阿托伐他汀促进人急性T淋巴细胞白血病细胞凋亡和自噬机制的研究

Mechanism of atorvastatin promoting apoptosis and autophagy in human acute T lymphocyte leukemia cells

摘要

目的 探究阿托伐他汀促进人急性T淋巴细胞白血病细胞凋亡和自噬的分子机制。 方法 提取阿托伐他汀钙片大鼠含药血清；选取人急性T淋巴细胞白血病细胞Jurkat培养，分别加入大鼠正常血清和大鼠阿托伐他汀含药血清进行干预。使用扫描电子显微镜观察Jurkat细胞的生长情况。通过细胞计数试剂盒-8增殖实验检测经阿托伐他汀含药血清处理后Jurkat细胞的增殖活性。Western blotting检测凋亡相关蛋白［B细胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma 2， Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）、Bcl-2相关死亡促进因子（Bcl-2-associated death promoter，Bad）、自噬相关蛋白Sequestosome-1（Sequestosome-1/SQSTM1，p62）、自噬相关基因5（autophagy related gene 5，ATG5）、Coiled-coil myosin样BCL2相互作用蛋白（Coiled-coil myosin-like BCL2-interacting protein， Beclin-1）］以及高迁移率族蛋白B1（high mobility group box 1，HMGB1）/晚期糖基化终末产物受体（receptor for advanced glycation end products，RAGE）通路蛋白的表达水平。 结果 显微镜下观察可见，经阿托伐他汀含药血清干预的Jurkat细胞体积缩小，生长速度明显变缓；细胞计数试剂盒-8增殖实验结果显示细胞增殖活性降低。Western blotting检测结果显示细胞内抗凋亡蛋白Bcl-2以及HMGB1/RAGE通路蛋白表达水平均显著降低，而促凋亡蛋白（Bax、Bad）、自噬相关蛋白（p62、ATG5、Beclin-1）表达水平均显著升高。 结论 阿托伐他汀通过抑制HMGB1/RAGE通路促进人急性T淋巴细胞白血病细胞凋亡和自噬。

Abstract

Objective To study the molecular mechanism by which atorvastatin promotes apoptosis and autophagy in human acute T-lymphoblastic leukemia （T-ALL） cells. Methods Drug-containing serum was prepared from rats administered Atorvastatin Calcium Tablets， and human acute T-lymphoblastic leukemia Jurkat cells were cultured and subsequently intervened with either normal rat serum or atorvastatin-containing rat serum. The growth status of the Jurkat cells was observed using scanning electron microscopy， and their proliferative activity following treatment with the atorvastatin-containing serum was assessed via the cell counting kit-8 （CCK-8） proliferation assay. Furthermore， Western blotting was performed to detect the expression levels of apoptosis-related proteins ［B-cell lymphoma 2 （Bcl-2）， Bcl-2-associated X protein （Bax）， and Bcl-2-associated death promoter （Bad）］， autophagy-related proteins ［Sequestosome-1 （SQSTM1/p62）， autophagy-related gene 5 （ATG5）， and coiled-coil myosin-like BCL2-interacting protein （Beclin-1）］， as well as proteins in the high mobility group box 1 （HMGB1）/receptor for advanced glycation end products （RAGE） pathway. Results Compared with control serum， atorvastatin-medicated serum induced marked shrinkage and significantly retarded the growth of Jurkat cells. CCK-8 assays revealed a pronounced reduction in proliferative capacity. Western blotting analysis showed down-regulation of the anti-apoptotic protein Bcl-2 and key HMGB1/RAGE pathway constituents， whereas pro-apoptotic （Bax， Bad） and autophagy-related proteins （p62， ATG5， and Beclin-1） were substantially up-regulated. Conclusion Atorvastatin fosters apoptosis and autophagy in Jurkat T-ALL cells through the suppression of the HMGB1/RAGE signaling axis.

