阿尔茨海默病患者血清视锥蛋白样蛋白1、帕金森病蛋白2的表达及临床意义

Expression and clinical significance of serum VILIP-1 and PARK2 in Alzheimer’s disease patients

摘要

目的 探究阿尔茨海默病患者血清视锥蛋白样蛋白1（visinin-like protein， VILIP-1）、帕金森病蛋白2 （Parkinson disease protein 2， PARK2）的表达及临床意义。 方法 选取2021年5月至2024年5月收治的96例阿尔兹海默病患者作为病例组，根据病情严重程度进一步分为轻度组43例，中度组31例，重度组22例；另选择96例体检健康志愿者作为对照组。采用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA）对所有血清样本VILIP-1、PARK2表达水平进行检测；用Pearson相关分析阿尔茨海默病患者血清VILIP-1、PARK2表达水平与简易智力状态评分（Mini Mental State Examination， MMSE）评分及炎性因子的相关性；受试者工作特征（receiver operating characteristic， ROC）曲线，分析血清VILIP-1、PARK2水平对阿尔兹海默病的诊断价值。 结果 与对照组比较，病例组患者的血清VILIP-1及炎性因子肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）、白细胞介素-1β（interleukin-1β， IL-1β）、白细胞介素-6（interleukin-6， IL-6）、白细胞介素-17（interleukin-17， IL-17）表达水平均升高，PARK2水平及MMSE评分均降低（P<0.05）；随着阿尔茨海默病病情进展，血清VILIP-1表达水平逐渐升高，PARK2表达水平逐渐降低（P<0.05）； Pearson相关分析结果显示阿尔茨海默病患者血清VILIP-1与MMSE评分呈负相关，与炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17呈正相关（P<0.05）；血清PARK2表达水平与MMSE评分呈正相关，与TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17呈负相关（P<0.05）；ROC曲线结果表明，血清VILIP-1、PARK2联合诊断阿尔兹海默病患病的曲线下面积（area under the curve， AUC）值为0.883，显著大于VILIP-1（Z=2.531， P=0.011）和PARK2（Z=2.332， P=0.020）单独诊断。 结论 阿尔茨海默病患者血清VILIP-1表达水平升高，PARK2表达水平降低，二者与病情严重程度有关，同时检测两者的水平对阿尔茨海默病的诊断具有较高价值。

Abstract

Objective To investigate the expression and clinical significance of serum visinin like protein 1 （VILIP-1） and Parkinson disease protein 2 （PARK2） in patients with Alzheimer’s disease. Methods A total of 96 patients with Alzheimer's disease from May 2021 to May 2024 were included as the case group. According to the severity of the disease， they were further separated into a mild group （43 cases）， a moderate group （31 cases）， and a severe group （22 cases）. 96 healthy volunteers who underwent physical examinations were included as the control group. Enzyme linked immunosorbent assay （ELISA） was applied to detect the expression levels of VILIP-1 and PARK2 in all serum samples. Pearson correlation analysis of the correlation between serum VILIP-1， PARK2 expression levels and mini mental state examination （MMSE） scores and inflammatory factors were performed in Alzheimer’s disease patients.Receiver operating characteristic （ROC） curves were plotted to analyze the diagnostic value of serum VILIP-1 and PARK2 levels for Alzheimer's disease. Results Compared with the control group， the levels of serum VILIP-1 and inflammatory factors tumor necrosis factor-α （TNF-α）， interleukin-1β （IL-1β）， interleukin-6 （IL-6）， and interleukin-17 （IL-17） were increased，while the levels of PARK2 and MMSE scores were decreased in the case group （P<0.05）； as the progression of Alzheimer's disease， the expression level of serum VILIP-1 gradually increased， and the expression level of PARK2 gradually decreased （P<0.05）； Pearson correlation analysis showed that the serum VILIP-1 in Alzheimer's patients was negatively correlated with MMSE scores and positively correlated with inflammatory factors TNF-α， IL-1β， IL-6，IL-17 （P<0.05）； the expression level of serum PARK2 was positively correlated with MMSE scores and negatively correlated with TNF-α， IL-1β， IL-6， IL-17 （P<0.05）. ROC curve results showed that the area under the curve （AUC） value for the combined diagnosis of Alzheimer's disease with serum VILIP-1 and PARK2 was 0.883， which was significantly higher than that of VILIP-1 （Z=2.531， P=0.011） and PARK2 （Z=2.332， P=0.020） diagnosed separately. Conclusion The expression level of serum VILIP-1 increased and the expression level of PARK2 is decreased in patients with Alzheimer’s disease. The both levels are related to the severity of the disease， and the combination of the 2 levels has high diagnostic value for Alzheimer’s disease.

