不同氨基酸前体对紫花鄂北贝母培养物及其总生物碱含量的影响

Effects of different amino acid precursors on the growth and total alkaloid content of Fritillaria ebeiensis var. purpurea G. D. Yu et P. Li culture

摘要

目的 探讨在紫花鄂北贝母液体培养基中添加不同氨基酸前体对其培养物生长及总生物碱积累的影响，为优化紫花鄂北贝母悬浮细胞培养体系及提高有效成分产量提供实验依据。 方法 采用单因素实验考察色氨酸（tryptophan， Trp）、苯丙氨酸（phenylalanine，Phe）、酪氨酸（tyrosine，Tyr）单一添加时不同浓度对紫花鄂北贝母培养物增殖及总生物碱含量的影响；采用L₉（3³）三因素三水平正交实验探究3种不同氨基酸组合添加的最优配比；通过紫外-可见分光光度法测定培养物中总生物碱含量。 结果 单一添加条件下，0.6 mmol·L^-1 Trp对紫花鄂北贝母培养物生长的促进作用最显著，增殖倍数达2.14；0.4 mmol·L^-1 Trp和0.4 mmol·L^-1 Phe单独添加时，培养物总生物碱含量均达最大值1.00%。正交实验结果显示，氨基酸组合添加对总生物碱积累的影响主次顺序为Phe>Trp>Tyr，最优组合为0.6 mmol·L^-1 Phe+0.4 mmol·L^-1 Trp+0.4 mmol·L^-1 Tyr，总生物碱含量为0.95%；3种氨基酸对培养物增殖的影响差异无统计学意义（P>0.05）。 结论 添加Trp、Phe、Tyr均可显著提高紫花鄂北贝母培养物的总生物碱含量，其中Trp可促进培养物增殖，而Phe、Tyr单独添加对培养物增殖有一定抑制作用。

Abstract

Objective To explore the effects of adding different amino acid precursors to the liquid culture medium of Fritillaria ebeiensis var. purpurea G. D. Yu et P. Li on the growth of the culture and the accumulation of total alkaloids. It aims to provide experimental evidence for optimizing the suspension cell culture system of Fritillaria ebeiensis var. purpurea G. D. Yu et P. Li and increasing the yield of active components. Methods A single-factor experiment was conducted to investigate the effects of different concentrations of tryptophan （Trp）， phenylalanine （Phe）， and tyrosine （Tyr） added singly on the proliferation of the Fritillaria ebeiensis var. purpurea G. D. Yu et P. Li culture and the total alkaloid content； an L₉（3³） three-factor three-level orthogonal experiment was used to explore the optimal combination ratio of the 3 different amino acids； the total alkaloid content in the culture was determined by ultraviolet-visible spectrophotometry. Results Under the condition of single addition， 0.6 mmol·L^-1 Trp showed the most significant promoting effect on the growth of the Fritillaria ebeiensis var. purpurea G. D. Yu et P. Li culture and the proliferation rate reached 2.14； when 0.4 mmol·L^-1 Trp and 0.4 mmol·L^-1 Phe were added separately， the total alkaloid content of the culture reached the maximum value of 1.00%. The results of the orthogonal experiment showed that the influence of amino acid combinations on the accumulation of total alkaloids was in the order of Phe>Trp>Tyr， and the optimal combination was 0.6 mmol·L^-1 Phe + 0.4 mmol·L^-1 Trp + 0.4 mmol·L^-1 Tyr， the total alkaloid content was 0.95%； there was no statistically significant difference in the effects of the 3 amino acids on the proliferation of the culture （P>0.05）. Conclusion Adding Trp， Phe， and Tyr can significantly increase the total alkaloid content of the cultivated Fritillaria ebeiensis var. purpurea G. D. Yu et P. Li. Among them， Trp can promote the proliferation of the culture， while the addition of Phe and Tyr alone has a certain inhibitory effect on the proliferation of the culture.

