淫羊藿苷通过p38丝裂原活化蛋白激酶对激素抵抗型肾病综合征大鼠的激素增敏作用

Sensitization effect of icariin on hormone-resistant nephrotic syndrome in rats through p38 mitogen-activated protein kinase

摘要

目的 探讨淫羊藿苷（icariin， ICA）对激素抵抗型肾病综合征（steroid-resistant nephrotic syndrome， SRNS）大鼠的激素增敏作用及可能的机制。 方法 选取50只普拉格-道利（Sprague-Dawley， SD）大鼠构建SRNS模型，造模成功后随机分为模型组、醋酸泼尼松（prednisone acetate， PDN）组、PDN+ICA低剂量组、PDN+ICA中剂量组、PDN+ICA高剂量组，每组10只，另设对照组10只。PDN组灌胃给予6.3 mg·kg^-1 PDN混悬液；PDN+ICA低、中和高剂量组分别灌胃给予PDN混合25、50、100 mg·kg^-1 ICA混悬液（均以生理盐水配制）；对照组及模型组给予等体积生理盐水，连续干预6周。监测大鼠一般情况及体质量变化情况；检测24小时尿蛋白含量；测定血清尿素氮（blood urea nitrogen， BUN）、肌酐（serum creatinine， Scr）、总蛋白（total protein， TP）、白蛋白（albumin， ALB）、三酰甘油（triglyceride， TG）、总胆固醇（total cholesterol， TC）水平；采用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA）检测血清肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）、白细胞介素（interleukin， IL）-1β、IL-6水平；苏木精-伊红（hematoxylin-eosin， HE）染色后观察肾组织病理形态；蛋白印迹法（Western blotting）检测肾组织中p-p38和p38蛋白的相对表达量。 结果 与模型组和PDN组比较，PDN+ICA各剂量组大鼠的体质量、血清TP和ALB水平均显著升高，24 h UPr、血清BUN、Scr、TG、TC、TNF-α、IL-1β、IL-6及p-p38蛋白表达量均显著降低（P<0.05）。与PDN+ICA低剂量组比较，PDN+ICA中、高剂量组大鼠的体质量、血清TP和ALB水平均显著升高，24 h UPr、血清BUN、Scr、TG、TC、TNF-α、IL-1β、IL-6及p-p38蛋白表达水平均显著降低（P<0.05），且PDN+ICA高剂量组的变化更显著（P<0.05）。而各组p38相对表达量比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。 结论 ICA可提高SRNS大鼠对药物的敏感性，减轻机体炎症反应，改善血脂及肾功能异常，其作用机制可能与抑制p38信号通路活化有关。

Abstract

Objective To investigate the hormone-sensitizing effect of icariin （ICA） on rats with steroid-resistant nephrotic syndrome （SRNS） and its potential mechanism. Methods Fifty Sprague-Dawley （SD） rats were selected to establish the SRNS model. After successful modeling， the rats were randomly divided into the model group， prednisone acetate （PDN） group， PDN+ICA low-dose group， PDN+ICA medium-dose group， and PDN+ICA high-dose group， with 10 rats in each group. An additional 10 rats were set as the control group. Rats in the PDN group were intragastrically administered 6.3 mg·kg^-1 PDN suspension. Rats in the PDN+ICA low， medium， and high-dose groups were intragastrically administered PDN mixed with 25， 50， and 100 mg·kg^-1 ICA suspension （all prepared with normal saline）， respectively. The control and model groups were given an equal volume of normal saline. The intervention lasted for 6 consecutive weeks. The general condition and body weight changes of the rats were monitored. The 24-hour urinary protein （24 h UPr） content was measured. The serum levels of urea nitrogen （BUN）， serum creatinine （Scr）， total protein （TP）， albumin （ALB）， triglyceride （TG）， and total cholesterol （TC） were determined. The serum levels of tumor necrosis factor-α （TNF-α）， interleukin-1β （IL-1β）， and IL-6 were detected by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. The pathological morphology of renal tissue was observed after hematoxylin-eosin （HE） staining. The relative expression levels of p-p38 and total p38 protein in renal tissue were detected by Western blotting. Results Compared with the model group and the PDN group， the body weight， serum TP， and ALB levels were significantly increased， while the 24 h UPr， serum BUN， Scr， TG， TC， TNF-α， IL-1β， IL-6 levels， and p-p38 protein expression were significantly decreased in all PDN+ICA dose groups （P<0.05）. Compared with the PDN+ICA low-dose group， the body weight， serum TP， and ALB levels were significantly increased， while the 24 h UPr， serum BUN， Scr， TG， TC， TNF-α， IL-1β， IL-6 levels， and p-p38 protein expression were significantly decreased in the PDN+ICA medium and high-dose groups （P<0.05）， with the PDN+ICA high-dose group showing the most optimal effect （P<0.05）. However， no statistically significant difference was found in the relative expression of total p38 protein among all groups （P>0.05）. Conclusion ICA can improve the drug sensitivity of SRNS rats， reduce inflammatory reaction and improve abnormal blood lipid level， which may play a role by affecting p38 signal pathway.

