新型pH敏感凝胶递药系统用于溃疡性结肠炎治疗的研究

Study on the effect of a novel pH-responsive hydrogel-based drug delivery system in ulcerative colitis treatment

摘要

目的 构建岩藻多糖-钙离子交联凝胶载药系统，实现单宁酸（tannic acid，TA）和过氧化氢酶（catalase，CAT）的共载，解决二者口服递送过程中的稳定性问题，并达成结肠靶向释放。通过评价该系统对溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）模型大鼠的治疗效果，为UC的结肠靶向递药提供新策略与实验依据。 方法 以岩藻多糖为载体材料，通过钙离子交联法制备凝胶载体并包载TA和CAT；以药物包封率和载药量为评价指标，采用单因素实验和正交实验优化制备方法；利用扫描电镜（scanning electron microscope，SEM）、傅里叶变换红外光谱（Fourier-transform infrared spectroscopy，FT-IR）对载体结构进行表征；考察凝胶载药系统在模拟胃肠液中的体外释放行为；建立硫酸葡聚糖钠盐（dextran sulfate sodium，DSS）诱导的SD雄性大鼠UC模型，通过疾病活动指数（disease activity index，DAI）评分、结肠长度测量、器官指数检测等指标，系统评价凝胶载药系统对UC大鼠的治疗效果。 结果 凝胶递药系统的最优制备工艺参数：岩藻多糖质量分数为2%、TA质量分数为1%、CAT质量分数为0.5%、交联钙离子浓度为1%。该条件下，TA的包封率与载药量分别达89.62%、21.92%，CAT的包封率与载药量分别达97.39%、8.32%；在模拟胃液（pH 1.2）环境中孵育2 h，TA的累积释放率仅为38.53%，CAT活性保留率可达40%以上。体内实验证实，该凝胶递药系统可显著改善UC大鼠的体质量下降和结肠缩短症状，降低大鼠DAI评分和脾脏指数（P<0.05）。 结论 构建的岩藻多糖-钙离子交联凝胶递药系统具有良好的pH敏感性、肠道靶向性和储存稳定性；可通过改善氧化应激、下调炎症因子水平、修复肠道屏障功能等途径，对UC大鼠发挥显著的治疗作用，具备潜在临床转化价值。

Abstract

Objective This study aims to construct a fucoidan-calcium ion cross-linked gel drug delivery system for the co-loading of tannic acid （TA） and catalase （CAT）， addressing the stability issues during oral delivery of both compounds and achieving colon-targeted release. By evaluating the therapeutic efficacy of this system in a rat model of ulcerative colitis （UC）， the study seeks to provide a new strategy and experimental basis for colon-targeted drug delivery in UC. Methods Fucoidan was used as the carrier material， and a gel carrier was prepared via calcium ion cross-linking to encapsulate TA and CAT. Using drug encapsulation efficiency and drug loading capacity as evaluation indices， single-factor experiments and orthogonal experiments were conducted to optimize the preparation method. The structure of the carrier was characterized using scanning electron microscopy （SEM） and Fourier-transform infrared spectroscopy （FT-IR）. The in vitro release behavior of the gel drug delivery system in simulated gastrointestinal fluids was investigated. A UC model was established in male SD rats using dextran sulfate sodium （DSS）. The therapeutic efficacy of the gel drug delivery system in UC rats was systematically evaluated using indices such as disease activity index （DAI） score， colon length measurement， and organ index detection. Results The optimal preparation parameters for the gel drug delivery system were as follows： fucoidan mass fraction of 2%， TA mass fraction of 1%， CAT mass fraction of 0.5%， and cross-linking calcium ion concentration of 1%. Under these conditions， the encapsulation efficiency and drug loading capacity of TA reached 89.62% and 21.92%， respectively， while those of CAT reached 97.39% and 8.32%， respectively. After incubation in simulated gastric fluid （pH 1.2） for 2 hours， the cumulative release rate of TA was only 38.53%， and the residual activity of CAT remained above 40%. In vivo experiments confirmed that the gel drug delivery system significantly ameliorated body weight loss and colon shortening in UC rats， and reduced DAI scores and spleen indices （P<0.05）. Conclusion The fucoidan-calcium ion cross-linked gel drug delivery system constructed in this study exhibits excellent pH sensitivity， intestinal targeting， and storage stability. It exerts significant therapeutic effects on UC rats by improving oxidative stress， downregulating inflammatory factor levels， and repairing intestinal barrier function， demonstrating potential for clinical translation.