Graphical abstract

关键词

阿托伐他汀 / 急性T淋巴细胞白血病 / 凋亡 / 自噬

Key words

atorvastatin / acute T-lymphoblastic leukemia / apoptosis / autophagy

急性T淋巴细胞白血病（T-cell acute lymphoblastic leukemia， T-ALL）是儿童中较常见的恶性肿瘤。目前使用放化疗技术，儿童T-ALL患者的疾病预后已得到显著改善，但仍有大约20%的患儿死于该病，成人患者死亡率甚至高达50%^［1］。T-ALL约占儿童急性白血病（aute lymphoblastic leukemia，ALL）病例的15%和成人ALL病例的25%。尽管目前T-ALL患者的存活率显著提高，但复发和难治性T-ALL的治疗仍然极具挑战性^［2］。

阿托伐他汀是当前临床上用于治疗心血管疾病的主要药物之一。研究表明，阿托伐他汀不仅通过调控免疫细胞水平抑制炎症反应，同时通过降低胆固醇调节脂质代谢来改善患者的临床症状及体征，减缓疾病进展^［3-4］。研究发现，以阿托伐他汀为代表的他汀类药物在多种人类肿瘤的治疗中显示出巨大潜力^［5］。比如，VILIMANOVICH U等^［6］研究表明，他汀类药物介导的胆固醇合成抑制剂可诱导人类白血病细胞的细胞保护性自噬。此外，有研究发现，阿托伐他汀可以抑制ALL细胞增殖，并且诱导其凋亡^［7］。然而，关于阿托伐他汀在ALL特别是T-ALL中的作用和机制还缺乏更深入的研究。本研究探讨阿托伐他汀对T-ALL细胞的抑制作用以及可能的分子机制。

1 仪器与材料

1.1 仪器

SW-CJ-2FD型超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；Forma™ 3111型CO₂细胞培养箱（赛默飞世尔科技公司）；5418R型高速冷冻离心机（艾本德股份公司）；L500型低速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；JSM-6380Lv型扫描电子显微镜（日本电子株式会社）；Multiskan FC型酶标仪（赛默飞世尔科技公司）；Mini-PROTEAN Tetra型电泳仪（伯乐生命医学产品有限公司）；Trans-Blot Turbo型转膜仪（伯乐生命医学产品有限公司）；ChemiDoc XRS+型曝光仪（伯乐生命医学产品有限公司）；CFX96 Touch型实时荧光定量PCR系统（伯乐生命医学产品有限公司）；MDF-U54V型 -80℃超低温冰箱（松下健康医疗器械株式会社）。

1.2 试药

阿托伐他汀钙片（规格为20 mg·粒^-1，批号72850026，辉瑞制药有限公司）；RPMI-1640 培养基（批号PM210228）、胎牛血清（批号FB210615）、青霉素-链霉素混合液（批号PS210310）、胰蛋白酶（批号TY210522），均购自武汉普诺赛生物公司；单宁酸（批号T0153-50G）、四氧化锇（批号210489-1G），均购自美国 Sigma-Aldrich 公司；Cell Counting Kit-8 （批号CK04-20，日本 Dojindo Laboratories 公司）；蛋白质裂解液（批号P1010）、10% 聚丙烯酰胺凝胶（批号P0052A），均购自北京索莱宝科技有限公司；蛋白质浓度测定试剂盒（批号23227）、超敏化学发光液（批号32106）、TRIzol 试剂（批号15596026），均购自美国 Thermo Fisher Scientific Inc 公司；聚偏二氟乙烯膜（批号1620177，美国 Bio-Rad Laboratories， Inc 公司）；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH，批号ab8245）、B 淋巴细胞瘤-2（Bcl-2，批号ab32124）、Bcl-2 相关 X 蛋白（Bax，批号ab32503）、Bcl-2 关联死亡启动子（Bad，批号ab62463）、高迁移率族蛋白1（HMGB1，批号ab79823）、晚期糖基化终产物受体（RAGE，批号ab216329）抗体，均购自美国 Abcam Plc 公司；p62 蛋白（批号18420-1-AP）、自噬相关基因 5（ATG5，批号10181-1-AP）、自噬相关基因 Beclin-1 抗体（批号11306-1-AP），均购自武汉三鹰生物技术有限公司；HiScript Ⅱ 逆转录酶试剂盒（批号R223-01）、ChamQ SYBR qPCR Master Mix（批号Q311-03），均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。