Graphical abstract

关键词

淫羊藿苷 / 激素抵抗型肾病综合征 / p38丝裂原活化蛋白激酶通路 / 炎症因子 / 肾功能

Key words

icariin / steroid-resistant nephrotic syndrome / p38 mitogen-activated protein kinase （p38 MARK） pathway / inflammatory factors / renal function

原发性肾病综合征是临床常见的肾脏疾病，主要临床表现为大量蛋白尿、低白蛋白血症、高血脂症^［1］。临床治疗原发性肾病综合征多以糖皮质激素为核心，通过调节肾功能改善症状，但部分患者经大剂量糖皮质激素治疗后病情仍无缓解，进展为激素抵抗型肾病综合征（steroid resistant nephrotic syndrome， SRNS），属于难治性肾病综合征范畴^［2］。目前临床针对SRNS常采用免疫抑制剂联合治疗，但该类药物存在毒性和不良反应强、复发率高、预后不佳及疗效个体差异大等问题，因此亟需探寻安全有效的中药替代或辅助治疗药物^［3］。淫羊藿苷（icariin， ICA）是从小檗科植物淫羊藿干燥茎叶中提取的活性成分，作为中医临床常用补肾壮阳药，具有补肝肾、活气血、强筋骨的功效。现代药理研究证实，ICA还具有调节免疫功能、改善心脑血管供血、防治骨质疏松等多种药理活性^［4-5］。已有研究表明，ICA可调节内分泌系统平衡，减轻肾功能损伤，但其在SRNS中的作用及潜在机制尚未明确^［6］。本研究通过构建SRNS大鼠模型，探讨ICA对模型大鼠肾功能损伤的保护作用及可能的机制，为ICA的临床转化及SRNS的中药治疗提供实验依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Heraeus Multifuge X1型高速离心机（美国赛默飞世尔公司）；ADAM型电子天平（英国艾德姆公司）；SYNERGY-H4型多功能酶标检测仪（美国伯腾仪器公司）。

1.2 试药

ICA（批号B21576，质量分数≥98%，上海源叶生物科技有限公司）；醋酸泼尼松（prednisone acetate， PDN）片（批号P10611，质量分数为98%，规格为5 g·片^-1，上海吉至生物科技有限公司）；阿霉素（批号R034347，质量分数≥97%，上海易恩化学技术有限公司）；尿素氮（blood urea nitrogen， BUN）、肌酐（serum creatinine， Scr）、总蛋白（total protein， TP）、白蛋白（albumin，ALB）、三酰甘油（triglyceride， TG）、总胆固醇（total cholesterol， TC）检测试剂盒，均购自上海邦景生物科技有限公司；白细胞介素（interleukin， IL）-1β、IL-6和肿瘤坏死因子-α（tumour necrosis factor-α， TNF-α）酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA）试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所；兔源β-肌动蛋白（β-actin）多克隆抗体、兔源磷酸化p38（p-p38）多克隆抗体、兔源p38 多克隆抗体以及辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase， HRP）标记的羊抗兔IgG二抗，均购自北京索莱宝科技有限公司；二喹啉甲酸测定法（bicinchoninic acid assay， BCA）蛋白浓度测定试剂盒（批号PC0020，上海碧云天生物技术有限公司）。

1.3 实验动物

65只无特定病原体（specific pathogen free， SPF）级斯普拉格-道利（sprague-dawley， SD）大鼠，7周龄，购自浙江维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号为SCXK（浙）2019-0001，体质量为200~230 g。置于统一饲养环境中适应性饲养7 d，温度为20~24 ℃，相对湿度为55%~65%，通风良好，自由饮水、摄食。

