本分析约需14 min以维持柱平衡，严重影响检测通量^［8］。综合各类色谱柱的优劣势，地西他滨在C₁₈柱上始终呈现良好峰形，经适当方法优化后，C₁₈柱仍为能兼顾分析性能与实用性的理想选择。

离子抑制为LC-MS/MS检测的常见问题，可显著降低分析物的信号强度、影响精密度甚至导致假阳性结果^［13-14］。地西他滨质子亲和力弱，氢加合物电离弱、信号强度低。地西他滨、¹⁵N₄-地西他滨和2’-脱氧胞苷均为碱性物质，电离时产生大量氢氧根离子，添加金属阳离子形成离子对可显著提升检测信号与灵敏度^［15］；其分子结构中羰基和胺基可作为良好螯合位点，与金属离子形成稳定络合物。与传统质子化模式需要“争夺”质子不同，金属加合物形成为直接配位过程，电离时极易形成稳定［M+Na］⁺离子。HUA W等^［16］研究表明，锂加合物可使小鼠血浆地西他滨定量下限达0.5 ng·mL^-1。LAFORGIA M等^［17］采用钠加合物作为母离子检测地西他滨在输液袋中的稳定性，峰形良好、信号强度高。血浆钠离子浓度为135~145 mmol·L^-1，选择钠加合物检测无需额外引入金属离子。本研究结果显示，相同浓度地西他滨钠加合物信号强度显著高于氢加合物。因此，将氢加合物优化为钠加合物可显著提高检测灵敏度，使LLOQ降至0.5 ng·mL^-1；结合0.02 mmol·L^-1乙酸铵缓冲盐与洗脱梯度，可获得稳定、可靠、峰形良好的色谱图。

优化样品前处理为解决2’-脱氧胞苷与地西他滨共洗脱的有效策略。两个化合物在色谱柱上无法分离，可同时进入质谱离子源。固相萃取可过滤部分血浆内源性物质，但成本高、耗时长，不利于临床常规监测^［9］。地西他滨为碱性、高极性化合物，在反相C₁₈色谱柱上保留弱，流动相梯度调节难以实现理想分离。因此，本研究在蛋白沉淀剂乙腈中加入体积分数1%甲酸。低浓度甲酸既可增强碱性极性化合物在反相色谱柱上的保留，又可作为离子对试剂改善分离选择性。仅采用乙腈为蛋白沉淀剂时，无论如何调节均无法分离2’-脱氧胞苷与地西他滨；采用含体积分数1%甲酸的乙腈为蛋白沉淀剂时，二者可实现完全分离。

本研究建立高灵敏度、高选择性LC-MS/MS方法，成功实现人血浆中地西他滨定量检测并完成方法学验证。当前工作聚焦于方法学开发，尚未在临床样本检测中验证其应用价值。后续将收集患者血液样本开展药代动力学研究，并针对儿童样本获取困难问题，采用群体药代动力学建模策略，推动TDM指导下的精准给药方案优化。

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基金资助

江苏省研究型医院学会精益化用药——石药专项科研基金项目(JY202237)