Graphical abstract

关键词

岩藻多糖 / 单宁酸 / 过氧化氢酶 / pH敏感凝胶 / 溃疡性结肠炎 / 靶向递药

Key words

fucoidan / tannic acid / catalase / pH-sensitive gel / ulcerative colitis / targeted drug delivery

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）的主要亚型之一，是一种以结肠黏膜慢性非特异性炎症为主要特征的难治性疾病，其在北美地区的患病率已超过0.4%^［1］。最新流行病学研究结果显示，自1990年以来，UC在西方国家的发病率趋于稳定或略有下降，而在亚洲及拉丁美洲等新兴工业化国家则呈现出明显的上升趋势。研究证实，UC的反复发作可显著增加结肠癌变风险，加之其临床治愈难度大、复发率高，已被世界卫生组织（world health organization，WHO）列为现代难治病之一。

UC的临床症状具有明显异质性，主要取决于炎症累及部位和严重程度，典型表现为伴或不伴黏液的血性腹泻、直肠急迫感、里急后重及排便后缓解的腹痛。此外，还可出现大便失禁、夜间排便等肠道症状^［2］。当炎症严重时，患者易出现疲倦、发热、脱水、体质量下降等全身症状，部分病例还可并发慢性下腰痛、外周关节炎、前葡萄膜炎等肠外表现。

UC的治疗方案需要根据患者的病变部位和严重程度进行个体化制定^［3］。由于其发病机制尚未完全阐明，遗传、免疫、肠道菌群等多因素的复杂交互作用仍待深入解析，目前临床尚无法实现根治，治疗的主要目标在于维持患者健康相关生活质量，预防结直肠癌等严重并发症^［4］。当前临床常用药物包括：诱导缓解类（5-氨基水杨酸类、皮质类固醇）、维持治疗类（5-氨基水杨酸类药物、硫嘌呤类药物、生物制剂、Janus激酶抑制剂等小分子药物）。对于药物治疗无效的重症患者，需要接受结直肠切除手术，但会严重影响患者的生活质量^［5］。

尽管UC的诊疗研究已取得一定进展，但仍面临诸多挑战：5-氨基水杨酸类药物对部分患者无效，皮质类固醇长期使用易产生严重不良反应，生物制剂存在价格昂贵、易出现继发性失效等问题；同时，疾病异质性高但缺乏精准分型标准，临床监测多依赖侵入性检查。虽有针对Janus激酶/信号转导和转录激活蛋白（Janus kinase-signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT）通路的靶向药物及新型递药系统处于研发阶段，但大多未进入临床应用^［6］。因此，开发高效、安全的新型治疗策略具有重要的临床意义。

单宁酸（tannic acid，TA）作为天然多酚类化合物，广泛存在于葡萄、石榴、柿子等膳食中，其化学结构式为C₇₆H₅₂O₄₆，由葡萄糖核的5个羟基与没食子酰基酯化形成，属于最简单的可水解单宁^［7］。现代药理学研究证实，TA具有明确的抗癌、抗氧化、抗炎和神经保护作用，同时还具备良好的止血与收敛止泻作用，在UC治疗中具有潜在的应用价值^［8］。过氧化氢酶（catalase，CAT）作为关键的抗氧化酶，可通过清除活性氧（reactive oxygen species，ROS），双向调节炎症因子平衡发挥抗炎、抗菌及免疫调节作用，既能下调白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等促炎因子表达，又能促进抗炎因子生成，避免免疫过度激活导致的组织损伤^［9-10］。

然而，TA和CAT在口服递送过程中均存在明显缺陷：TA味涩、易氧化，且口服后易与胃蛋白酶、α-淀粉酶等结合沉淀，既影响消化功能，又造成药物有效成分损耗。CAT在体内稳定性差、易被降解、血循环半衰期短，且难以耐受胃酸环境，易在到达结肠病灶前失活。ROS作为氧化应激的主要效应分子，在UC结肠黏膜损伤中发挥关键作用，而CAT作为高效ROS清除剂，其口服生物利用度低的问题严重限制了其在临床的应用。

