基于Notch/核因子- κ B信号通路探讨罗哌卡因神经阻滞对股骨骨折大鼠骨折愈合的影响

Effect of ropivacaine nerve block on fracture healing in rats with femoral fracture based on Notch/nuclear factor- κ B signaling pathway

摘要

目的 基于Notch/核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信号通路，探讨罗哌卡因神经阻滞对股骨骨折大鼠骨折愈合进程的影响及潜在的作用机制。 方法 选取40只无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级雄性Wistar大鼠，随机分为对照组（n=10，腹腔注射生理盐水）与造模组（n=30）；造模组构建股骨骨折模型，最终建模成功29只，进一步分为模型组（n=10，腹腔注射生理盐水）、罗哌卡因组（n=10，给予罗哌卡因神经阻滞干预）、罗哌卡因+抑制剂组（n=9，给予罗哌卡因神经阻滞联合Notch通路抑制剂干预）。干预结束后，检测各组大鼠的X线骨痂评分、股骨不同节段骨密度［中1/3段骨密度（middle femur bone mineral density，mBMD）、股骨全长骨密度（total femur bone mineral density，tBMD）、远1/3段骨密度（distal femur bone mineral density，dBMD）］、疼痛行为学指标［热缩足潜伏期（thermal withdrawal latency，TWL）、机械刺激缩足反射阈值（mechanical withdrawal threshold，MWT）］，同时检测血清碱性成纤维细胞生长因子（basic fibro-blast growth factor，bFGF）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）水平，以及骨折部位组织中Notch、NF-κB的mRNA和蛋白相对表达量。 结果 与对照组比较，模型组、罗哌卡因组、罗哌卡因+抑制剂组的mBMD、tBMD、TWL、MWT、血清bFGF及VEGF水平、骨折组织Notch mRNA和蛋白相对表达量均显著降低，NF-κB mRNA及蛋白相对表达量均显著升高（P<0.05）；与模型组比较，罗哌卡因组、罗哌卡因+抑制剂组的X线骨痂评分，mBMD、tBMD、dBMD、TWL、MWT、bFGF、VEGF水平，Notch mRNA及蛋白相对表达量均显著升高，NF-κB mRNA及蛋白相对表达量均显著降低（P<0.05）；与罗哌卡因组比较，罗哌卡因+抑制剂组的X线骨痂评分，mBMD、tBMD、dBMD、TWL、MWT、bFGF、VEGF水平，Notch mRNA及蛋白相对表达量显著降低，NF-κB mRNA及蛋白相对表达量显著升高（P<0.05）。 结论 罗哌卡因神经阻滞可有效提升股骨骨折大鼠的骨密度，减轻疼痛程度，上调生长因子表达，进而促进骨折愈合，其作用机制可能与调控Notch/NF-κB信号通路相关。

Abstract

Objective To explore the effects of ropivacaine nerve block on the fracture healing process in rats with femoral fractures and its potential mechanism of action based on the Notch/nuclear factor-κB （NF-κB） signaling pathway. Methods 40 male Wistar rats of specific pathogen free （SPF） grade were selected. They were randomly divided into a control group （n=10， receiving intraperitoneal injection of saline） and a model group （n=30）. After the intervention， X-ray callus scores， bone mineral density of different segments of the femur ［middle femur bone mineral density （mBMD）， total femur bone mineral density （tBMD）， and distal femur bone mineral density （dBMD）］， and pain behavioral indicators ［thermal withdrawal latency （TWL） and mechanical withdrawal threshold （MWT）］ were measured in each group of rats. The levels of serum basic fibroblast growth factor （bFGF） and vascular endothelial growth factor （VEGF）， as well as the relative mRNA and protein expression levels of Notch and NF-κB in the tissues of the fracture site were measured. Results Compared with the control group， the model group， ropivacaine group， and ropivacaine + inhibitor group exhibited significantly reduced mBMD， tBMD， TWL， MWT， serum levels of bFGF and VEGF， and relative expression levels of Notch mRNA and protein in fractured tissues， while the relative expression levels of NF-κB mRNA and protein were significantly increased （P<0.05）. Compared with the model group， the ropivacaine group and ropivacaine + inhibitor group exhibited significantly increased X-ray callus scores， mBMD， tBMD， dBMD， TWL， MWT， levels of bFGF and VEGF， and relative expression levels of Notch mRNA and protein， while the relative expression levels of NF-κB mRNA and protein were significantly decreased （P<0.05）. Compared with the ropivacaine group， the ropivacaine + inhibitor group exhibited significantly reduced X-ray callus scores， mBMD， tBMD， dBMD， TWL， MWT， levels of bFGF and VEGF， as well as relative expression levels of Notch mRNA and protein. Conversely， there was a significant increase in the relative expression levels of NF-κB mRNA and protein （P<0.05）. Conclusion Ropivacaine nerve block can effectively increase bone density in rats with femoral fractures， reduce pain levels， upregulate the expression of growth factors， and thereby promote fracture healing. Its mechanism of action may be related to the regulation of the Notch/NF-κB signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