2 方法

2.1 SRNS大鼠模型的建立

适应性饲养结束后，随机选取55只大鼠构建SRNS模型。造模第1天，将大鼠仰卧位固定于束缚台上，暖灯照射并轻柔揉搓尾部使尾静脉扩张，碘酒擦拭消毒后，在无菌条件下刺入尾静脉，缓慢注射4 mg·kg^-1阿霉素溶液，大鼠尾部出现曲折、肿胀表示注射成功；对照组注射等体积的生理盐水。7 d后，模型组大鼠再次经尾静脉注射3.5 mg·kg^-1阿霉素溶液。注射2周后，检测大鼠24 h尿蛋白（24-hour urinary protein， 24 h UPr）含量，若24 h UPr>100 mg，则随机抽取5只大鼠观察肾组织病理变化并采血检测ALB、TG、TC水平。若大鼠肾组织出现局灶节段性肾小球硬化，且血清ALB降低，TG和TC水平显著升高，即判定为建模成功^［7］。

2.2 分组与给药

将造模成功大鼠随机分为模型组、PDN组、PDN+ICA低剂量组、PDN+ICA中剂量组、PDN+ICA高剂量组，每组10只，另设对照组10只。参照文献^［8-9］方法给药：PDN组灌胃给予6.3 mg·kg^-1 PDN混悬液；PDN+ICA低、中、高剂量组分别灌胃给予含25、50、100 mg·kg^-1 ICA的PDN混合混悬液（均以生理盐水配制）；对照组及模型组给予等体积生理盐水。各组均每日给药1次，连续干预6周。

2.3 标本采集

末次给药后，大鼠腹腔注射体积分数3%戊巴比妥钠麻醉（45 mg·kg^-1），深度麻醉后将大鼠以仰卧位固定于手术台上，开胸采集腹主动脉血，室温静置30 min后，于4 ℃条件下以3 000 r·min^-1离心15 min，分离血清，置于-20 ℃冰箱中保存备用。采血完毕后，放血处死大鼠，快速分离双侧肾脏组织：左侧肾脏组织剪碎后置于无菌冻存管中，于-80 ℃冰箱中保存；右侧肾脏组织放入体积分数4%多聚甲醛溶液中固定24 h，备用。

2.4 一般情况的观察和24 h UPr的检测

治疗期间，每日观察并记录各组大鼠的精神状态、反应灵敏度、毛色和粪便性状等一般情况，每3周称量并记录大鼠的体质量。每3周采用代谢笼全收尿法收集大鼠24 h尿液，记录总尿量；尿液以3 000 r·min^-1离心10 min，取上清液，采用免疫比浊法测定24 h UPr。

2.5 肾功能和血脂水平的检测

取出冻存血清，于室温条件下复温后，参照对应ELISA试剂盒说明书，测定血清中BUN、Scr、TP、ALB、TG和TC的水平。主要步骤：取出所需酶标板条，设置标准孔与样品孔，分别加入50 μL梯度浓度标准品及待测血清样品，封膜后恒温孵育；除空白孔外，每孔加入100 μL酶标记抗体液，封膜再次孵育；弃去孔内液体，拍干后洗涤，加入底物反应，终止反应后，测定各孔吸光度值，依据标准曲线计算样品浓度。

2.6 炎性因子水平的检测

检测前将TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA试剂盒和血清样品于室温条件下复温30 min。按照试剂盒说明书操作：取150 μL稀释液加入标准品中，静置10 min后稀释为梯度质量浓度；空白孔加入10 μL稀释液，样品孔加入40 μL待测血清，各标准孔加入50 μL对应梯度质量浓度标准品稀释液；每孔加入10 μL酶标抗体，充分混匀后置于37 ℃恒温水浴箱中孵育30 min；每孔加入显色剂，混匀反应后，采用多功能酶标检测仪分别在535、450 nm波长处测定各孔吸光度值。根据标准品质量浓度绘制标准曲线，计算血清中各炎症因子的质量浓度。

2.7 肾组织HE染色观察

取出固定后的右侧肾组织，清水冲洗10 min后，依次加入梯度浓度乙醇梯度溶液（75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ、100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ）中脱水，每个浓度处理1~2 h；脱水后，组织依次转入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中进行透明处理，每次15~20 min。透明后的组织放入65 ℃熔化的石蜡中浸透2 h，然后倒入包埋盒内包埋成石蜡块。将石蜡块用切片机切成4 μm厚的薄片，在温水中展平，贴于载玻片上，置于60 ℃烤箱中烘干2 h。染色前，切片需先脱蜡和水化：依次放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中，各10 min脱蜡，再经100%乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇下行至蒸馏水，每个浓度5 min。随后进行染色，苏木精染液染色5 min，流水冲洗后，用体积分数1%盐酸乙醇分化数秒，再用氨水返蓝10 min。水洗后，用体积分数0.5%伊红染液复染2 min。染色后，切片依次经75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ进行脱水，每个浓度3~5 min，再经二甲苯透明2次，每次5 min。最后，擦去载玻片周围多余液体，滴加中性树胶，加盖盖玻片封片，置于光学显微镜下观察并拍照。