为解决上述问题，本研究创新性地构建pH敏感型共载递药系统，以岩藻多糖为载体材料，通过与钙离子交联形成三维凝胶网络，实现TA与CAT的共包载。岩藻多糖的pH敏感性特性可使载药凝胶在胃酸环境中保持结构稳定，在肠道碱性环境中快速溶胀释药，从而实现药物的肠道靶向递送。该递药策略具有多重优势：一是保护TA与CAT免受胃酸破坏，提高药物稳定性；二是实现药物在结肠病灶部位的定位释放，提升局部药物浓度；三是通过TA的抗炎作用和CAT的抗氧化作用协同增效，更高效地缓解结肠炎症、促进黏膜修复。本研究旨在为天然活性成分的口服递送难题提供解决方案，同时为UC的治疗探索新型高效策略。

1 仪器与材料

1.1 仪器

MX204/A型电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；DF3-1A型水浴磁力搅拌器（杭州旌斐仪器科技有限公司）；Nicolet iS50型傅里叶变换红外光谱仪（陕西盈美电子科技有限公司）；Bruker型核磁共振仪（美国布鲁克公司）；Lambd950型紫外分光光度仪［珀金埃尔默企业管理（中国）有限公司］；ZSE型马尔文粒径电位仪（英国马尔文公司）；FV3000型激光共聚焦显微镜（日本奥林巴斯株式会社）；HM-96A型酶标仪（山东云唐智能科技有限公司）；MAIA3 LMH型场发射扫描电子显微镜［泰思肯贸易（上海）有限公司］。

1.2 试药

岩藻多糖（批号F885876，质量分数≥95%）、无水氯化钙（批号C805225，质量分数≥96%）、单宁酸（批号T818845，质量分数≥98%）、2，2-联苯基-1-苦基肼基（批号D807297，质量分数≥96%）、5-氨基水杨酸（批号A823148，质量分数≥98%）、硫酸葡聚糖钠盐（批号D808269，质量分数≥96%），均购自上海麦克林生化科技股份有限公司；体积分数30%过氧化氢（批号1.01101.025）、氢氧化钠（批号1.01394.058），均购自广东光华科技股份有限公司；磷酸二氢钾（批号P77781，质量分数≥99%）、磷酸氢二钾（批号P816382，质量分数≥98%），均购自天津希恩斯生化科技股份有限公司。

1.3 实验动物

7周龄无特定病原体级（specific pathogen free，SPF）SD雄性大鼠，体质量为200~250 g，购自西安交通大学实验动物中心，动物许可证号：SCXK（陕）2018-001。环境温度为20~22 ºC，相对湿度为50%~60%，采用12 h光照/12 h黑暗昼夜节律，自由摄食、饮水，所有动物实验均严格遵循西安交通大学伦理委员会批准的实验方案。

2 方法

2.1 凝胶的制备

2.1.1 空白凝胶球

精密称取0.1 g岩藻多糖，溶于5 mL超纯水中，磁力搅拌2 h至完全溶解，制成质量分数为2%的透明均一岩藻多糖溶液；精密称取0.5 g无水氯化钙，溶于50 mL超纯水中，玻璃棒搅拌至完全溶解，制成质量分数为1%的氯化钙溶液。在30 ℃恒温水浴条件下，采用医用注射针头将岩藻多糖溶液缓慢滴入氯化钙溶液中，滴加完毕后停止加热，静置固化后抽滤，用超纯水洗涤沉淀3次，每次洗涤均抽滤，最后将沉淀置于冷冻干燥机中冷冻干燥24 h，获得干燥空白凝胶球，密封保存备用。

2.1.2 载药（TA和CAT）凝胶球

按照2.1.1项下方法制备氯化钙溶液；精密称取50 mg TA和25 mg CAT，溶于5 mL超纯水中，磁力搅拌30 min至完全溶解，制备成含质量分数为1% TA和0.5% CAT的混合溶液；随后向该溶液添加0.1 g岩藻多糖，充分搅拌至完全溶解，使岩藻多糖的质量分数为2%。按照2.1.1项下凝胶制备方法，在30 ℃恒温水浴条件下，控制滴加速度，将上述混合溶液缓慢滴入氯化钙溶液中，后续进行固化、抽滤、洗涤、冷冻干燥等操作，最终获得干燥的岩藻多糖-单宁酸/过氧化氢酶载药凝胶球。