罗哌卡因 / 神经阻滞 / 股骨骨折 / Notch/核因子-κB信号通路 / 骨折愈合

Key words

ropivacaine / nerve block / femoral fracture / Notch/nuclear factor-κB signaling pathway / fracture healing

股骨骨折是由重物直接撞击、高处坠落、车轮碾压等外力因素引发的在骨科常见的创伤性疾病，临床典型表现为患肢畸形、异常活动、骨摩擦音及剧烈疼痛等，严重者可因愈合不良或功能障碍导致终身残疾^［1-2］。多数股骨骨折患者经及时规范治疗可实现骨性愈合，但仍有部分患者因病情较严重、骨代谢异常等因素，出现骨不连、骨缺损等并发症，严重影响患者的预后康复进程^［3-4］。骨折愈合是一个缓慢且复杂的病理生理过程，涉及生物化学调控、骨代谢平衡、炎性因子分泌、凝血功能激活等多个环节，且需要多种细胞因子参与。

罗哌卡因作为一种长效酰胺类局部麻醉药，具有作用时效长、中枢神经及心血管毒性低、镇痛效果良好等优点，目前已广泛应用于妇产科、外科的术后镇痛及神经阻滞治疗^［5］。Notch/核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信号通路是调控机体生理病理过程的关键通路之一，可参与骨折愈合进程中的炎症反应、血肿形成、骨组织形成、血管新生、神经再生及骨重建等多个核心环节，但关于该通路在骨折愈合中作用机制的系统性研究仍较为匮乏^［6］。基于此，本研究通过构建大鼠股骨骨折模型，探讨罗哌卡因神经阻滞对骨折愈合的影响，并从Notch/NF-κB信号通路调控角度阐释其潜在作用机制，以期为临床优化股骨骨折治疗方案提供实验依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Mobilett Elara Max型X线机（西门子医疗系统有限公司）；DXA-800E型双能X线骨密度测量仪［品源医疗（江苏）有限公司］；Axioscope 5型实验室显微镜（德国卡尔·蔡司公司）；COD型恒温热刺激仪（青岛佳鼎分析仪器有限公司）。

1.2 试药

戊巴比妥钠（批号20240115A，美国Sigma-Aldrich公司）；青霉素（批号20240322，华北制药华日药业有限公司）；罗哌卡因（批号20240510，河北一品制药股份有限公司）；Notch抑制剂（批号20241208D，美国Cayman Chemical公司）；Notch一抗（批号20241120N，美国Cell Signaling Technology公司）； NF-κB一抗（批号20240905F）、二抗（批号20241030S），均购自英国Abcam公司；增强型化学发光（enhanced chemiluminescence，ECL）试剂（批号20240718E，美国Thermo Fisher公司）。

1.3 实验动物

40只无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级雄性Wistar大鼠，购自维塔探索（广东）科技有限公司，体质量为190~220 g。所有大鼠均在无病原菌笼子中适应性喂养7 d。

2 方法

2.1 分组与给药

大鼠适应性喂养7 d后，选取40只作为研究对象，其中10只设为对照组，其余30只参照曾昭池等^［7］的研究方法构建股骨骨折大鼠模型。建模步骤如下：大鼠取仰卧位，腹腔注射体积分数3%戊巴比妥钠麻醉后，对右侧股部进行脱毛、消毒，于髌骨内侧及股外侧做长约2.5 mm切口，置入1 mm克氏针行髓内固定，使用骨折钳剪断股骨干中段，生理盐水冲洗切口后逐层缝合。对照组仅做相同切口及消毒处理，不剪断股骨。术后通过X线检查确认右股骨骨折、髓内针固定在位即为建模成功，最终29只大鼠建模成功。采用随机序列法对29只建模成功大鼠进行分组，分为模型组（n=10）、罗哌卡因组（n=10）、罗哌卡因+抑制剂组（n=9）。所有大鼠术后均肌肉注射50 mg·kg^－1青霉素预防感染，并每日对切口进行消毒。

