益母草碱通过调节SDF-1/CXCR4信号通路对骨质疏松大鼠的改善作用

Improvement effect of leonurine on osteoporosis in rats by regulating the SDF-1/CXCR4 signaling pathway

摘要

目的 探讨益母草碱（leonurine， Leo）对骨质疏松（osteoporosis， OP）大鼠的改善作用及对基质细胞衍生因子-1/CXC型趋化因子受体4（stromal cell-derived factor-1/CXC chemokine receptor 4， SDF-1/CXCR4）信号通路的影响。 方法 构建OP大鼠模型，将造模成功的大鼠随机分为模型组，益母草碱低剂量组（Leo-L组），益母草碱高剂量组（Leo-H组），益母草碱高剂量+通路抑制剂组（Leo-H+AMD3100组），每组18只，另取18只正常大鼠作为对照组。双能X射线骨密度仪检测大鼠右股骨骨密度（bone density， BMD）； Micro-CT平扫检测右股骨的骨微结构；酶联免疫吸附试验检测血清中骨代谢相关因子碱性磷酸酶（alkaline phosphatase， ALP）、Ⅰ型前胶原氨基端前肽（procollagen Ⅰ N-terminal propeptide， PINP）、骨钙素（osteocalcin， OC）、Ⅰ型胶原交联N-末端肽（N-terminal peptide of collagen type Ⅰ， NTX）水平；HE染色观察右股骨组织病理形态； Western blotting检测骨形成相关蛋白骨形成蛋白2（bone morphogenetic protein 2， BMP-2）、Runt相关转录因子2 （runt related transcription factor 2， RUNX2）、成骨细胞特异性转录因子（Osterix）及SDF-1/CXCR4信号通路相关蛋白的表达。 结果 与对照组比较，模型组的股骨组织遭到破坏，骨小梁发生断裂，排列紊乱，且其数量减少，BMD、BV/TV、骨小梁数量（trabecular number，Tb.N）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）、ALP、PINP、OC、BMP-2、RUNX2、Osterix、SDF-1、CXCR4的表达水平均降低，骨小梁分离度（trabecular separation，Tb.Sp）、NTX的表达水平均升高（P<0.05）； Leo-L、Leo-H组较模型组股骨组织病理损伤减轻，骨小梁排列相对规则，数量有所增加， BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th、ALP、PINP、OC、BMP-2、RUNX2、Osterix、SDF-1、CXCR4表达水平均升高， Tb.Sp、NTX表达水平均降低（P<0.05）； Leo-H+AMD3100组较Leo-H组股骨组织病理损伤加重，BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th、ALP、PINP、OC、BMP-2、RUNX2、Osterix、SDF-1、CXCR4表达水平均降低， Tb.Sp、NTX表达水平均升高（P<0.05）。 结论 益母草碱可改善大鼠OP，其机制与激活SDF-1/CXCR4通路相关。

Abstract

Objective To explore the improvement effect of leonurine （Leo） on osteoporosis （OP） in rats and the influence on stromal cell-derived factor-1/CXC chemokine receptor 4 （SDF-1/CXCR4） signaling pathway. Methods A rat model of OP was constructed， and the successfully modeled rats were randomly divided into a model group， low-dose leonurine group （Leo-L group）， high-dose leonurine group （Leo-H group）， and high-dose leonurine+pathway inhibitor group （Leo-H+AMD3100 group）， with 18 rats in each group. An additional 18 normal rats were selected as the control group. Dual energy X-ray bone density instrument was applied to detect the bone density （BMD） of the right femur in rats. Micro-CT plain scan was applied to detect the bone microstructure of the right femur. Enzyme linked immunosorbent assay （ELISA） was applied to detect the levels of bone metabolism related factors alkaline phosphatase （ALP）， procollagen Ⅰ N-terminal propeptide （PINP）， osteocalcin （OC）， and N-terminal peptide of collagen type Ⅰ （NTX） in serum. HE staining was applied to observe the pathological morphology of the right femoral tissue. Western blotting was applied to detect the expression of bone morphogenetic protein 2 （BMP-2）， runt related transcription factor 2 （RUNX2）， osteoblast specific transcription factor （Osterix）， and SDF-1/CXCR4 signaling pathway related proteins. Results Compared with the control group， the femoral tissue in the model group was damaged， with bone trabeculae breaking，disordered arrangement， and a decrease in the number. The expressions of BMD， BV/TV， trabecular number （Tb.N）， trabecular thickness （Tb.Th）， ALP， PINP， OC，BMP-2， RUNX2， Osterix， SDF-1， and CXCR4 all decreased， while the expressions of trabecular separation （Tb.Sp） and NTX all increased （P<0.05）. Compared with the model group， the pathological damage of the femoral tissue in the Leo-L and Leo-H groups was alleviated， the arrangement of bone trabeculae was relatively regular， and the number increased. The expression levels of BMD， BV/TV， Tb.N， Tb.Th， ALP， PINP， OC， BMP-2， RUNX2， Osterix， SDF-1， and CXCR4 all increased， while the expression levels of Tb.Sp and NTX both decreased （P<0.05）. Compared with the Leo-H group， the pathological damage of the femoral tissue in the Leo-H+AMD3100 group was more severe. The expression levels of BMD， BV/TV， Tb.N， Tb.Th， ALP， PINP， OC， BMP-2， RUNX2，Osterix， SDF-1， and CXCR4 all decreased， while the expression levels of Tb.Sp and NTX both increased （P<0.05）. Conclusion Leonurine can improve OP in rats， and its mechanism is related to the activation of the SDF-1/CXCR4 pathway.