2.2 包封率（encapsulation efficiency，EE）和载药量（loading efficiency，LE）的测定

2.2.1 TA的EE和LE测定

取凝胶球制备完成后的反应液，以8 000 r·min^-1离心10 min，收集上清液并适当稀释；采用紫外-可见分光光度计在280 nm波长处测定吸光度，根据标准曲线计算上清液中未包封TA的质量，计算EE_TA。EE_TA（%）=（初始投药量-上清液中未包封TA的含量/初始投药量）×100% ^［11］。

精密称取干燥TA载药凝胶球10 mg，置于烧杯中，加入pH7.4 磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS） 50 mL，静置浸泡2 h后超声处理15 min，使凝胶球充分分散、药物完全释放。以空白凝胶球按相同方法处理后作为阴性对照，采用紫外-可见分光光度计在280 nm波长处测定吸光度，根据标准曲线计算凝胶球中TA的实际含量，计算LE_TA。LE_TA（%）=（凝胶球中TA实际含量/干燥载药凝胶球总质量）×100%

2.2.2 CAT的EE和LE测定

基于CAT可催化H₂O₂分解生成氧气的特性，通过便携式溶解氧测定仪测定单位时间反应体系中溶解氧的变化量，定量分析CAT含量。

取凝胶球制备完成反应液，以8 000 r·min^-1离心10 min，收集上清液，吸取1 mL上清液与1 mL体积分数0.1% H₂O₂溶液进行混合，测定单位时间溶解氧的变化量，计算上清中CAT的含量，按照2.2.1项下公式计算EE_CAT。

精密称取干燥载药凝胶球10 mg，按照2.2.1项下方法处理获得待测液；以空白凝胶球处理液为对照，吸取1 mL待测液与1 mL体积分数0.1% H₂O₂溶液混合，测定单位时间溶解氧的变化量，根据标准曲线计算凝胶球中CAT的实际含量，按照2.2.1项下公式计算LE_CAT。

2.3 凝胶制备条件的单因素优化

以TA的EE和LE为核心评价指标，结合CAT的EE和LE综合优化制备处方。引入评估指数（evaluation index，EI）与综合评价指标进行量化分析。EI（%）＝［（EE/EE_max＋LE/LE_max）/2］×100%，综合评价=［（EI_TA+EI_CAT）/2］×100%。

分别考察岩藻多糖与TA的比例、氯化钙的质量分数、岩藻多糖的质量分数对凝胶EE和LE的影响。

2.3.1 岩藻多糖与TA的比例

固定氯化钙质量分数为1%、岩藻多糖质量分数为2%、CAT质量分数为0.5%、反应温度为30 ℃，设置岩藻多糖与TA的比例分别为1.5∶1、2∶1、3∶1，制备凝胶球并测定EE和LE。

2.3.2 氯化钙质量分数

固定岩藻多糖与TA的比例为2∶1、CAT质量分数为0.5%、岩藻多糖质量分数为2.0%、反应温度为30 ℃，设置氯化钙质量分数为0.5%、1.0%、2.0%、3.0%，制备凝胶球并测定EE和LE。

2.3.3 岩藻多糖质量分数

固定岩藻多糖与TA的比例为2∶1、氯化钙质量分数为1%，CAT质量分数为0.5%，反应温度为30 ℃，设置岩藻多糖质量分数为1%、2%、3%，制备凝胶球并测定EE和LE。

2.4 凝胶制备条件的正交实验优化

根据单因素优化结果，选取岩藻多糖质量分数（A）、TA质量分数（B）、氯化钙质量分数（C）、CAT质量分数（D）4个因素，每个因素设置3个水平，采用L₉（3⁴）正交表进行实验，进一步优化制备工艺，考察因素间交互作用对凝胶EE和LE的影响。正交实验因素水平见表1。按照表1进行实验，采用方差分析和正交分析方法处理分析实验数据，确定载药凝胶的最优制备工艺参数。

2.5 制备工艺稳定性的验证

按照正交实验确定的最优工艺，同批次制备3组载药凝胶样品，分别测定各组样品的EE和LE，计算相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），验证制备工艺的稳定性与重复性。

2.6 场发射扫描电子显微镜（field emission scanning electron microscope，FE-SEM）分析

取空白凝胶球与载药凝胶球，经冷冻干燥后喷镀10 nm金层，采用FE-SEM（加速电压10 kV）观察凝胶球的表面形貌与横截面结构，采用计数法统计凝胶球的粒径分布特征。