2.8 蛋白印迹法（Western blotting）检测蛋白表达

取出冻存的左侧肾组织，剪碎后加入放射性免疫沉淀分析裂解液（radio-immunoprecipitation assay lysis buffer，RIPA），于冰上充分研磨裂解；以12 000 r·min^-1离心10 min，取上清液，采用BCA法蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。取40 μL蛋白样品与10 μL上样缓冲液混匀，沸水浴加热变性；将制备好的凝胶固定于电泳槽中，拔出梳齿，加入蛋白样品，80 V恒压电泳至浓缩胶与分离胶交界处，调整电压至120 V继续电泳至凝胶底部；将蛋白转至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，用体积分数5%脱脂牛奶室温封闭2 h，含Tween-20的Tris缓冲盐溶液（tris-buffered salve with tween 20， TBST）洗涤3次，加入1∶1 000稀释的p-p38多克隆抗体、p38多克隆抗体及β-actin多克隆抗体，4 ℃孵育过夜；加入1∶5 000稀释的HRP标记的羊抗兔IgG二抗，TBST缓冲液洗涤3次，滴加增强化学发光（enhanced chemiluminescence， ECL）化学发光液，通过凝胶成像系统成像，采用Image J软件分析目的条带的灰度值，以β-actin为内参，计算p-p38、p38蛋白相对表达量。

2.9 统计学方法

采用SPSS 23.0软件对数据进行处理。计量资料以（\overline{x}±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 一般情况与体质量的比较

实验期间，对照组大鼠的精神状态良好，反应灵敏，毛色光亮柔顺，进食正常，大便成形。与对照组比较，模型组大鼠的精神状态不佳、反应迟钝、嗜睡少动，出现弓背蜷缩现象，毛色黯淡枯燥，部分大鼠出现毛发脱落、尾部注射部位溃烂及腹部肿胀，粪便稀溏。与模型组比较，PDN+ICA各剂量组大鼠精神状态明显好转，反应灵敏度、毛色及进食量均显著改善，大便恢复成形。

体质量统计结果显示：与对照组比较，模型组大鼠第0、3、6周体质量均显著降低（P<0.05）。与模型组和PDN组比较，PDN+ICA各剂量组第3、6周体质量均显著升高（P<0.05），且以PDN+ICA高剂量组的改善效果最佳（P<0.05）。见表1。

3.2 24 h UPr的比较

与对照组比较，模型组第0、3、6周24 h UPr均显著升高（P<0.05）。与模型组和PDN组比较，PDN+ICA各剂量组第3、6周24 h UPr均显著降低（P<0.05），且以PDN+ICA高剂量组的改善效果最佳（P<0.05）。见表2。

3.3 肾功能指标的比较

与对照组比较，模型组的血清BUN、Scr水平均显著升高（P<0.05）。与模型组和PDN组比较，PDN+ICA各剂量组的血清BUN、Scr水平均显著降低（P<0.05），且以PDN+ICA高剂量组的改善效果最佳（P<0.05）。见表3。

3.4 血脂水平的比较

与对照组比较，模型组的血清TP、ALB水平均显著降低，TG、TC水平均显著升高（P<0.05）。与模型组和PDN组比较，PDN+ICA各剂量组的血清TP、ALB水平均显著升高，TG、TC水平均显著降低（P<0.05），且以PDN+ICA高剂量组的改善效果最佳（P<0.05）。见表4。

3.5 炎性因子水平的比较

与对照组比较，模型组的血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平均显著升高（P<0.05）。与模型组和PDN组比较，PDN+ICA各剂量组的血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平均显著降低（P<0.05），且以PDN+ICA高剂量组的改善效果最佳（P<0.05）。见表5。