Graphical abstract

关键词

益母草碱 / 基质细胞衍生因子-1/CXC型趋化因子受体4信号通路 / 骨质疏松

Key words

leonurine / stromal cell derived factor 1/CXC chemokine receptor 4 signaling pathway / osteoporosis

骨质疏松症（osteoporosis， OP）是与骨代谢异常相关的全身性骨骼疾病，主要表现为骨密度降低、骨量减少、骨脆性增加、骨组织微结构损坏、易骨折等，进而引起脊柱变形、骨骼疼痛、骨折等症状，影响患者的生活质量^［1-2］。OP的发生与年龄增长密切相关，随着全球人口老龄化加剧，OP的发病率逐年升高，导致骨折死亡率与致残率居高不下，已成为世界性问题^［3-4］。OP目前主要通过服用降钙素类、雌激素、双膦酸盐等抗骨吸收的药物进行治疗，虽然可使症状有所缓解，但患者常发生恶心、呕吐等不良反应，甚至引起肾毒性，增加致癌风险^［5-6］。益母草碱是传统中草药益母草中的一种主要的生物活性成分，具有抗炎、抗氧化作用，近年来其在骨相关疾病治疗的研究中逐渐受到关注。研究发现，益母草碱可抑制氧化应激反应，促进骨髓间充质干细胞的增殖与分化，减轻大鼠OP^［7］。基质细胞衍生因子-1/CXC型趋化因子受体4（stromal cell-derived factor-1/CXC chemokine receptor 4， SDF-1/CXCR4）信号通路参与成骨分化进程，激活该通路可促进骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells， BMSCs）成骨分化^［8］。益母草碱能否通过激活SDF-1/CXCR4通路改善大鼠OP尚不清楚，本研究初步探究益母草碱对OP大鼠的改善作用及对SDF-1/CXCR4通路的影响，以期为OP的治疗寻求新途径。

1 仪器与材料

1.1 仪器

SpectraMax M2型和M2e型多功能酶标仪均购自美谷分子仪器（上海）有限公司；Faxitron双能X线骨密度测量仪［阿斯迈德生物科技（北京）有限公司］；512型显微镜（上海玉研科学仪器有限公司）；Invitrogen iBright 智能成像系统（美国赛默飞世尔科技公司）。

1.2 试药

益母草碱（通过HPLC检测药物质量分数≥98%，北京伊塔生物科技有限公司）；ALP、PINP、OC、NTX 酶联免疫吸附试验试剂盒，均购自上海抚生实业有限公司；BMP-2、RUNX2抗体，均购自武汉菲恩生物科技有限公司；Osterix抗体［默克生命科学技术（南通）有限公司］；SDF-1、CXCR4抗体，均购自上海康朗生物科技有限公司。

1.3 实验动物

SPF级SD健康雌性大鼠，质量为（200±20） g，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司［SCXK（鲁）2022 0006］。本研究经医院动物伦理委员会审核、批准。

2 方法

2.1 OP大鼠模型的构建

所有大鼠先适应性喂养1周后，禁食、禁水12 h，麻醉后固定在手术台上，腹部备皮消毒，在下腹部做正中线切口，打开腹腔，将双侧卵巢动脉结扎并切除双侧卵巢组织及周围少许脂肪组织，缝合伤口，消毒，并注射抗生素以预防感染，12周后用双能X线骨密度仪测定大鼠左、右股骨骨密度（bone density，BMD），若造模大鼠BMD值显著低于假手术组，表示造模成功^［9-10］。假手术组即对照组，仅暴露卵巢但不切除卵巢组织，其余操作相同。