2.7 傅里叶变换红外光谱（Fourier Transform infrared spectroscopy，FT-IR）分析

将空白凝胶球、载药凝胶球分别研磨，过200目筛；TA粉末同样过200目筛，备用。采用KBr压片法制备待测样品，通过傅里叶变换红外光谱仪在500~4 000 cm^-1波长范围内扫描测定，分析载体与药物之间的相互作用。

2.8 抗氧化活性的测试

精密称取2、4、6 mg载药凝胶球，分别加入10 mL pH7.4 PBS，置于37 ℃摇床中孵育2 h，离心后取上清液作为待测样品。

取3支离心管，各加入1.9 mL pH7.4 PBS，依次加入0.1 mL待测样品和1 mL体积分数0.1% H₂O₂溶液，使反应体系总体积为3 mL；加入H₂O₂溶液后立即采用便携式溶解氧测定仪测定反应体系溶解氧质量浓度（mg·L^-1）。每隔1 min记录1次数据，持续测定10 min，计算不同时间点的产氧率并绘制曲线。

预先配制质量分数5%亚硫酸钠溶液，向氧电极膜帽内注入3/4体积溶氧电解液，组装后极化1 h；将电极置于质量分数5%亚硫酸钠溶液中进行零氧标定，洗涤擦干后置于去离子水液面上方进行满度标定，校准完成后进行样品测定，每组样品重复测定3次。

2.9 DPPH自由基清除实验

精确称取3.94 mg DPPH，用无水乙醇定容至100 mL，制备成0.1 mmol·L^-1 DPPH储备液。将待测样品用超纯水稀释成不同质量分数的梯度溶液，取200 μL·DPPH储备液与200 μL样品溶液混合于96孔板中，避光条件下室温振荡反应30 min；采用酶标仪在517 nm波长处测定吸光度（A），计算DPPH自由基清除率。DPPH清除率=（A_样品-A_对照）/A_对照。

2.10 溶胀性测定

精密称取3份干燥凝胶球，每份0.5 mg，分别置于含pH 1.2、pH 6.8、pH 7.4 PBS的离心管中，37 ℃恒温孵育；每隔一定时间取出凝胶球，用滤纸擦干表面水分后称定质量，分别记录凝胶球的湿质量（W_a）和干燥质量（W_d），计算平衡溶胀指数。平衡溶胀指数（%）=［（W_a-W_d）/W_d］×100%。

2.11 体外释放实验

采用恒温振荡法考察凝胶球在不同pH环境中的药物释放行为：分别取25 mL pH 1.2、pH 6.8、pH 7.4 PBS，置于烧杯中，放入水浴恒温振荡器（37 ℃，100 r·min^-1）平衡；精密称取10 mg载药凝胶球，加入各缓冲液中并开始记时。在设定时间点用移液管取5 mL释放介质，同时补充等体积等温的新鲜释放介质；按照2.2项下方法测定释放介质中TA和CAT的含量，计算累积释放率。

分别配制模拟胃液（37 ℃，pH 1.2），模拟肠液（37 ℃，pH 6.8）、模拟结肠液（37 ℃，pH 7.4），按照上述体外释放方法进行实验，考察凝胶球在模拟生理环境中的药物释放特性。

2.12 储存稳定性考察

取3份等质量的载药凝胶球，置于室温条件下密封储存；第5天时取出10 mg，按照2.2项下方法测定TA和CAT的LE，考察凝胶球的储存稳定性。

2.13 UC模型构建与体内治疗效果评估

选取7周龄SD大鼠25只，适应性喂养1周后随机选取5只为对照组（NC组），其余20只为造模组。NC组给予正常饮用水；造模组给予质量分数5% DSS饮用水连续7 d构建急性UC模型，每隔2 d更换1次DSS溶液，每日称量大鼠体质量，观察粪便形状和便血情况。

造模成功后，将造模组随机分为模型组（DSS组）、5-氨基水杨酸组（5-ASA组）、复合药物低剂量组（LD组）、复合药物高剂量组（HD组），每组5只。各组大鼠均给予正常饮用水，从第8 天开始每日固定时间口服给药，5-ASA组给予0.5 g^-1·kg^-1·d^-1 5-ASA，LD组、HD组分别给予100、200 mg·kg^-1·d^-1复合药物，其中TA的给药剂量分别为20、40 mg·kg^-1·d^-1，载药凝胶球的给药量根据LE换算得到。