关键词

紫花鄂北贝母 / 氨基酸前体 / 总生物碱 / 增殖倍数

Key words

Fritillaria ebeiensis var. purpurea G. D. Yu et P. Li / amino acid precursor / total alkaloid / proliferation multiple

贝母为临床常用传统名贵中药材，随着中医药产业的发展，其市场需求量逐年增加，野生资源因过度采挖日益匮乏，人工栽培品生长周期长、品质参差不齐，导致药材供需矛盾突出。紫花鄂北贝母Fritillaria ebeiensis var. purpurea G. D. Yu et P. Li为百合科贝母属鄂北贝母Fritillaria..ebeiensis G. D. Yu et G. Q. Ji的变种，主产于豫南地区，具有镇咳、祛痰、平喘的药理作用，其总生物碱含量高达1.46%，远高于其他贝母品种，且化学成分、药理药效与川贝母、浙贝母相近，是具有广阔开发前景的贝母药材新资源^［1-2］。

植物细胞悬浮培养技术是药用植物有效成分工业化生产的重要手段，而添加前体化合物是提高培养物次生代谢产物产量的常用策略。前体化合物可通过提高植物体内关键酶活性、补充次生代谢底物，促进反应向代谢产物生成方向进行。氨基酸作为植物新陈代谢的中间产物，不仅为植物细胞代谢提供碳源、氮源，参与蛋白质合成与植物生长，还可作为前体参与药用植物次生代谢过程，促进有效成分积累^［3］。本课题前期已成功诱导紫花鄂北贝母胚性愈伤组织，构建悬浮细胞系并初步优化培养条件，但有效成分产量尚未达到工业化生产要求。本研究在紫花鄂北贝母悬浮细胞培养动力学研究的基础上，通过添加不同种类、浓度的氨基酸前体，探究其对紫花鄂北贝母培养物增殖及总生物碱积累的影响，旨在为紫花鄂北贝母悬浮细胞系工业化生产总生物碱提供实验依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

JB-CJ-2FXS型超净工作台（苏州佳宝净化工程设备有限公司）；LDZX-50KBS型立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）；PHSJ-3F型pH计（上海精密科学仪器有限公司）；FA 2104型电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；BX7200LHP型超声波清洗机（上海新苗医疗器械制造有限公司）；GH28868型移液枪［赛默飞世尔科技（中国）有限公司］；6100PCS型紫外-可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）；R-1001N型旋转蒸发仪（郑州长城科工贸有限公司）；HH-2K4型二列四孔智能水浴锅（巩义市予华仪器有限责任公司）；SPH-211B型摇床（上海民仪电子有限公司）；紫外线杀菌车（天津市正大医疗护理设备厂）。

1.2 试药

萘乙酸（naphthalene acetic acid，NAA，天津光复精细化工研究所）；6-苄基腺嘌呤（6-benzylaminopurine，6-BA，上海蓝季科技发展有限公司）；苯丙氨酸（phenylalanine，Phe）、色氨酸（tryptophan，Trp）、酪氨酸（tyrosine，Tyr），均为分析纯，均购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司；贝母素乙对照品（批号10751-201110，质量分数为98.3%，中国药品生物制品检定所）；无水乙醇、邻苯二甲酸氢钾、溴百里酚蓝、甲醇、浓氨水、三氯甲烷、氢氧化钠，均为分析纯，均购自天津市江天化工技术股份有限公司；蒸馏水（天津中医药大学自制）；纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）。

1.3 样品来源

紫花鄂北贝母淡黄色疏松易分散的胚性愈伤组由本课题组前期培养获得并继代保存。

2 方法

2.1 紫花鄂北贝母悬浮细胞系的建立

取继代5次的紫花鄂北贝母胚性愈伤组织，镊子捏碎后过80目筛，按照40 g·L^-1的接种量接种于装有50 mL穆拉希吉和斯库格（Murashige and Skoog，MS）液体培养基250 mL的三角瓶中^［4］。培养条件：温度为（23±1） ℃，摇床转速为120 r·min^-1，pH 7.0，激素水平为1.0 mg·L^-1 NAA+0.2 mg·L^-1 6-BA，光照强度为2 000 lx（每日光照12 h），蔗糖质量浓度为30 g·L^-1，每8 d继代1次。继代时静置三角瓶3 min，弃去2/3原培养液，将剩余含细胞颗粒的培养液移至新三角瓶，补加新鲜MS液体培养基至50 mL，连续继代4~5次，获得生长状态稳定的紫花鄂北贝母悬浮细胞系。

2.2 氨基酸前体的添加

2.2.1 氨基酸前体单独添加

采用单因素水平实验方法，在悬浮细胞液培养至第9天（对数生长期），分别向培养基中加入Trp、Phe、Tyr，其中Trp设置0.2、0.4、0.6、0.8 mmol·L^-1 4个梯度浓度，Phe设置0.2、0.4、0.6、0.8 mmol·L^-1 4个梯度浓度，Tyr设置0.2、0.4、0.6 mmol·L^-1 3个梯度浓度；以不添加任何氨基酸为空白对照（control check，CK），每个浓度设置5个重复，继续培养至18 d后，过滤培养液收集培养物。