2.2 分组与处理

共110只大鼠参与造模，死亡13只，死亡率为11.82%，将造模成功的大鼠随机分为模型组、益母草碱低剂量组（Leo-L组）、益母草碱高剂量组（Leo-H组）、益母草碱高剂量+通路抑制剂组（Leo-H+AMD3100组），每组18只，另取18只正常大鼠作为对照组。Leo-L组、Leo-H组^［11］：分别腹腔注射4、16 mg·kg^-1·d^-1益母草碱；Leo-H+AMD3100组^［12］：腹腔注射16 mg·kg^-1·d^-1益母草碱及5 mg·kg^-1·d^-1 AMD3100；模型组与对照组腹腔注射与Leo-L、Leo-H组等剂量的生理盐水。各组大鼠均连续处理4周。

2.3 骨代谢水平的检测

给药结束后，腹主动脉取血，血样于25 ℃静置2 h，于4 ℃条件下以2 000 r·min^-1离心20 min， 用ELISA试剂盒测定ALP、PINP、OC、NTX水平。

2.4 骨密度的检测

将所有大鼠处死，取右侧股骨组织，各组选择其中6个右股骨组织，将周围结缔组织及肌肉去除干净后，利用双能X线骨密度测量仪对大鼠右股骨进行扫描，得到每个样本的骨密度值，取均值。将剩余股骨组织置于-20 ℃冰箱中保存。

2.5 骨微结构的观察

各组选择6个右股骨组织置于体积分数4%多聚甲醛溶液中，Micro-CT平扫检测股骨组织骨微结构，再用ZKKS-MicroCT4.1软件进行定量分析，选择生长板1 mm开始，3 mm长的区域分析，检测骨微结构参数指标骨体积分数（BV/TV）、骨小梁数量（Tb.N）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁间隙（Tb.Sp）。

2.6 股骨组织的病理观察

取2.4项下保存的股骨组织，去除软组织后用体积分数4%多聚甲醛固定，磷酸盐缓冲液冲洗，进行脱钙处理，随后浸蜡制石蜡切片，进行HE染色，用显微镜观察股骨组织的病理形态。

2.7 骨形成相关蛋白及SDF-1/CXCR4信号通路相关蛋白的检测

将各组剩余6个股骨组织研碎后进行蛋白裂解，提取并定量总蛋白，沸水浴3~5 min、凝胶电泳分离，湿转PVDF膜，用血清封闭，将封闭膜与BMP-2、RUNX2、Osterix、SDF-1、CXCR4一抗4 ℃过夜反应，次日再与HRP标记二抗室温反应2 h，可视化处理1 h，收集图像分析蛋白条带的灰度值，计算各蛋白相对表达量。

2.8 统计学方法

采用SPSS 25.0软件对数据进行处理。实验数据均符合正态分布，以（\overline{x}\pm s）表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 Leo对OP大鼠骨密度的影响

模型组的BMD低于对照组（P<0.05）；Leo-L组、Leo-H组的BMD均高于模型组（P<0.05）；Leo-H+AMD3100组的BMD低于Leo-H组（P<0.05）。见表1。

3.2 Leo对OP大鼠骨微结构的影响

模型组的BV/TV、Tb.N、Tb.Th均低于对照组，Tb.Sp均高于对照组（P<0.05）；Leo-L组、Leo-H组的BV/TV、Tb.N、Tb.Th均高于模型组，Tb.Sp均低于模型组（P<0.05）；Leo-H+AMD3100组的BV/TV、Tb.N、Tb.Th均低于Leo-H组，Tb.Sp均高于Leo-H组（P<0.05）。见表2。

3.3 Leo对OP大鼠骨代谢水平的影响

模型组的ALP、PINP、OC水平均低于对照组，NTX水平均高于对照组（P<0.05）；Leo-L组、Leo-H组的ALP、PINP、OC均高于模型组，NTX水平均低于模型组（P<0.05）；Leo-H+AMD3100组的ALP、PINP、OC水平均低于Leo-H组，NTX水平均高于对照组（P<0.05）。见表3。