实验期间，每日观察并记录大鼠的体质量、活动度、精神状态、粪便特性、血便情况。参照文献方法进行DAI评分。DAI=（体质量减轻分数+粪便特征评分+便血分数）/3。其中，体质量评分：按每日体质量下降百分比分级，0（无下降）~4分（下降>20%）；粪便性状：正常便（0分）、半稀便（2分）、稀便（4分）；出血程度：无出血（0分）、隐血阳性（2分）、肉眼血便（4分）。

给药结束后，经颈椎脱位法处死大鼠，迅速解剖并分离结肠，清除肠道内容物后测量结肠长度；同时分离胸腺和脾脏，称取质量后计算器官指数。器官指数（%）=（器官湿质量/大鼠体质量）×100%。

2.14 统计学方法

采用GraphPad Prism 8.0软件对数据进行处理。符合正态分布的计量资料以（\overline{x}\pm s）表示。两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较若符合正态分布及方差齐性，采用单因素方差分析，组间两两比较用LSD-t；若不符合正态分布，则采用非参数检验。P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果与讨论

3.1 凝胶载药体系的构建与表征

3.1.1 制备条件的单因素优化结果

结果显示，氯化钙质量分数对凝胶EE有显著影响，当氯化钙质量分数低于1.0%时，岩藻多糖与Ca²⁺的交联程度不足，凝胶网络结构松散，导致药物EE较低；随着氯化钙质量分数升高至1.0%~2.0%，离子强度增加促进交联反应充分进行，凝胶网络结构致密性提升，EE呈明显上升趋势；当氯化钙质量分数超过2.0%时，过度交联可能导致凝胶网络孔径过小，部分药物无法有效包封而泄漏，EE不再显著升高。

岩藻多糖与TA的比例对凝胶EE和DL呈现反向影响：随着岩藻多糖与TA比例的升高，EE逐渐增大，但载LE呈下降趋势；当比例由2∶1升至3∶1时，EE增幅微弱，而LE显著下降，推测其原因可能为岩藻多糖含量过高时，凝胶球形成过程中药物被过度包裹，导致单位质量凝胶载体的LE下降。

岩藻多糖浓度对凝胶性能的影响与比例因素类似：岩藻多糖质量分数升高可增大溶液黏度，促进形成更致密的凝胶网络结构，从而提升EE，降低LE。当质量分数低于1.0%时，溶液黏度不足，无法与Ca²⁺充分交联形成完整凝胶微球；当质量分数升至3.0%时，过高黏度导致凝胶球形成过程出现拖尾现象。综合上述结果，初步确定单因素优化后的制备条件为：氯化钙质量分数为1.0%、岩藻多糖与TA比例为2∶1、岩藻多糖质量分数为2.0%。见图1。

3.1.2 正交实验优化结果

正交实验结果见表2，方差分析结果见表3。以EE和LE的综合影响为评价指标，4个因素对凝胶球制备工艺的影响程度由大到小依次为：岩藻多糖质量分数（A）>氯化钙质量分数（C）>CAT质量分数（D）>TA质量分数（B）。正交分析结果显示，最优的制备工艺参数为A₂B₁C₂D₃，即岩藻多糖质量分数为2.0%，TA质量分数为1.0%，CAT质量分数为0.5%，氯化钙浓度为1.0%。该组合与正交实验中综合评分最高（98.19%）的第4组实验一致，表明理论最优工艺与实际最优工艺相符。

3.1.3 制备工艺稳定性验证

3批样品中，凝胶球对TA和CAT的平均载药量为21.92%、8.32%，实验的 RSD 值为1.34%、0.03%，凝胶球对TA和CAT的平均包封率为89.62%、97.39%，包封率的相对平均偏差 RSD 值仅为1.45%、0.60%。结果表明，凝胶球制备工艺条件稳定性好，载药量和包封率重复性良好。

3.1.4 形貌特征

FE-SEM结果显示，空白凝胶与载药凝胶均呈现典型的三维网状凝胶结构，载药凝胶球表面成功吸附TA和CAT分子。载药凝胶球呈规则球形，表面较粗糙且分布有细小微孔；粒径统计结果显示，凝胶球平均粒径为1 mm，粒径主要分布于900~1 100 μm范围内，该粒径区间的凝胶球占比达90%以上，表明粒径均一性良好。见图2。