建模成功后第2天开始进行干预，连续干预7 d。罗哌卡因组给予1.5 μg·kg^-1罗哌卡因行坐骨神经阻滞注射；罗哌卡因+抑制剂组在罗哌卡因干预的基础上，额外给予Notch抑制剂60 mg·kg^-1腹腔注射；对照组、模型组给予0.5 mL生理盐水腹腔注射。

2.2 主要结局指标

2.2.1 X线骨痂评分

分别于术后1、2、4周，采用X线机对各组大鼠右侧股骨进行拍片检查，参照以下标准进行骨痂评分。0分：骨折端无骨痂形成；1分：骨折端可见少量骨痂，断端边缘模糊；2分：骨折缺损部位骨痂量显著增加，断端间隙缩小；3分：骨痂填满骨折部位，断端边缘完全消失，骨折线基本模糊。

2.2.2 骨密度

干预4周后，采用双能X线骨密度测量仪检测各组大鼠股骨中1/3段骨密度（middle femur bone mineral density，mBMD）、全长骨密度（total femur bone mineral density，tBMD）及远1/3段骨密度（distal femur bone mineral density，dBMD），操作严格遵循仪器说明书。

2.2.3 Notch、NF-κB mRNA表达量

干预4周后处死大鼠，取骨折部位股骨组织，采用实时荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）检测Notch、NF-κB mRNA表达量。具体步骤为提取组织总RNA，逆转录为互补脱氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid，cDNA），采用Primer 5.0软件设计引物序列，启动PCR扩增；通过2^-△△Ct法计算Notch、NF-κB mRNA的相对表达量，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）为内参基因。

2.2.4 Notch、NF-κB蛋白相对表达量

干预4周后处死大鼠，采用蛋白质印迹法（Western blotting）检测Notch、NF-κB相对表达量。取骨折部位股骨组织，置于液氮中研磨后离心提取上清液，采用二喹啉甲酸法测定蛋白浓度；将蛋白样品与上样缓冲液按1∶2的比例进行混合，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PDGE）分离后，电转至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上；5%脱脂牛奶室温封闭2 h，加入Notch、NF-κB一抗（1∶1 000），4 ℃孵育过夜，洗涤后加入对应二抗（1∶1 000），室温孵育90 min；再次洗涤后，采用ECL试剂显影，以GAPDH为内参，通过Image J软件分析条带灰度值，计算目标蛋白的相对表达量。

2.3 次要结局指标

2.3.1 病理学观察

干预4周后，麻醉后处死大鼠，取骨折部位股骨组织，经固定、脱钙、脱水、石蜡包埋后，制成5 μm连续切片，行苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色。再次脱水透明、中性树胶封片后，置于光学显微镜下观察股骨组织的病理形态变化。

2.3.2 疼痛行为学评估

干预4周后，处死大鼠前进行疼痛行为学检测，包括热缩足潜伏期（thermal withdrawal latency，TWL）、机械刺激缩足反射阈值（mechanical withdrawal threshold，MWT）。①TWL检测：将大鼠置于玻璃箱中，用恒温热刺激仪照射大鼠足底，记录从照射开始至大鼠出现抬腿、回避、缩足反应的时间，即为TWL，重复3次取平均值，两次检测间隔≥5 min，避免灼伤大鼠足底。②MWT检测：将大鼠置于配备玻璃罩的金属网格中，适应15 min后，用不同力度纤维丝垂直刺激大鼠足底，以大鼠出现缩足、抬腿反应为阳性，间隔5 min刺激1次，重复3次，取平均值作为MWT。

2.3.3 生长因子水平检测

于干预4周、处死大鼠前，采集大鼠尾静脉血3 mL，于4 ℃条件下以3 000 r·min^-1离心15 min，采用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测血清碱性成纤维细胞生长因子（basic fibro-blast growth factor，bFGF）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）水平，操作严格按照试剂盒说明书进行。