3.4 Leo对OP大鼠股骨组织病理形态的影响

对照组的股骨组织结构正常，骨小梁排列规则，无病理损伤现象；模型组的股骨组织遭到破坏，骨小梁发生断裂，排列紊乱，且其数量减少；Leo-L组、Leo-H组的股骨组织病理损伤减轻，骨小梁排列相对规则，数量有所增加；Leo-H+AMD3100组的股骨组织病理损伤加重。见图1。

3.5 Leo对OP大鼠骨形成相关蛋白的影响

模型组的BMP-2、RUNX2、Osterix表达水平均低于对照组（P<0.05）；Leo-L组、Leo-H组的BMP-2、RUNX2、Osterix表达水平均高于模型组（P<0.05）；Leo-H+AMD3100组的BMP-2、RUNX2、Osterix表达水平均低于Leo-H组（P<0.05）。见图2、表4。

3.6 Leo对SDF-1/CXCR4信号通路的影响

模型组的SDF-1、CXCR4表达水平均低于对照组（P<0.05）；Leo-L组、Leo-H组的SDF-1、CXCR4表达水平均高于模型组（P<0.05）；Leo-H+AMD3100组的SDF-1、CXCR4表达水平均低于Leo-H组（P<0.05）。见图3、表5。

4 讨论

OP的发生主要是受家族史、性别、不良生活方式及滥用药物等多种因素影响，造成成骨细胞相关骨形成和破骨细胞相关骨吸收之间的动态平衡被破坏，骨代谢处于负平衡，导致骨质流失^［13］。益母草碱主要提取自中草药益母草，其不良反应较小，在骨相关疾病的治疗中具有一定作用。研究发现，益母草碱可促进BMSCs向成骨细胞分化并保护其增殖和分化免受氧化应激影响^［7，14］。益母草碱可通过抑制关节炎症和骨破坏，缓解小鼠类风湿关节炎^［15］。骨小梁的微观结构是预测骨量丢失和结构破坏的常用指标，BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp作为检测骨小梁的参数可以准确反映骨小梁的细微变化，对于骨质疏松症的诊断和治疗至关重要^［16-17］。本研究结果显示，益母草碱可使BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th升高，Tb.Sp降低，减轻股骨组织病理损伤，增加骨小梁数量，改善大鼠OP。

骨代谢状态可反映骨形成或骨吸收过程中的动态平衡，两者一旦失衡，骨微观结构将遭到破坏，骨量流失，骨脆性增加，引发OP。其中ALP作为骨形成标志物之一，与成骨细胞成熟及活性呈正相关；PINP由骨形成过程中的成骨细胞产生，可反映成骨细胞合成胶原的能力；OC作为骨基质矿化的必需物质，常用于反映骨形成情况；NTX作为反映骨吸收情况的敏感、特异指标，常用于评估破骨细胞骨吸收活性^［18］。研究发现，升高PINP、ALP含量，促进OC分化，可减缓骨丢失，促进骨形成，从而延缓OP的发展^［19］。本研究结果显示，益母草碱可上调ALP、PINP、OC水平，下调NTX水平，促进骨形成，改善大鼠OP。

成骨细胞与破骨细胞形成与功能平衡是构建骨平衡的关键，而骨质疏松则是两者失衡引起的主要疾病之一，促进成骨分化及骨形成对于OP的治疗至关重要^［20-21］。BMP2可促进BMSCs成骨分化，促进骨形成。Runx2作为转录因子RUNX家族的一员，可调节骨钙蛋白等相关成骨蛋白表达，其可受BMP2信号的调控促进成骨分化；而Osterix则直接促进成骨前体细胞转化成成骨细胞^［22-23］。研究发现，上调BMP2、Runx2、Osterix表达可促进BMSCs成骨分化，促进骨质疏松小鼠异位成骨^［24］。上调ALP、BMP2、Runx2表达可改善大鼠骨代谢失衡，提高骨形成相关因子水平，从而改善骨吸收与骨形成失衡状态，改善OP^［25］。本研究结果显示，益母草碱可上调BMP2、Runx2、Osterix的表达，促进OP大鼠骨形成。

SDF-1/CXCR4信号通路参与多种器官生理病理过程，包括细胞分化，SDF-1又称CXCL12，其可与其受体CXCR4结合促进成骨细胞分化。研究发现，激活SDF-1/CXCR4通路可增强骨髓间充质干细胞成骨分化，加速骨质疏松骨折大鼠的骨折愈合，促进骨形成^［26-27］。激活SDF-1/CXCR4通路可抑制OP大鼠BMD下降，减轻股骨组织病变，改善大鼠OP^［12］。本研究结果显示，益母草碱可上调SDF-1、CXCR4表达，从而改善大鼠OP，推测其可能通过激活SDF-1/CXCR4通路改善大鼠OP。另外用AMD3100处理发现其可部分逆转益母草碱对OP大鼠的改善作用，表明益母草碱可通过激活SDF-1/CXCR4通路改善大鼠OP。