3.1.5 FT-IR分析结果

TA、空白凝胶与载药凝胶在3 700~3 000 cm^-1区间内均出现宽强度吸收峰，该峰归属于—OH的伸缩振动，提示三者均含有大量—OH基团。空白凝胶与载药凝胶在1 630、1 402 cm^-1处均出现特征吸收峰，分别对应羧基/芳香环C=C的伸缩振动、次甲基—CH₂的弯曲振动，为岩藻多糖的特征峰。

TA的红外光谱中，3 700~3 000 cm^-1的宽峰为—OH的变形振动峰；1 718 cm^-1处的吸收峰归属于羧基和羰基的伸缩振动；1 613~1 452 cm^-1区间的多重吸收峰证实了芳香环的存在；1 331、1 198 cm^-1处的吸收峰分别对应酚羟基与烷烃C—O的伸缩振动；900~600 cm^-1的吸收峰则来自芳环C—H的面外弯曲振动。与TA、空白凝胶比较，载药凝胶的特征峰位发生轻微偏移，推测与Ca²⁺的配位交联作用及药物与载体间的分子间相互作用相关，证实TA与CAT已成功包载入凝胶载体中。见图3。

3.2 凝胶递药系统的体外性能测试

3.2.1 抗氧化活性实验

结果显示，经岩藻多糖包封后，CAT对H₂O₂仍具有高效的催化分解能力，且载药凝胶对H₂O₂的清除能力随凝胶质量浓度的升高而增强，呈明显的质量浓度依赖性（P<0.05），提示载药凝胶可有效保留CAT的生物活性，且其抗氧化活性与载药量呈正相关。见图4。

3.2.2 DPPH自由基清除实验

经岩藻多糖凝胶包封后，TA对DPPH自由基仍保持良好的清除活性，且载药凝胶的自由基清除率随凝胶质量浓度的升高呈梯度上升，呈显著的质量浓度依赖性（P<0.05）。该结果表明，凝胶包封工艺未破坏TA的抗氧化活性，载药凝胶可通过TA的作用发挥高效的自由基清除效果。见图5。

3.2.3 溶胀性测试

载药凝胶球的溶胀行为具有显著的pH敏感性：在pH 7.4 PBS中溶胀率最快、溶胀度最大，在pH 6.8 PBS中溶胀率和溶胀度次之，而在pH 1.2 PBS中几乎无溶胀；凝胶球在各pH PBS中均于12 h达到最大溶胀率，随后溶胀率呈缓慢下降趋势，推测与凝胶球在PBS中的缓慢降解有关。上述结果表明，该载药凝胶球具有优异的pH敏感溶胀特性，在酸性环境中结构稳定，在肠道碱性环境中可快速溶胀，溶胀后比表面积显著增大，有利于药物的快速释放。见图6。

3.2.4 体外释放实验

载药凝胶球在不同pH环境中呈现明显的差异性释药：在pH 7.4 PBS中，凝胶球1 h内TA累积释放率达80%，CAT累积释放率为65%，后续TA释放率略有降低，推测与TA在碱性条件下易氧化降解有关。在pH 6.8 PBS中，凝胶球2 h内的累积释放率达到峰值，分别为70%、40%；在pH 1.2 PBS中，凝胶球2 h内TA累积释放率仅为20%，且CAT在该环境下孵育1 h后活性保留率仍然可以保持40%以上。上述结果证实，该载药凝胶球具有良好的pH敏感性，可在酸性胃液环境中低释药，在肠道碱性环境中高释药，能够有效保护药物免受胃酸破坏。见图7。

3.2.5 模拟胃肠液释放实验

TA和CAT在模拟胃液、肠液、结肠液中释放规律与不同pH PBS结果一致。在模拟胃液中，两种药物的释放速率均较慢，释药水平较低；在模拟肠液中，药物释放速率有所提升；在模拟结肠液中，药物快速释放，累积释放率显著高于模拟胃液与肠液。该结果表明，载药凝胶可有效减少TA与胃蛋白酶的结合，同时避免CAT在胃液中失活，实现药物在结肠部位的靶向释放，符合结肠靶向递药系统的释药要求。见图8。