1.3 细胞系和实验动物

人急性T淋巴细胞白血病细胞系Jurkat，购自武汉普诺赛生物公司，以含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素混合液的RPMI-1640培养基（武汉普诺赛）培养。细胞在37 ℃、含5% CO₂的孵箱内培养。

无特定病原体（specific pathogen free， SPF）级健康SD大鼠30只， 雄性，体质量为（200±10） g，购自北京斯贝福实验动物有限公司。本研究动物实验经医院实验动物保护伦理委员会审核、批准。

2 方法

2.1 大鼠含药血清的制备

将30只SD大鼠随机分为阿托伐他汀组和空白对照组，每组15只。阿伐他汀组大鼠给予阿伐他汀溶液灌胃处理，空白对照组大鼠给予等量双蒸水灌胃处理，连续5 d每日定时灌胃1次。灌胃结束后对大鼠进行禁食处理，24 h后再对大鼠灌胃1次。1 h后，大鼠腹腔注射水合氯醛，待大鼠完全麻醉后，采集大鼠腹主动脉血。将各组全血标本于4 ℃环境下静置2 h后，在4 ℃条件下以3 000 r·min^-1离心15 min。离心后将同组血清充分混匀后，在56 ℃条件下灭活30 min。使用0.22 μm滤膜对血清进行过滤除菌，分装后冻存于-80 ℃冰箱内备用。

2.2 阿托伐他汀含药血清干预

将处于对数生长期的Jurkat细胞消化，重新接种铺板，分为空白血清组与阿托伐他汀含药血清组。分别加入等量的体积分数为10 %的大鼠空白血清及阿托伐他汀含药血清，按实验要求继续培养或者提取细胞总蛋白。

2.3 扫描电子显微镜观察

Jurkat细胞（1 × 10⁶个）经药物干预处理24 h后，去掉培养基，在4 ℃条件下用3%戊二醛固定细胞。所有细胞均在2.5%单宁酸中浸泡2 d。细胞继续在2%四氧化锇中反向固定2 h，然后在乙醇中脱水并在临界点干燥器中进行干燥。使用扫描电子显微镜成像。

2.4 细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）增殖实验

根据试剂盒说明书，使用CCK-8试剂盒进行细胞增殖实验。将细胞按3 000个·孔^-1的密度接种至96孔板中，分为空白血清组和阿托伐他汀含药血清组，分别加入等量大鼠空白血清或阿托伐他汀含药血清。培养24、48、72 h，在每个时间节点向每孔加入10 µL CCK8试剂，37 ℃避光孵育2 h。用酶标仪测定450 nm处的吸光度值（A）。

2.5 Western blotting

使用蛋白质裂解液提取细胞总蛋白，然后用蛋白质浓度测定试剂盒测定蛋白样品浓度。蛋白样品经100 ℃金属浴煮沸10 min后，在10 %聚丙烯酰胺凝胶上分离，然后转移至聚偏二氟乙烯膜（Bio-Rad Laboratories， Inc）。在室温下，将聚偏二氟乙烯膜用5%脱脂牛奶封闭1 h，然后在4 ℃条件下与一抗孵育过夜。在室温下使用二抗孵育膜孵育1 h。通过超敏化学发光液（Thermo Fisher Scientific Inc）对膜进行曝光显影。

2.6 实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction，qRT-PCR）

使用TRIzol试剂从Jurkat细胞中提取总RNA。利用HiScript Ⅱ逆转录酶试剂盒，对RNA进行逆转录反应。在Bio-Rad系统上，qRT-PCR反应采用ChamQ SYBR qPCR Master Mix进行。以GAPDH作为内参进行mRNA表达水平的相对化。各基因引物的序列见表1。

2.7 统计学方法

数据使用SPSS 22.0软件进行统计分析，所有数据均以（\overline{x}\pm s）表示。2组数据使用非配对或配对t检验比较。使用Graphpad 8.0软件绘制统计图。P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 阿托伐他汀含药血清抑制Jurkat细胞的生长