2.4 统计学方法

采用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析。计量资料用（\overline{x}\pm s）表示，多组间不同时间点计量资料的比较采用重复测量方差分析，比较组间、时间及交互效应，两两比较采用Bonferroni法；多组间同一时间点计量资料的比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 X线骨痂评分的比较

与模型组比较，罗哌卡因组、罗哌卡因+抑制剂组X线骨痂评分均显著升高（P<0.05）；与罗哌卡因组比较，罗哌卡因+抑制剂组的X线骨痂评分显著降低（P<0.05）。随着时间延长，各组大鼠的骨痂评分均呈上升趋势。见表1。

3.2 骨密度的比较

与对照组比较，模型组、罗哌卡因组、罗哌卡因+抑制剂组的mBMD、tBMD、dBMD水平均显著降低（P<0.05）；与模型组比较，罗哌卡因组、罗哌卡因+抑制剂组的mBMD、tBMD、dBMD水平均显著升高（P<0.05）；与罗哌卡因组比较，罗哌卡因+抑制剂组的mBMD、tBMD、dBMD水平均显著降低（P<0.05）。见表2。

3.3 Notch、NF-κB mRNA表达量的比较

与对照组比较，模型组、罗哌卡因组、罗哌卡因+抑制剂组的Notch mRNA表达量均显著降低，NF-κB mRNA表达量均显著升高（P<0.05）；与模型组比较，罗哌卡因组、罗哌卡因+抑制剂组Notch mRNA表达量均显著升高，NF-κB mRNA表达量均显著降低（P<0.05）；与罗哌卡因组比较，罗哌卡因+抑制剂组Notch mRNA的表达量显著降低，NF-κB mRNA的表达量显著升高（P<0.05）。见表3。

3.4 Notch/NF-κB信号通路相关蛋白相对表达量的比较

与对照组比较，模型组、罗哌卡因组、罗哌卡因+抑制剂组的Notch蛋白相对表达量均显著降低，NF-κB蛋白相对表达量均显著升高（P<0.05）；与模型组比较，罗哌卡因组、罗哌卡因+抑制剂组的Notch蛋白相对表达量均显著升高，NF-κB蛋白相对表达量均显著降低（P<0.05）；与罗哌卡因组比较，罗哌卡因+抑制剂组的Notch蛋白相对表达量显著降低，NF-κB蛋白相对表达量显著升高（P<0.05）。见表4、图1。

3.5 股骨组织HE染色结果的比较

HE染色结果显示，对照组骨痂区成纤维细胞丰富，无炎性细胞浸润，骨小梁排列虽不规则但结构完整；模型组骨痂区可见大量炎性细胞浸润，无明显骨小梁结构形成，仅存在增生肉芽组织，修复效果差；罗哌卡因组骨痂区炎性细胞基本消退，骨小梁数量显著增多，排列趋于规整，修复状态良好；罗哌卡因+抑制剂组较模型组炎性细胞浸润有所减少，但成骨细胞数量较少，骨小梁形成不足。见图2。

3.6 疼痛行为学的比较

与对照组比较，模型组、罗哌卡因组、罗哌卡因+抑制剂组的TWL、MWT水平均显著降低（P<0.05）；与模型组比较，罗哌卡因组、罗哌卡因+抑制剂组的TWL、MWT水平均显著升高（P<0.05）；与罗哌卡因组比较，罗哌卡因+抑制剂组的TWL、MWT水平均显著降低（P<0.05）。见表5。

3.7 生长因子的比较

与对照组比较，模型组、罗哌卡因组、罗哌卡因+抑制剂组的bFGF、VEGF水平均显著降低（P<0.05）；与模型组比较，罗哌卡因组、罗哌卡因+抑制剂组的bFGF、VEGF水平均显著升高（P<0.05）；与罗哌卡因组比较，罗哌卡因+抑制剂组的bFGF、VEGF水平均显著降低（P<0.05）。见表6。