综上所述，益母草碱可改善大鼠OP，其机制与激活SDF-1/CXCR4通路相关。本研究存在一定局限性，益母草碱对OP的作用机制尚不明确，且本研究的样本量较小、实验不全面，仍需进一步实验以验证本研究的结果。

参考文献

[1] SHEN Y， HUANG X， WU J，et al.The global burden of osteoporosis，low bone mass，and its related fracture in 204 countries and territories，1990-2019［J］.Front Endocrinol，2022，13：882241．

[2] WANG L， YU W， YIN X，et al.Prevalence of osteoporosis and fracture in China：The China osteoporosis prevalence study［J］. JAMA Netw Open，2021，4（8）：e2121106．

[3] KHANDELWAL S， LANE N E.Osteoporosis：Review of etiology，mechanisms，and approach to management in the aging population［J］.Endocrinol Metab Clin North Am，2023，52（2）：259-275．

[4] 《中成药治疗优势病种临床应用指南》标准化项目组.中成药治疗骨质疏松症临床应用指南（2021年）［J］.中国中西医结合杂志，2022，42（4）：393-404．

[5] Standardization Project Team for the Clinical Application Guidelines of Chinese Patent Medicines for Major Diseases.Clinical application guidance for treating osteoporosis by Chinese patent medicine（2021）［J］.Chinese Journal of Integrated Traditional and Western Medicine，2022，42（4）：393-404．

[6] AIBAR-ALMAZÁN A， VOLTES-MARTÍNEZ A， CASTELLOTE-CABALLERO Y，et al. Current status of the diagnosis and management of osteoporosis［J］. Int J Mol Sci，2022，23（16）：9465．

[7] CHOI D， CHOI S， CHANG J，et al.Exposure to oral bisphosphonates and risk of gastrointestinal cancer［J］.Osteoporos Int，2020，31（4）：775-782．

[8] ZHAO B， PENG Q， WANG D，et al.Leonurine protects bone mesenchymal stem cells from oxidative stress by activating mitophagy through PI3K/Akt/mTOR pathway［J］. Cells，2022，11（11）：1724．

[9] XIONG W， GUO X， CAI X.SDF-1/CXCR4 axis promotes osteogenic differentiation of BMSCs through the JAK2/STAT3 pathway［J］.Folia Histochem Cytobiol，2021，59（3）：187-194．

[10] 李雷，王峰，刘念，等.蛇床子素对绝经后骨质疏松症大鼠骨代谢的调节作用及机制［J］.中国骨质疏松杂志，2022，28（2）：224-229．

[11] LI Lei， WANG Feng， LIU Nian，et al.Regulation effect and mechanism of osthole on bone metabolism in rats with postmenopausal osteoporosis［J］.Chinese Journal of Osteoporosis，2022，28（2）：224-229．

[12] 王健，张驰.基于Wnt/β-连环素通路探讨补骨脂素对骨质疏松症大鼠的影响［J］.世界中医药，2022，17（12）：1697-1702．

[13] WANG Jian， ZHANG Chi.Effect of psoralen on osteoporosis in ovariectomized rats：Based on Wnt/β-catenin signaling pathway［J］.World Chinese Medicine，2022，17（12）：1697-1702．

[14] 赵曼云，郭蔚虹，张霞.益母草碱通过调节cAMP/PKA信号通路抑制脊髓损伤大鼠神经细胞凋亡［J］.中成药，2022，44（7）：2315-2319．

[15] ZHAO Manyun， GUO Weihong， ZHANG Xia ．Leonurine inhibits neuronal apoptosis in rats with spinal cord injury by regulating cAMP/PKA signaling pathway［J］. Chinese Traditional Patent Medicine，2022，44（7）：2315-2319．

[16] 朴海旺，金宝城，赵胜军.五味子甲素对去卵巢骨质疏松大鼠SDF-1/CXCR4信号通路的影响［J］.中国骨质疏松杂志，2023，29（9）：1292-1297．

[17] PU Haiwang， JIN Baocheng， ZHAO Shengjun.The effects of Schisandra chinensis A on SDF-1/CXCR4 signaling pathway in ovariectomized osteoporosis rats［J］．Chinese Journal of Osteoporosis，2023，29（9）：1292-1297．