Graphical abstract

关键词

阿尔茨海默病 / 视锥蛋白样蛋白1 / 帕金森病蛋白2 / 病情程度 / 诊断

Key words

Alzheimer’s disease / visinin like protein 1 / Parkinson disease protein 2 / severity of the disease / diagnosis

阿尔茨海默病是常见于老年群体的慢性神经退行性疾病，早期症状为记忆力减退，随着病情的发展，出现认知能力下降、语言障碍以及行为和情绪等问题，严重影响患者的生活^［1-2］。据调查结果，全球范围内阿尔兹海默病患者超过5 000万例，女性患者发病率高于男性，呈现出明显的地域差异，且随着全球老龄化加剧，预计2050年将超过1.5亿患者，高发病率加剧了社会负担^［3］。目前阿尔兹海默病的诊断通常基于病史、神经心理测试、脑部影像学检查及脑脊液标志物如β-淀粉样蛋白和Tau因子等，其中基于正电子发射计算机断层显像和脑脊液因子检测具有价格昂贵、检查侵入性等特点，难以规模化应用^［4-5］。因此寻找与阿尔茨海默病病情发生和发展相关的，更经济、无创的诊断方法，如血清标志物诊断方法，是提高早期诊断可行性和准确性的重要方式。视锥蛋白样蛋白1（visinin-like protein， VILIP-1）是由神经细胞表达的钙离子结合蛋白，是一种脑细胞损伤指标，其高水平与认知功能障碍有关^［6］。XIE Y等^［7］研究发现，老年全身麻醉术后认知功能障碍患者血清VILIP-1表达水平升高。帕金森病蛋白2（Parkinson disease protein 2， PARK2）是一种与帕金森病密切相关的调节因子，参与蛋白质降解过程^［8］。CASTELLAZZI M等^［9］研究发现，阿尔茨海默病患者血清PARK2表达水平下降，并且认知功能损伤严重患者PARK2表达水平进一步下降。目前针对与阿尔茨海默病病情发生和发展相关的标志物的研究仍不充分，特别是对阿尔茨海默病诊断价值的研究较少。基于此，本研究探究阿尔茨海默病患者血清VILIP-1、PARK2表达水平变化及二者对疾病的诊断价值，以期为减少阿尔茨海默病病情发生和进展提供参考。

1 一般资料

本研究内容经医院医学伦理委员会审核、批准，患者及家属知晓并签署同意书。选取2021年5月到2024年5月收治的96例阿尔兹海默病患者作为病例组，男45例，女51例，年龄为52~76岁，平均（63.24±8.43） 岁，病程为1~7 （3.00，5.00） 年，所有患者采取常规药物治疗，改善认知功能及控制精神症状，同时采用非药物治疗如体育锻炼和生活习惯改变以改善症状。另选择同期96例体检健康志愿者作为对照组，男47例，女49例，年龄为50~79岁，平均（65.22±8.61）岁，对照组和病例组人员性别、年龄比较差异无统计学意义（P>0.05）。

病例组患者纳入标准：①阿尔兹海默病的诊断符合指南相关标准^［10］；②临床资料完整；③可完成本次试验；④首次入院并接受治疗。对照组人员纳入标准：①体检结果为健康，各项指标均在正常范围内；②临床资料完整。

2组人员排除标准：①因外伤等原因造成的痴呆者；②合并其他影响认知功能的脑部疾病如帕金森病、脑肿瘤和脑积水等；③合并恶性肿瘤者；④合并其他重要器官器质性病变者。

2 方法

2.1 血清VILIP-1、PARK2表达水平的检测

所有人员入院首日采集空腹外周静脉血5 mL，在4 ℃条件下以3 000 r·min^-1离心10 min，收集上清液，于-80 ℃保存。采用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA）对所有血清样本VILIP-1、PARK2表达水平进行检测，操作严格参照试剂盒说明书。VILIP-1（批号ZY-E63562H）试剂盒购自上海泽叶生物公司，PARK2（批号LZ-E029448）试剂盒均购自上海联祖生物公司。