4 讨论

随着交通运输业的快速发展及社会老龄化加剧，股骨骨折的发病率呈逐年上升趋势，其作为骨科常见的创伤性疾病，不仅对患者生命安全构成威胁，还因恢复周期长、愈合并发症多等问题，严重影响患者的生活质量^［8-10］。目前临床多采用内固定联合外固定的治疗方案以缩短骨折愈合时间，但仍有部分患者因病情复杂、骨代谢异常等因素出现骨折延迟愈合或不愈合，因此，探寻安全有效的干预手段以优化骨折愈合进程，具有重要的临床意义。

本研究结果显示，罗哌卡因神经阻滞干预可显著提升股骨骨折大鼠的X线骨痂评分及mBMD、tBMD、dBMD水平，表明罗哌卡因可有效加速骨痂形成，促进股骨骨折愈合。这一结论与现有研究结论一致，罗哌卡因作为一种长效局部麻醉药，具有良好的运动-感觉分离特性、阻滞时效长及毒性低等优点，对消化、泌尿、神经等系统损害较小^［11］。其不仅可通过发挥抗焦虑、抗炎、镇静作用来减轻机体应激反应，还能促进VEGF释放，为骨折愈合提供有利条件^［12］。

骨折发生后，局部组织损伤引发的炎性反应是影响骨愈合的重要因素之一，研究表明，骨折可诱导NF-κB、肿瘤坏死因子、超敏C反应蛋白等炎性因子大量释放，进而诱发机体疼痛，干扰骨愈合进程^［13-15］。TWL和MWT是评估动物疼痛程度的核心指标，其水平越高表示机体疼痛耐受能力越强，且与骨外周神经激活、骨神经信号传导密切相关。骨愈合可分为血肿机化、骨痂形成、骨痂塑形3个阶段，而新生血管形成可为骨折端输送营养物质与氧气，是保障骨折部位结构和功能恢复的重要基础。bFGF、VEGF广泛分布于肾、骨骼、脑、肝、肺等组织，可通过诱导胶原酶、纤溶酶原激活物分泌，加速新毛细血管生成及骨折处骨髓间充质干细胞迁移，进而促进骨愈合^［16-18］。本研究结果显示，罗哌卡因组的TWL、MWT、bFGF、VEGF水平均显著提升，表明罗哌卡因可抑制机体疼痛，上调生长因子分泌，为骨折愈合提供有利微环境。而罗哌卡因+抑制剂组的TWL、MWT、bFGF、VEGF水平均显著低于罗哌卡因组，表明罗哌卡因对骨者愈合的促进作用可能依赖于特定的信号通路。

Notch/NF-κB信号通路是调控骨折愈合的关键通路之一，其上下游分子可通过多个环节参与骨愈合进程。Notch信号可促进成骨细胞增殖分化以加速骨形成，同时抑制白细胞介素、趋化因子配体、肿瘤坏死因子等炎性因子释放，上调骨形态发生蛋白、转化生长因子β、VEGF的分泌，共同调控骨折愈合；NF-κB可参与细胞凋亡、炎症反应及免疫调节过程，过度激活会促进炎症介质释放及破骨细胞形成，抑制成骨功能；反之，阻断NF-κB激活可抑制炎症介质释放及破骨细胞形成，加速骨折愈合^［19-21］。本研究基于Notch/NF-κB通路探讨罗哌卡因神经阻滞对股骨骨折大鼠骨折愈合的影响，结果提供了直接证据：罗哌卡因干预后，骨折组织Notch mRNA及蛋白表达显著升高，而NF-κB表达同步降低，且该分子变化与骨密度提升、骨痂评分增加、疼痛减轻及血清VEGF、bFGF水平上调等促愈合效应一致。尤为关键的是，联合使用Notch抑制剂时，不仅逆转了Notch的上调，还导致NF-κB表达反弹及所有促愈合指标恶化。这证实罗哌卡因通过协同激活Notch信号与抑制NF-κB信号发挥治疗作用，其中Notch的激活可能对NF-κB通路产生负向调控，是打破骨折后炎症-骨破坏循环、启动成骨-修复程序的核心机制。

综上所述，股罗哌卡因神经阻滞可有效缓解股骨骨折大鼠的疼痛症状，上调bFGF、VEGF等生长因子分泌，提升骨密度，加速骨折愈合，其作用机制可能与调控Notch/NF-κB信号通路、维持通路平衡密切相关。

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基金资助

2024年度河北省医学科学研究课题(20240954)