冬凌草乙素调节Sirt1/FoxO1信号通路对2型糖尿病大鼠肾组织损伤的影响

Effect of ponicidin on renal tissue injury in type 2 diabetes mellitus rats by regulating Sirt1/FoxO1 signaling pathway

摘要

目的 探讨冬凌草乙素（ponicidin， PON）调节沉默信息调节因子2同系物1（silent information regulator 2 homologue 1，Sirt1）/叉头状转录因子O1（forkhead transcription factor O1， FoxO1）信号通路对2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus， T2DM）大鼠肾组织损伤的影响。 方法 构建T2DM大鼠模型，将建模成功的大鼠随机分为T2DM组，L-PON组、M-PON组、H-PON组（分别灌胃12.5、25、50 mg·kg^-1 PON）， PON+EX527组（灌胃50 mg·kg^-1 PON+腹腔注射5 mg·kg^-1 EX527），每组10只，另选10只正常饮食大鼠为对照组，T2DM组和对照组灌胃和注射等量生理盐水，每日1次，共处理6周。评估各组大鼠的肾功能；苏木精-伊红染色法（hematoxylineosin， HE）观察T2DM大鼠肾组织病理改变；末端标记法（terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end Labeling， TUNEL）检测大鼠肾小管上皮细胞凋亡；酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immuno sorbent assay， ELISA）检测T2DM大鼠肾脏组织中的炎症反应指标［转化生长因子-β（transforming growth factor-β， TGF-β）、白细胞介素-1β（interleukin-1β， IL-1β）］和氧化应激指标［超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）、丙二醛（malonaldehyde， MDA）］；蛋白质印迹（Western blotting）检测T2DM大鼠肾组织中Sirt1、FoxO1蛋白的表达水平。 结果 对照组的肾小球、肾小管结构及形态正常；T2DM组的肾小管上皮细胞肿胀，并呈空泡样变性，可见大量炎性细胞浸润；L-PON组、M-PON组、H-PON组的肾小管上皮细胞肿胀、空泡变性及间质炎性浸润依次改善；PON+EX527组的肾小管上皮细胞肿胀、空泡变性及间质炎性浸润进一步加重。T2DM组的肾质量指数、凋亡率、24 h尿蛋白、空腹血糖（fasting blood glucase，FBG）、血肌酐（serum creatinine，Scr）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、TGF-β、IL-1β、MDA、FoxO1表达水平均高于对照组，SOD、Sirt1表达水平均低于对照组（P<0.05）；L-PON组、M-PON组、H-PON组的肾质量指数、凋亡率、24 h尿蛋白、FBG、Scr、BUN、TGF-β、IL-1β、MDA、FoxO1表达水平均低于T2DM组， SOD、Sirt1表达水平均高于T2DM组（P<0.05）；PON+EX527组的肾质量指数、凋亡率、24 h尿蛋白、FBG、Scr、BUN、TGF-β、IL-1β、MDA、FoxO1表达水平均高于H-PON组， SOD、Sirt1表达水平均低于H-PON组（P<0.05）。 结论 PON可以缓解T2DM大鼠的肾脏组织损伤，该作用可能是通过调节Sirt1/FoxO1信号通路实现的。