为了观察阿托伐他汀钙片对Jurkat细胞生长的影响，分别向Jurkat细胞培养体系内加入大鼠空白血清和阿托伐他汀含药血清。药物干预24、48 h后，分别在扫描电子显微镜下观察，空白血清组Jurkat细胞显示出完整的膜和光滑的细胞表面；经过阿托伐他汀含药血清干预处理的Jurkat细胞显示出破裂的细胞膜，细胞皱缩，形态改变，见图1A。同时，CCK-8实验结果表明，阿托伐他汀含药血清组Jurkat细胞增殖活性显著低于空白血清组Jurkat细胞，见图1B和表2。

3.2 阿托伐他汀含药血清干预促进Jurkat细胞的凋亡和自噬

细胞凋亡和自噬是细胞生长自我调控的重要机制。为了探究阿托伐他汀钙片是否影响了Jurkat细胞的凋亡和自噬过程，提取了空白血清组和阿托伐他汀含药血清组细胞总蛋白，并进行了Western blotting。结果显示，阿托伐他汀含药血清组Jurkat细胞内抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平显著低于空白血清组细胞，而促凋亡蛋白（Bax、Bad）、自噬相关蛋白（p62、ATG5、Beclin-1）的表达水平显著高于空白血清组细胞，见图2。结果表明阿托伐他汀钙片促进了Jurkat细胞的凋亡和自噬的发生，有利于抑制肿瘤进展。

3.3 阿托伐他汀钙片通过HMGB1/RAGE通路促进Jurkat细胞的凋亡和自噬

HMGB1/RAGE信号通路是调控细胞生长、增殖和耐药的重要信号通路。为了验证阿托伐他汀钙片对Jurkat细胞凋亡和自噬的作用是否与HMGB1/RAGE通路相关，进行了Western blotting和qRT-PCR。Western blotting结果显示，阿托伐他汀含药血清组Jurkat细胞内HMGB1和RAGE蛋白表达水平均显著低于空白血清组细胞，见图3A。在基因转录水平上，qRT-PCR结果显示，HMGB1、RAGE基因转录mRNA水平在2组细胞之间差异无统计学意义（P>0.05），见图3B、图3C和表3。结果表明，将阿托伐他汀钙片药物成分进入Jurkat细胞后，抑制了HMGB1和RAGE蛋白的表达水平，但并未影响该通路基因转录过程。

4 讨论

T-ALL是一种常见的血液系统恶性肿瘤，由造血干细胞异常增殖和分化引起。该病的病因和发病机制极其复杂^［8］。从机制上讲，T-ALL是由T细胞前体的基因变异引起，这种变异会阻止细胞的发育，导致骨髓、血液、胸腺和外周组织中原始细胞的积累^［9］。转录因子失调、细胞周期调控异常以及各种信号通路的过度激活与T-ALL的发病有关^［9-10］。尽管T-ALL的诊断和治疗取得了重大进展，但T-ALL的耐药性和复发仍然是临床面临的主要问题。这是因为用T-ALL治疗的化学药物为广谱抗癌药物，可抑制分裂旺盛的细胞的增殖，选择性较差，临床不良反应较大。

以阿托伐他汀为代表的他汀类作为一类降脂药物，显示出显著的抗癌功效。其中，阿托伐他汀作为还原酶抑制剂可能会影响癌细胞的增殖、迁移和存活。因此，已经进行了大量研究以揭示阿托伐他汀及其相关途径的抗肿瘤作用^［11］。已有研究揭示了亲脂性他汀类药物的抗癌作用。已知的机制包括诱导细胞自噬导致细胞凋亡和细胞死亡；诱发细胞染色体断裂；诱导氧化应激和激活Jun N-末端激酶导致细胞凋亡等^［12-17］。此外，据报道，对卵巢癌患者使用他汀类药物治疗可改善患者的预后^［18］。一项针对约100 000名患者的回顾性病例对照研究结果表明，他汀类药物的应用可显著提高头颈癌患者的5年生存率^［19］。这些研究结果均表明以阿托伐他汀为代表的他汀类药物在治疗癌症中具有十分广阔的应用前景。

本研究结果显示，阿托伐他汀可以通过抑制HMGB1/RAGE通路进而诱导T-ALL细胞凋亡和自噬，最终抑制肿瘤进展。这为临床T-ALL患者的治疗提供了新的思路。

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基金资助

河北省医学科学研究课题(20201252)