2.2.2 氨基酸前体组合添加

采用L₉（3³）三因素三水平正交实验设计，考察Phe（A）、Trp（B）、Tyr（C）组合添加对培养物的影响，因素与水平设置见表1。在悬浮细胞对数生长期（第9天）添加不同组合的氨基酸，以不添加氨基酸为CK，每个组合设置5个重复，培养18 d后过滤收集培养物。

2.3 培养物增殖倍数的计算

将培养18 d的紫花鄂北贝母培养物过滤取出，用滤纸拭干表面水分，精密称定鲜质量，并烘干至恒质量称定干质量，计算培养物增殖倍数。培养物增殖倍数=（培养后鲜质量－接种鲜质量）/接种时鲜质量。

2.4 总生物碱含量的测定

2.4.1 对照品储备液的制备

精密称取贝母乙素对照品6.0 mg，置于10 mL量瓶中，加三氯甲烷溶解并定容至刻度，摇匀，得质量浓度为0.60 mg·mL^-1的贝母乙素对照品储备液。

2.4.2 供试品溶液的制备

精密称取2.3项下紫花鄂北贝母培养物粉末0.2 g，置于具塞三角瓶中，加入0.6 mL浓氨水浸润1 h，加入16 mL三氯甲烷-甲醇（4∶1）混合溶液，80 ℃水浴回流2 h，静置冷却后滤过，滤液置于圆底烧瓶中，旋转蒸发仪蒸干，残渣加三氯甲烷溶解并转移至10 mL量瓶中，定容至刻度，摇匀，即得供试品溶液。

2.4.3 标准曲线的绘制

精密量取贝母乙素对照品储备液，稀释成系列质量浓度的对照品溶液，各取适量置于25 mL量瓶中，依次加入5 mL 0.2 mol·L^-1邻苯二甲酸氢钾溶液、2 mL体积分数0.03%溴百里酚蓝试液，加三氯甲烷定容至刻度，摇匀后转移至分液漏斗，静置45 min。取有机层，经干燥滤纸滤过，取续滤液；以相应试剂为空白，在412 nm波长处测定吸光度。以吸光度值为纵坐标（A），对照品质量浓度（mg·mL^-1）为横坐标（C），采用线性回归拟合标准曲线，得回归方程：A=20.283C+0.071 6 （R²=0.999 4），结果表明总生物碱在0.006 0~0.033 0 mg·mL^-1质量范围内线性关系良好。

2.4.4 方法学考察

2.4.4.1 精密度实验

精密量取同一对照品溶液适量，按照2.4.3项下方法连续测定6次吸光度，计算得RSD为0.082%（n=6），表明仪器的精密度良好。

2.4.4.2 稳定性实验

精取量取同一供试品溶液，按照2.4.3项下方法每隔0.5 h测定1次吸光度，共测定6次，计算得RSD为0.16%（n=6），表明供试品溶液在2.5 h内稳定性良好。

2.4.4.3 重复性实验

精密称取同一批培养物干燥粉末0.2 g，共6份，按照2.4.2项下方法制备供试品溶液，按照2.4.3项下方法测定吸光度。计算得RSD为1.21%（n=6），表明方法的重复性良好。

2.4.4.4 加样回收率实验

精密称取已知含量的培养物干燥粉末0.2 g，共6份，按照2.4.2项下方法制备供试品溶液，分别精密加入一定量的贝母素乙对照品溶液，按照2.4.3项下方法测定吸光度，并计算回收率，平均加样回收率为100.19%，RSD为1.17%（n=6），表明方法的准确度良好。

2.4.5 总生物碱含量的测定

精密称取各实验组培养物干燥粉末0.2 g，共5份，按照2.4.2项下方法制备供试品溶液，精密量取供试品溶液2.0 mL，按照2.4.3项下方法测定吸光度，根据标准曲线计算总生物碱含量。

2.5 统计学方法

采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。增殖倍数和总生物碱含量以（\overline{x}±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 Trp单独添加对培养物生长及总生物碱含量的影响