Abstract

Objective To investigate the effect of ponicidin （PON） on renal tissue injury in type 2 diabetes mellitus rats by regulating the silent information regulator 2 homologue 1 （Sirt1）/forkhead transcription factor O1 （FoxO1） signaling pathway. Methods A T2DM rat model was established， and the successfully modeled rats were randomly assigned into T2DM group， L-PON， M-PON，and H-PON groups （gavage of 12.5， 25， and 50 mg·kg^-1 PON）， and PON+EX527 group （gavage of 50 mg·kg^-1 PON+intraperitoneal injection of 5 mg·kg^-1 EX527）， with 10 rats in each group. Another 10 rats with normal diet were selected as the control group. The T2DM group and the control group were gavaged and injected with equal amounts of physiological saline， once a day for 6 weeks. The renal function of rats in each group was evaluated. Hematoxylin-eosin（HE）staining was applied to observe the pathological changes of renal tissue in T2DM rats. The terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling （TUNEL） staining was applied to detect the apoptosis of rat renal tubular epithelial cells. Enzyme-linked immuno sorbent assay （ELISA）method was applied to detect the inflammatory response indicators ［transforming growth factor-β （TGF-β）and interleukin-1β （IL-1β）］ and oxidative stress indices ［superoxide dismutase （SOD） and malonaldehyde （MDA）］ in the renal tissue of T2DM rats. Western blotting was applied to detect the expression levels of Sirt1 and FoxO1 proteins in renal tissue of T2DM rats. Results The structure and morphology of glomeruli and renal tubules in the control group were normal； the renal tubular epithelial cells in the T2DM group were swollen and showed vacuolar degeneration， a large number of inflammatory cells were also observed； the swelling， vacuolar degeneration， and interstitial inflammatory infiltration of renal tubular epithelial cells in the L-PON， M-PON， and H-PON groups improved sequentially； the swelling， vacuolar degeneration， and interstitial inflammatory infiltration of renal tubular epithelial cells were further aggravated in the PON+EX527 group. The renal mass index， apoptosis rate， 24-hour urinary protein， fasting blood glucose （FBG）， serum creatinine （Scr）， blood urea nitrogen （BUN）， the expression levels of TGF-β， IL-1β， MDA， and FoxO1 in the T2DM group were higher than those in the control group， while the expression levels of SOD and Sirt1 were lower than those in the control group （P<0.05）. The renal mass index， apoptosis rate， 24-hour urinary protein， fasting blood glucose（FBG）， serum creatinine（Scr）， blood urea nitrogen（BUN）， the expression levels of TGF-β， IL-1β， MDA， and FoxO1 in the L-PON， M-PON， and H-PON groups were lower than those in the T2DM group， while the expression levels of SOD and Sirt1 were higher than those in the T2DM group （P<0.05）. The renal mass index， apoptosis rate， 24-hour urinary protein， FBG， Scr， BUN， the expression levels of TGF-β， IL-1β， MDA， and FoxO1 in the PON+EX527 group were higher than those in the H-PON group， while the expression levels of SOD and Sirt1 were lower than those in the H-PON group（P<0.05）. Conclusion PON can alleviate renal tissue injury in T2DM rats. This effect may be achieved by regulating the Sirt1/FoxO1 signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

冬凌草乙素 / 沉默信息调节因子2同系物1 / 叉头状转录因子O1 / 2型糖尿病 / 肾组织损伤

Key words

ponicidin / silent information regulator 2 homologue 1 / forkhead transcription factor O1 / type 2 diabetes mellitus / renal tissue injury

2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus， T2DM）是一种长期代谢性疾病，是全球面临的公共卫生挑战^［1］。T2DM与各种器官的长期损伤、功能障碍和衰竭密切相关，糖尿病肾病（diabetic nephropathy， DN）发生在25%~40%的T2DM患者中，约占全世界终末期肾脏疾病病例的50%，T2DM患者肾移植率为9%^［1-2］。持续高血糖是诱发DN的主要原因之一，最终可导致血管损伤、慢性炎症和肾脏损伤。此外，高水平的葡萄糖会损害细胞生长和生长因子活性，提高细胞外基质基因的表达水平，DN可导致体液潴留、电解质失衡和血管损伤等严重后果^［3］。而DN的发病机制尚未完全阐明，因此，探究由T2DM介导的肾组织损伤的分子机制寻找作用于其靶点的药物至关重要。沉默信息调节因子2同系物1（silent information regulator 2 homologue 1， Sirt1）是一种高度保守的NAD依赖性脱乙酰酶，在热量限制下被激活，并在多种组织中作为细胞传感器感知能量可用性，进而调节代谢，Sirt1也是叉头状转录因子O1（forkhead transcription factor O1， FoxO1）的重要调节因子，可以使FoxO1去乙酰化，减少氧自由基对肾脏的损害，在DN的进展中发挥重要作用^［4］。冬凌草乙素（ponicidin， PON）是一种来自冬凌草的正戊烷二萜，具有抗炎和抗肿瘤特性，相关研究发现，PON可以抑制由链脲佐菌素（streptozotocin， STZ）诱导的大鼠DN^［5］。然而， PON调节Sirt1/FoxO1信号通路对T2DM大鼠肾组织损伤的影响机制尚不清晰。因此，本研究探究PON对T2DM大鼠肾组织损伤的影响及其作用机制，以期为DN的治疗提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