[18] HE J， ZHAO D， PENG B，et al. A novel mechanism of Vildagliptin in regulating bone metabolism and mitigating osteoporosis［J］. Int Immunopharmacol，2024，130：111671．

[19] ZHAO B， PENG Q， POON E H L，et al.Leonurine promotes the osteoblast differentiation of rat BMSCs by activation of autophagy via the PI3K/Akt/mTOR pathway［J］. Front Bioeng Biotechnol，2021，9：615191．

[20] MA X N， FENG W， LI N，et al.Leonurine alleviates rheumatoid arthritis by regulating the Hippo signaling pathway［J］. Phytomedicine，2024，123：155243．

[21] OEFNER C， RIEMER E， FUNKE K，et al ．Determination of anisotropic elastic parameters from morphological parameters of cancellous bone for osteoporotic lumbar spine［J］. Med Biol Eng Comput，2022，60（1）：263-278．

[22] 王海生，马涛，张敏，等.麦角甾苷治疗对去卵巢大鼠骨质疏松症保护机制研究［J］.中国骨质疏松杂志，2022，28（3）：341-346．

[23] WANG Haisheng， MA Tao， ZHANG Min，et al ．Protective mechanism of ergosteroid glycoside treatment for osteoporosis in ovariectomized rats［J］. Chinese Journal of Osteoporosis，2022，28（3）：341-346．

[24] 张萌萌，张岩，吴涤，等.骨代谢生化指标实验推荐方案［J］.中国骨质疏松杂志，2021，27（10）：1405-1412，1549．

[25] ZHANG Mengmeng， ZHANG Yan， WU Di，et al ．Recommended protocol for bone metabolism biochemical index experiment［J］.Chinese Journal of Osteoporosis，2021，27（10）：1405-1412，1549．

[26] WANG C， CHEN R， ZHU X，et al.DOT1L decelerates the development of osteoporosis by inhibiting SRSF1 transcriptional activity via microRNA-181-mediated KAT2B inhibition［J］. Genomics，2024，116（1）：110759．

[27] YOSHIDA G， KAWABATA T， TAKAMATSU H，et al.Degradation of the NOTCH intracellular domain by elevated autophagy in osteoblasts promotes osteoblast differentiation and alleviates osteoporosis［J］. Autophagy，2022，18（10）：2323-2332．

[28] OUYANG X， LI S， DING Y，et al. Foxf1 gene increases the risk of osteoporosis in rats by inhibiting osteoblast formation and promoting osteoclast differentiation through the upregulation of NF-κB pathway［J］. J Musculoskelet Neuronal Interact，2022，22（2）：242-250．

[29] YUE B， ZHANG W， LI M，et al.WTAP increases BMP2 expression to promote osteoblast differentiation and inhibit osteoblast senescence via m（6）a methylation of Sp1［J］. Mol Genet Genomics，2024，299（1）：109．

[30] LEE S H， KIM M， JUNG K I，et al.Ishophloroglucin a isolated from Ishige okamurae stimulates osteoblast differentiation through activation of the bone morphogenetic protein and Wnt/β-catenin signaling pathways in MC3T3-E1 cells［J］. Cell Biol Int，2025，49（8）：965-974．

[31] LI X， ZHOU X， HUANG Z，et al.Study on the mechanism of naringin in promoting bone differentiation：In vitro and in vivo study［J］.Heliyon，2024，10（2）：e24906．

[32] 苏辉，闫炳翰，王若冲，等.补肾壮骨方干预去卵巢骨质疏松模型大鼠骨代谢及骨密度的变化［J］.中国组织工程研究，2023，27（28）：4507-4512．

[33] SU Hui， YAN Binghan， WANG Ruochong，et al.Effect of Bushen Zhuanggu Fang on bone metabolism and bone mineral density in rats with ovariectomized osteoporosis［J］.Chinese Journal of Tissue Engineering Research，2023，27（28）：4507-4512．

[34] CHENG G， WANG X， ZHANG F，et al.Reparative homing of bone mesenchymal stem cells induced by iMSCs via the SDF-1/CXCR4 axis for articular cartilage defect restoration［J］. Biomed Pharmacother，2024，181：117649．

[35] WANG Y， PAN Z， WANG Q，et al.Sequential SDF-1/CGRP-releasing smart composite hydrogel promotes osteoporotic fracture healing by targeting sensory nerve-regulated bone remodeling［J］.Mater Today Bio，2025，32：101750．