3.6 肾组织HE染色结果的比较

对照组的肾组织结构完整，肾小球、肾小管形态正常，肾小球内血管清晰，无炎性细胞浸润和水肿现象。模型组和PDN组的肾组织结构破坏严重，肾小球体积显著增大，肾小管上皮细胞萎缩、坏死，肾间质可见大量炎性细胞浸润。PDN+ICA低、中、高剂量组的肾组织损伤程度逐次减轻，肾小球体积逐渐恢复正常，毛细血管结构基本清晰，肾小管上皮细胞坏死现象改善，间质炎性细胞浸润数量显著减少。见图1。

3.7 肾组织p-p38和p38蛋白水平的比较

与对照组比较，模型组肾组织p-p38蛋白相对表达量显著升高（P<0.05）。与模型组和PDN组比较，PDN+ICA各剂量组p-p38蛋白相对表达量均显著降低（P<0.05），且以PDN+ICA高剂量组的改善效果最佳（P<0.05）。各组p38相对表达量比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。见表6、图2。

4 讨论

SRNS的发病机制复杂，现代医学认为其与4大因素密切相关：机体免疫功能紊乱、肾组织足细胞编码基因变异、糖皮质激素受体缺失或结构异常、肾脏病理类型转化，其典型组织学特征表现为局灶节段性肾小球硬化、系膜增生性肾小球肾炎及微小病变^［10］。由于SRNS对糖皮质激素存在抵抗性，临床易反复发作、预后较差，且常继发血栓栓塞、严重感染、急性肾功能衰竭等并发症，有研究结果显示，约50%的SRNS患者最终进展为肾衰竭，严重危害患者的生命健康^［11］。目前临床多采用免疫抑制剂联合治疗，但该方案存在毒性和不良反应强、个体差异大等局限，因此探寻安全有效的中药辅助治疗方案具有重要的临床价值。

ICA作为淫羊藿的核心活性黄酮类成分，是中医药临床治疗肾病的常用活性物质，具有补肾助阳的功效^［12］。本研究采用两次尾静脉注射阿霉素建立SRNS大鼠模型，该模型病理进程与人类SRNS高度相似，具有死亡率低、成本可控、操作简便等优势，是肾脏疾病研究中常用的动物模型^［13-14］。本研究结果显示，模型组大鼠的精神状态不佳，体质量增长迟缓、血清TP和ALB水平均显著降低，24 h UPr，血清BUN、Scr、TG、TC水平均显著升高，表明模型组大鼠肾组织病理损伤严重，出现蛋白尿和血脂代谢异常症状；而单纯给予激素药物PDN干预后，上述指标无明显改善，提示大鼠已形成激素抵抗，表明该模型成功建立。

给予不同剂量ICA联合PDN治疗后，大鼠精神状态明显好转，体质量，血清TP、ALB水平均显著升高，24 h UPr，血清BUN、Scr、TG、TC水平均显著降低，且呈剂量依赖性，高剂量组效果最优。同时肾组织HE染色结果显示，ICA联合PDN可明显减轻肾小球肿胀、肾小管上皮细胞坏死及间质炎性浸润，使肾组织结构趋于正常。上述结果表明，ICA可有效提高SRNS大鼠对激素的敏感性，修复肾脏病理损伤，改善肾功能及血脂代谢异常，与前文实验结果形成完整呼应。

p38信号通路来属于丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase， MAPK）通路家族，是细胞内重要的信号传导通路，能够被细胞外应激信号激活，通过级联反应调控基因的转录，参与细胞增殖、凋亡、免疫应答等多种生物学过程^［15］。在生理状态下，p38信号通路处于稳态调控中；而在肾脏病理损伤时，p38蛋白被快速磷酸化激活为p-p38蛋白，进而启动下游炎症信号通路，促进TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性因子释放，加重血脂代谢紊乱及肾组织损伤^［16］。本研究结果显示，与模型组比较，PDN+ICA组大鼠肾组织p-p38蛋白表达水平显著降低，炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平均显著降低，且p38总蛋白表达无显著差异。这提示ICA并非影响p38蛋白的合成，而是通过抑制其磷酸化活化，阻断p38 MAPK通路的信号传导，进而减少下游炎性因子的释放，减轻炎症介导的肾组织损伤，最终逆转大鼠的激素抵抗状态。

综上所述，ICA能够提高SRNS大鼠对激素的敏感性，通过抑制p38信号通路活化减轻机体炎症反应，改善肾功能及血脂代谢异常，修复肾组织病理损伤，且该作用呈剂量依赖性。本研究为SRNS的中药辅助治疗提供了实验依据，也为ICA的临床转化及作用机制研究奠定了基础。

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基金资助

河南省中医药科学研究专项课题(2017ZY2117)