ZY-680型全自动生化分析仪（上海科华生物工程股份有限公司）； LF500型倒置显微镜（广州市莱特光电技术有限公司）。

1.2 试药

PON（深圳子科生物科技有限公司）； Sirt1抑制剂EX527（北京安必奇生物科技有限公司）；苏木精-伊红染色法（hematoxylin-eosin， HE）染色试剂盒（上海博尔森生物科技有限公司）；末端标记法（terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling， TUNEL）细胞凋亡原位检测试剂盒（上海赫澎生物科技有限公司）；转化生长因子-β（transforming growth factor-β， TGF-β）、白细胞介素-1β（interleukin-1β， IL-1β）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malonaldehyde，MDA）酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immuno sorbent assay， ELISA）试剂盒，均购自上海瑶韵生物科技有限公司；BCA蛋白检测试剂盒（上海哈灵生物科技有限公司）；ECL化学发光检测试剂盒（上海贝博生物科技有限公司）；β-actin、Sirt1、FoxO1一抗及二抗HRP， 均购自英国Abcam公司。

1.3 实验动物

5~7周龄雄性SD大鼠，购自杭州万泰生物技术有限公司，生产许可编号：SYXK（浙）2022-0017，在12 h/12 h明暗循环和21 ℃恒温的房间里进行适应性饲养，自由获取食物和水。本实验经医院动物委员会审核、批准。

2 方法

2.1 动物建模、分组和给药

大鼠适应性喂养1周后，选择10只为对照组（正常饮食），剩余大鼠进高糖/高脂肪（high-sugar，high-fat，HSHF）饮食，连续处理8周，每周记录大鼠的食物摄入量和体质量，大鼠经8周HSHF饮食后腹腔注射STZ溶液35 mg·kg^-1，建立T2DM模型，注射后3 d监测空腹血糖（fasting blood-glucose， FBG）水平，FBG≥16.7 mmol·L^-1表明T2DM模型建立成功^［6］。

将建模成功的大鼠随机分为T2DM组，L-PON组、M-PON组、H-PON组（分别灌胃12.5、25.0、50.0 mg·kg^-1 PON^［5］），PON+EX527组（灌胃50 mg·kg^-1 PON+腹腔注射5 mg·kg^-1 Sirt1抑制剂EX527^［7］），每组10只，T2DM组和对照组灌胃和注射等量生理盐水，每日1次，共处理6周。

2.2 样本采集

治疗6周后，将动物单独放置在代谢笼中24 h，测量饮水量，并使用无菌容器收集尿液样本；记录尿液量，收集的样本在4 ℃条件下以2 000 r·min^-1离心10 min，将尿液样本置于试管中，保存于-20 °C条件下。大鼠采用斩首法处死，取血样，置于血清真空瓶中，以3 000 r·min^-1离心10 min，取血清，保存于-80 ℃。迅速切除肾脏，清除附着组织，称质量，并用冷盐水冲洗。将右肾快速冷冻于液氮中，保存于-80 ℃待分析，将左肾固定于体积分数10%中性缓冲福尔马林中用于组织病理学分析。

2.3 肾功能的评估

通过双肾质量与体质量的比值来评估肾质量指数；通过Bradford测定法定量24 h尿蛋白；使用血糖仪记录实验前后各组的FBG水平；采用全自动生化分析仪检测T2DM大鼠的血清肌酐（serum creatinine，Scr）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）。

2.4 HE观察T2DM大鼠肾组织的病理改变

取T2DM大鼠肾组织，用体积分数10%福尔马林固定，脱水后用石蜡包埋，使用自动切片机获得切片（5~7 µm），用二甲苯脱蜡，在乙醇梯度中复水化5 min，用蒸馏水冲洗，苏木精染色5~10 min，在体积分数1%醋酸中洗涤和分化30 s，用氨水染色1 min，用伊红溶液反染30 s后，用体积分数95%乙醇脱水2次，每次5 min，用二甲苯处理，中性树脂密封，于光镜下观察肾脏组织形态结构。

2.5 TUNEL检测大鼠肾小管上皮细胞的凋亡情况

肾组织切片后用二甲苯脱蜡2次（每次5 min），用梯度体积分数乙醇（100%、95%、80%、75%、50%）脱水，用蒸馏水冲洗，切片在蛋白酶K/10 mmol·L^-1 Tris溶液中于37 ℃条件下孵育15~30 min，每张切片涂上TUNEL检测液，在37 ℃的黑暗环境下孵育60 min，用PBS冲洗3次后，密封切片，在荧光显微镜下观察。