紫花鄂北贝母培养物增殖倍数随Trp浓度升高呈先降后升再降的趋势：与对照组比较，0.2、0.8 mmol·L^-1 Trp组增殖倍数均降低0.30倍；当Trp浓度为0.4、0.6 mmol·L^-1时，增殖倍数显著升高（P<0.05），为对照组的1.53、1.84倍，其中0.6 mmol·L^-1 Trp为促进培养物增殖的最优浓度，增殖倍数达2.14。总生物碱含量随Trp浓度变化呈单峰型，与对照组比较，各浓度组总生物碱含量均显著增加（P<0.05）。当Trp浓度为0.4 mmol·L^-1时，总生物碱含量达最大值1.00%，为对照组的1.64倍；当Trp浓度为0.8 mmol·L^-1时，总生物碱含量为0.89%，为对照组的1.51倍。见表2。

3.2 Phe对紫花鄂北贝母悬浮细胞颗粒生长及总生物碱含量的影响

增殖倍数呈先降后升再降的趋势，与对照组比较，增殖倍数均有所降低，当Phe浓度分别为0.2、0.6和0.8 mmol·L^-1时，增殖倍数均为最小（0.71），与对照组相比降低0.39倍，Phe抑制悬浮细胞颗粒生长。

总生物碱含量呈单峰型变化趋势，与对照组比较，总生物碱含量均显著增加（P<0.05）。Phe浓度为0.4 mmol·L^-1时，总生物碱含量最高为1.00%，为对照组的1.64倍；Phe浓度为0.8 mmol·L^-1时，总生物碱含量最高为0.98%，为对照组的1.61倍。见表3。

3.3 Tyr对紫花鄂北贝母悬浮细胞颗粒生长及总生物碱含量的影响

增殖倍数呈下降趋势，与对照组比较，增殖倍数均有所降低，在Tyr浓度为0.6 mmol·L^-1时，增殖倍数最小为0.63，比对照组降低0.46倍，Tyr抑制悬浮细胞颗粒生长。

总生物碱含量变化呈单峰型，与对照组比较，总生物碱含量均显著增加（P<0.05）。Tyr浓度为0.4 mmol·L^-1时，总生物碱含量最高为0.99%，为对照组的1.62倍；Tyr浓度为0.2 mmol·L^-1时，总生物碱含量为0.93%，为对照组的1.52倍。见表4。

3.4 氨基酸组合添加对紫花鄂北贝母悬浮细胞颗粒生长及总生物碱含量的影响

3.4.1 氨基酸组合添加对悬浮细胞颗粒生长的影响

氨基酸组合添加对紫花鄂北贝母悬浮细胞增殖未见显著性影响（P>0.05）。第8组（0.8 mmol·L^-1 Phe+0.6 mmol·L^-1 Trp+0.2 mmol·L^-1 Tyr）的增殖倍数最大（1.26），为对照组的1.09倍，对细胞增殖有促进作用。3个因素影响的主次顺序为Phe>Tyr>Trp。见表5。3个因素对紫花鄂北贝母悬浮细胞颗粒生长均无明显促进作用，差异无统计学意义（P>0.05），但由F值大小可得对悬浮细胞颗粒增殖倍数影响最大的为Phe，其次为Tyr、Trp。见表6。

3.4.2 氨基酸组合添加对总生物碱含量的影响

各氨基酸组合对总生物碱含量的影响，差异有统计学意义（P<0.01），第4组0.6 mmol·L^-1 Phe+0.4 mmol·L^-1 Trp+0.4 mmol·L^-1 Tyr）的总生物碱含量达最大值0.95%，为对照组的1.56倍，是组合添加的最优配比；第3组总生物碱含量最低（0.57%），略低于CK组，其余各组总生物碱含量在0.76%~0.88%之间。3个因素的影响主次顺序为Phe>Trp>Tyr。3个因素都对紫花鄂北贝母悬浮细胞颗粒总生物碱含量有显著影响，起主要作用的影响因素为Phe，其次为Trp、Tyr。见表7、表8。

4 讨论

植物的次生代谢过程复杂，生物合成途径中，终产物的产量受到底物的影响。前体物质也是生化反应的底物，添加前体物质可提高植物次级代谢产物的产量。氨基酸类物质除参与蛋白质合成外，还与能量和碳水化合物代谢、碳氮收支、激素和次生代谢、应激反应等密切相关^［5］。研究表明，Phe可有效促进黄芪多糖的合成^［6］。Phe可以提高黄芩悬浮细胞系黄芩苷的产量^［7］。Phe、Tyr以及Trp可以提高卷叶贝母的总生物碱含量^［3］，促进川贝母细胞增殖^［8］。