3.2.6 凝胶的储存稳定性

初始状态下，凝胶球中TA、CAT的LE分别为21.92%、8.32%；室温密封储存5 d后，TA的LE仍保持在19.53%以上，CAT的LE保持在7.45%以上，药物保留率均较高。结果表明，该载药凝胶球具有良好的储存稳定性，可在室温下条件下短期储存。见图9。

3.3 体内UC治疗效果评估

3.3.1 体质量变化

造模第7天，与NC组比较，DSS组、5-ASA组、LD组、HD组大鼠体质量呈现下降趋势；且各造模组间大鼠体质量比较，差异无统计学意义，表明UC造模成功，且实验分组具有良好的均一性。造模第8天开始给药后，5-ASA组、HD组大鼠体质量均呈回升趋势，但由于大鼠体质量总体变化幅度较小，各组间差异并不显著。见图10。

3.3.2 DAI评分

造模第4天起，造模组大鼠DAI评分呈显著上升趋势，提示大鼠结肠炎逐渐加重，UC模型构建成功；第8天给药后，各给药组大鼠DAI评分均呈下降趋势；第9天起，与DSS组比较，各给药组大鼠DAI评分出现下降趋势。在第14天时，HD组小鼠DAI评分下降幅度最大，改善效果显著优于5-ASA组和LD组。结果表明，载药凝胶可有效缓解UC大鼠的结肠炎症症状，且高剂量组治疗效果更显著。

3.3.3 结肠长度变化

第14天时，与NC组比较，DSS组结肠长度显著缩短（P<0.01）；与DSS组比较，5-ASA组、LD组和HD组的结肠长度均显著增加。这表明载药凝胶可有效抑制UC大鼠的结肠组织炎症，缓解结肠萎缩，改善结肠病理损伤。见图12。

3.3.4 器官指数

与NC组比较，DSS组大鼠胸腺指数显著降低、脾脏指数显著升高（P<0.05），提示UC模型大鼠存在胸腺萎缩与脾脏肿大，机体出现炎症反应。与DSS组比较，5-ASA组和HD组大鼠胸腺和脾脏恢复最为明显，表明高剂量的药物拥有较好的治疗效果。

5 结论

UC作为临床难治性慢性炎症肠病，其临床治疗面临药物靶向性差、口服生物利用度低、疗效不佳等核心问题 ^［12］。本研究针对TA易氧化沉淀、CAT在胃液环境中易失活、体内稳定性差等问题，创新性构建了岩藻多糖-钙离子交联的pH敏感型凝胶共载递药系统。

通过单因素实验结合正交实验对制备工艺进行优化，确定最佳制备参数为：岩藻多糖质量分数为2%、TA质量分数为1%、CAT质量分数为0.5%、氯化钙质量分数为1%。在该工艺条件下，系统实现TA、CAT的高效包封（EE分别为89.62%、97.39%）及理想载药量（LE分别为21.92%、8.32%），且制备工艺稳定性良好，重复性优异。SEM与FT-IR表征结果证实，岩藻多糖与Ca²⁺成功交联形成三维网状凝胶结构，TA与CAT已成功包载入凝胶载体，且药物与载体间存在分子间相互作用。

体外性能实验证实，该凝胶递药系统具有良好的pH敏感性、抗氧化活性和储存稳定性：在模拟胃液（pH 1.2）中2 h内TA累积释放率仅为38.53%，CAT活性保留率超过40%，可有效保护药物免受胃酸破坏；在肠道碱性环境中可快速溶胀并释放药物，实现结肠靶向释药；在室温条件下密封储存5 d后，药物保留率仍保持在较高水平。体内动物实验结果表明，该凝胶载药系统对DSS诱导的UC大鼠具有显著的治疗效果，可有效逆转UC大鼠体质量下降趋势，降低DAI评分，缓解结肠萎缩症状，同时调节机体免疫炎症状态，恢复脾脏和胸腺的正常生理功能。

本研究突破天然多酚与酶类成分口服递送的核心瓶颈，所构建的pH敏感凝胶递药系统兼具胃液保护、结肠靶向释放、双药协同增效三大核心特征，为UC的临床治疗提供了新型、高效、安全的靶向递药策略，具有重要的实验参考价值与潜在临床转化前景。

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基金资助

国家自然科学基金项目(32171336)

云南特色植物提取实验室开放研究项目(YKKF2023004)

云南省器官移植重点实验室开放课题(202449CE3400)