2.6 ELISA检测T2DM大鼠肾脏组织中炎症反应和氧化应激指标的表达水平

取肾脏组织制成匀浆，按照ELISA试剂盒说明书操作，检测组织中TGF-β、IL-1β、SOD、MDA的水平。

2.7 Western blotting检测T2DM大鼠肾组织中Sirt1、FoxO1蛋白的表达水平

加入RIPA裂解缓冲液和蛋白酶抑制剂对冷冻保存的肾脏组织进行匀浆。离心后收集蛋白质样品，在-80 °C下保存，用BCA蛋白检测试剂盒检测蛋白样品的浓度，将蛋白样品装入10%的SDS-PAGE凝胶中进行电泳，然后进行膜转移和阻断过程，膜与β-actin（1∶1 000）、Sirt1（1∶20 000）、FoxO1（1∶1 000）一抗在4 ℃下孵育过夜，加入二抗（1∶2 000）在室温下孵育1 h，使用ECL试剂盒，在成像系统中检测目标蛋白的表达水平，利用Image J软件计算灰度值。

2.8 统计学方法

采用SPSS 26.0软件对数据进行分析。符合正态分布的不同组别T2DM大鼠肾组织中Sirt1、FoxO1蛋白表达水平等计量资料以（\overline{x}\pm s）表示，多组间比较用单因素方差分析，SNK-q检验用于组间两两比较。P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 PON对T2DM大鼠肾功能的影响

T2DM组的肾质量指数、24 h尿蛋白、FBG、Scr、BUN均高于对照组（P<0.05）；L-PON组、M-PON组、H-PON组的肾质量指数、24 h尿蛋白、FBG、Scr、BUN均低于T2DM组（P<0.05）；PON+EX527组的肾质量指数、24 h尿蛋白、FBG、Scr、BUN均高于H-PON组（P<0.05）。见表1。

3.2 PON对T2DM大鼠肾组织病理改变的影响

对照组的肾小球、肾小管结构及形态正常；T2DM组出现肾小管上皮细胞肿胀及空泡样变性，肾小球肥大、基质增厚，肾间质可见大量炎性细胞浸润；L-PON组、M-PON组、H-PON组的肾小管上皮细胞肿胀、空泡变性及间质炎性浸润依次改善；PON+EX527组的肾小管上皮细胞肿胀、空泡变性及间质炎性浸润进一步加重。见图1。

3.3 PON对T2DM大鼠肾小管上皮细胞凋亡的影响

T2DM组的肾小管上皮细胞凋亡率高于对照组（P<0.05）；L-PON组、M-PON组、H-PON组的肾小管上皮细胞凋亡率均低于T2DM组（P<0.05）；PON+EX527组的肾小管上皮细胞凋亡率高于H-PON组（P<0.05）。见图2、表2。

3.4 PON对T2DM大鼠肾组织中TGF-β、IL-1β表达水平的影响

T2DM组的TGF-β、IL-1β表达水平均高于对照组（P<0.05）；L-PON组、M-PON组、H-PON组的TGF-β、IL-1β表达水平均低于T2DM组（P<0.05）；PON+EX527组的TGF-β、IL-1β表达水平均高于H-PON组（P<0.05）。见表3。

3.5 PON对T2DM大鼠肾组织中SOD、MDA表达水平的影响

T2DM组的MDA表达水平高于对照组，SOD表达水平低于对照组（P<0.05）；L-PON组、M-PON组、H-PON组的MDA表达水平均低于T2DM组，SOD表达水平均高于T2DM组（P<0.05）；PON+EX527组的MDA表达水平高于H-PON组，SOD表达水平低于T2DM组（P<0.05）。见表4。

3.6 PON对T2DM大鼠肾组织中Sirt1、FoxO1蛋白表达水平的影响

T2DM组的Sirt1蛋白表达水平低于对照组，FoxO1蛋白表达水平高于对照组（P<0.05）；L-PON组、M-PON组、H-PON组的Sirt1蛋白表达水平均高于T2DM组，FoxO1蛋白表达水平低于T2DM组（P<0.05）；PON+EX527组的Sirt1蛋白表达水平低于H-PON组，FoxO1蛋白表达水平高于H-PON组（P<0.05）。见图3、表5。