本研究结果显示，Trp浓度为0.6 mmol·L^-1时最有利于紫花鄂北贝母悬浮细胞颗粒的生长。这可能与其作为植物生长素吲哚-3-乙酸（3-indoleacetic acid，IAA）的直接前体有关，Trp可经多种生物合成途径以Trp为前体合成IAA，进而促进植物细胞分裂与生长，为次生代谢产物的合成提供物质基础。可见在植物细胞培养过程中，某种氨基酸不仅作为代谢前体参与产物合成，也可能通过信号转导或生长调节途径间接影响次生代谢的整体效率。3种氨基酸都对紫花鄂北贝母悬浮细胞颗粒总生物碱含量有显著影响，当Phe、Trp、Tyr浓度为0.6、0.4、0.4 mmol·L^-1时，总生物碱含量最高为0.95%，是对照组的1.56倍。可能由于植物体内生物碱类物质的生物合成途径主要为氨基酸途径，氨基酸作为生物碱合成的前体，可通过促进底物供应和关键酶的表达，推动合成反应^［9］。对总生物碱含量影响最大的为Phe，其次为Trp、Tyr，可能与其作为苯丙烷类途径的核心前体参与多种苯丙氨酸衍生的生物碱及其他次生代谢产物的合成有关。

本研究初步证实了Phe、Trp和Tyr作为前体能有效促进紫花鄂北贝母总生物碱的合成，揭示了其在细胞生长调控与代谢途径之间的协同关系。然而，氨基酸作为贝母属植物生物碱合成的前体物质是否具有普遍性以及作用机理尚不明确，有待进一步研究。

参考文献

[1] 余国奠，李萍，徐国钧，等.中药贝母类的研究——Ⅳ.湖北贝母属药用植物资源［J］.南京药学院学报，1985，16（3）：25-32．

[2] YU Guodian， LI Ping， XU Guojun，et al.Studies on the Chinese drug Beimu Ⅳ medicinal plant resources of Fritillaria from Hupei province［J］.Journal of China Pharmaceutical University，1985，16（3）：25-32．

[3] 刘群，肖波，李天祥，等.紫花鄂北贝母愈伤组织诱导及总生物碱的测定［J］.中草药，2015，46（12）：1836-1839．

[4] LIU Qun， XIAO Bo， LI Tianxiang，et al. Callus induction and determination of total alkaloid content from Fritillaria ebeiensis var．purpurea ［J］. Chinese Traditional and Herbal Drugs，2015，46（12）：1836-1839．

[5] 王跃华，朱丹青，代勇，等.不同氨基酸前体饲喂对卷叶贝母培养物中有效组分的影响［J］.安徽农业科学，2011，39（24）：14588-14589．

[6] WANG Yuehua， ZHU Danqing， DAI Yong，et al. Effect of different amino acid precursor-feeding on the active ingredient of Fritillaria cirrhosa D.Don culture［J］.Journal of Anhui Agricultural Sciences，2011，39（24）：14588-14589．

[7] 刘振祥，廖旭辉.植物组织培养技术［M］.北京：化学工业出版社，2007．

[8] YANG Q， ZHAO D， LIU Q.Connections between amino acid metabolisms in plants：Lysine as an example［J］.Front Plant Sci，2020，11：928．

[9] 杨静.不同前体对黄芪悬浮培养细胞中黄芪多糖积累的影响［J］.安徽农业科学，2014，42（27）：9317-9319，9422．

[10] YANG Jing.Effect of different precursors on accumulation of Astragalus polysaccharides in the suspension culture cell of Astragalus membranaceus ［J］.Journal of Anhui Agricultural Sciences，2014，42（27）：9317-9319，9422．

[11] 毕宇.前体和诱导子对黄芩悬浮细胞生物量积累及黄芩苷含量的影响［D］.齐齐哈尔：齐齐哈尔大学，2016．

[12] 王跃华，朱丹青，代勇，等.悬浮培养中提高川贝母鳞茎生物量的氨基酸前体组合配方优化［J］.西南农业学报，2011，24（5）：1908-1911．

[13] WANG Yuehua， ZHU Danqing， DAI Yong，et al. Amino acids precusor optimization of biomass of suspension cultured Fritillaria cirrhosa D.don bulb［J］.Southwest China Journal of Agricultural Sciences，2011，24（5）：1908-1911．

[14] 宋纯鹏， 王学路， 周云， 等. 植物生理学［M］. 北京：科学技术出版社， 2015： 303.

基金资助

国家中医药管理局全国中药资源普查项目(GZY-KJS-2018-004)