4 讨论

糖尿病是一种代谢性的、慢性的、进行性的、不可逆的疾病，自2000年以来，全球糖尿病患病率迅速上升^［8］。约90%的糖尿病病例为T2DM，其高血糖主要源于胰岛素抵抗和胰岛β细胞的胰岛素分泌缺陷，持续的高血糖使机体产生过多的自由基，导致氧化损伤，从而促进肾脏炎症和线粒体功能障碍的发生，胰岛素抵抗还会导致血脂异常，与肾功能进行性丧失相关^［9］。糖尿病引起的肾损伤会影响肾小球滤过屏障细胞，并因胶原蛋白和其他蛋白质的沉积而导致肾小球基底膜系膜增大和增厚，导致蛋白尿，伴随着肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensin system，RAS）的激活，肾小球毛细血管压力升高，肾小球滤过率降低，导致DN的发展^［10］。目前，RAS抑制剂通常用于DN的治疗，然而，在治疗过程中会发生醛固酮逸出，阻碍了RAS的效能，而抗糖尿病药物如胰高血糖素样肽-1受体激动剂也经常使用，但有一定的不良反应，以胃肠道反应较为常见^［11］。因此，重点关注T2DM导致的肾组织损伤过程中涉及的细胞和分子机制，寻找新的药物，对抑制T2DM的恶性进展至关重要。本研究结果显示，模型大鼠的肾质量指数、24 h尿蛋白、FBG、Scr、BUN均上升，炎症因子氧化应激反应加剧，肾小管上皮细胞凋亡加剧，肾小球、肾小管结构出现明显破坏，表明持续的高血糖会介导氧化损伤和肾脏炎症等过程，引起肾小管上皮细胞凋亡，肾小球、肾小管结构出现明显破坏，导致T2DM大鼠的肾组织损伤。

Sirt1通过使FoxO1去乙酰化来调节脂肪和葡萄糖的代谢，从而在细胞抗应激、能量代谢和肿瘤发生中发挥重要的调节作用，Sirt1是一种有效的保护因子，可以防止衰老相关的病理反应，如癌症、肝脏脂肪变性、神经变性、心血管疾病、糖尿病等^［12］。MAO Z等^［13］研究发现，运脾和络法通过上调糖尿病大鼠Sirt1的表达，下调FoxO1的表达，介导自噬通路来降低异位脂质沉积。XU Y等^［14］研究发现，黄芪多糖通过上调Sirt1，并抑制FoxO1表达，减少肾细胞凋亡并增强自噬从而减轻DN。赵士葳等^［15］研究发现，黄花倒水莲通过激活Sirt1/FoxO1通路，可改善DN大鼠的肾组织氧化应激。本研究发现，在T2DM大鼠模型中Sirt1表达水平降低，而FoxO1表达水平升高，表明Sirt1高表达、FoxO1低表达是导致T2DM大鼠发生肾组织损伤的重要原因。

冬凌草是一种药食同源的天然植物，常用作中草药，也可用作凉茶饮用。冬凌草具有清热解毒、活血止痛的功效，主要用于咽喉痛、扁桃体炎等炎症性疾病的治疗，其有效成分主要为二萜类，其中含量较高的是PON，PON在炎症和肿瘤的治疗中发挥重要作用^［16］。ZHAO C等^［17］研究发现，PON通过作用于FOXO4，降低MAGEB2的表达，从而抑制胆囊癌细胞的增殖和转移，在胆囊癌裸鼠模型中抑制肿瘤生长。WANG L等^［18］研究发现，PON通过抑制NF-κB信号通路诱导小鼠黑色素瘤凋亡，进而有效抑制小鼠异种移植瘤在体内的生长。ZHANG X等^［19］研究发现，PON可以在细胞和动物水平上通过抑制MAPK信号通路来缓解葡聚糖硫酸钠和脂多糖诱导的炎症。ZHANG X等^［20］研究发现，PON可抑制糖尿病大鼠的高血糖和食物摄入量，改善体质量和血浆胰岛素的水平，并抑制炎症反应、氧化应激，调节肠道微生物群，缓解糖尿病大鼠的认知障碍。本研究发现，PON可通过抑制T2DM大鼠的炎症反应、氧化应激、肾小管上皮细胞凋亡，缓解大鼠的肾脏组织损伤，而FoxO1抑制剂则逆转PON的作用，表明PON通过激活Sirt1，抑制FoxO1乙酰化，缓解T2DM大鼠肾脏组织损伤。

综上所述，PON可缓解T2DM大鼠肾脏组织损伤，该作用可能是通过调节Sirt1/FoxO1信号通路实现的。然而，本研究仅对Sirt1/FoxO1信号通路进行研究，后续会关注更多信号通路，深入研究PON的作用。

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基金资助

河南省中医药科学研究专项课题(20-21ZY2212)