2.2 病情程度评估及分组

根据《中国阿尔茨海默病痴呆诊疗指南（2020年版）》^［10］中的症状分期标准对阿尔茨海默病患者病情程度评估并分组，数字分期为3、4期的43例患者为轻度组，即临床痴呆评定量表（Clinical Dementia Rating，CDR）评分为0.5或1.0分的认知程度轻度损害或轻度痴呆患者，日常生活基本独立，但对复杂任务有轻度影响；数字分期为5期的31例患者为中度组，即CDR评分为2分的中度痴呆患者，表现为认知和精神行为障碍，日常生活受影响，部分功能受损，需经常帮助；数字分期为6期的22例患者为重度组，即CDR评分2分的重度痴呆患者，表现为严重的认知和精神行为障碍，日常生活严重受限，完全依赖他人帮助。

2.3 资料收集

收集2组人员吸烟史、嗜酒史、教育水平、基础疾病、居住地、社交活动、抑郁状况、简易智力状态检查评分［（mini mental state examination，MMSE）评分，围绕记忆力、注意力和语言能力等共7个方面进行全面评估，总分为0~30分，27~30分为认知功能正常，评分<27分为可能存在认知功能障碍］、炎性因子［肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）、白细胞介素-1β（interleukin-1β， IL-1β）、白细胞介素-6（interleukin-6， IL-6）、白细胞介素-17 （interleukin-17， IL-17）］等资料并比较和分析。

2.4 统计学方法

实验数据分析采用SPSS 25.0软件。符合正态分布的计量资料，采用（\overline{x}±s）表示，采用t检验进行2组间差异比较，多组间差异比较采用单因素方差分析进行，采用SNK-q检验进行两两比较，非正态分布计量资料以中位数及四分位间距M（Q1~Q3）表示，组间比较采用秩和检验；计数资料以“例（%）”表示，组间差异采用χ²检验分析；Pearson相关分析阿尔茨海默病患者血清VILIP-1、PARK2表达水平与MMSE评分及炎性因子的相关性；绘制受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线，分析血清VILIP-1、PARK2水平对阿尔兹海默病患病的诊断价值，曲线下面积（area under the curve， AUC）比较用Z检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 对照组和病例组一般资料、MMSE评分及炎性因子水平的比较

病例组患者吸烟史、嗜酒史、教育水平、居住地、社交活动、抑郁状况等与对照组比较差异均有统计学意义，病例组患者的MMSE评分降低，TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17水平均升高（P<0.05）。见表1。

3.2 对照组和病例组血清VILIP-1、PARK2表达水平的比较

与对照组比较，病例组患者的血清VILIP-1表达水平升高，PARK2表达水平下降（P<0.05）。见表2。

3.3 对照组患者血清VILIP-1、PARK2表达水平与MMSE评分及炎性因子的相关性

Pearson相关分析结果显示，阿尔茨海默病患者血清VILIP-1与MMSE评分呈负相关，与炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17呈正相关（P<0.05）；血清PARK2表达水平与MMSE评分呈正相关，与TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17呈负相关（P<0.05）。见表3。

3.4 轻度组、中度组和重度组阿尔兹海默病患者血清VILIP-1、PARK2表达水平的比较

与轻度组比较，中度组和重度组患者的血清VILIP-1表达水平升高，PARK2表达水平降低（P<0.05）；并且重度组患者的VILIP-1表达水平高于中度组，PARK2表达水平低于中度组（P<0.05）。见表4。

3.5 血清VILIP-1、PARK2水平对阿尔兹海默病患病的诊断价值

以是否为阿尔兹海默病患病为因变量（是=1，否=0），以血清VILIP-1、PARK2水平为检验变量绘制ROC曲线。结果表明，血清VILIP-1水平诊断阿尔兹海默病患病AUC值为0.777，PARK2水平诊断AUC值为0.793，二者联合诊断时AUC值为0.883，显著大于VILIP-1（Z=2.531，P=0.011）和PARK2（Z=2.332，P=0.020）单独诊断。见表5和图1。

4 讨论

阿尔兹海默病是一种神经退行性疾病，主要特征为认知功能障碍，其发病机制十分复杂，涉及多种因素和途径^［11］。研究发现，Aβ淀粉样蛋白及Tau蛋白机制可能是阿尔兹海默病的主要发病机制，Aβ淀粉样蛋白异常沉积可形成淀粉样斑块，这种斑块具有神经毒性，导致神经损伤^［12］，微管相关蛋白异常磷酸化和聚集形成神经元纤维缠结，可能与认知功能障碍相关，并最终引发阿尔兹海默病的发生^［13］。此外，兴奋性神经毒性和炎症机制可能加剧了神经毒性，高表达兴奋性氨基酸导致神经细胞内钙离子超载，并引发神经元死亡，可能引发阿尔兹海默病发病^［14］；阿尔兹海默病患者脑内存在神经炎症异常，与淀粉样斑块和神经元纤维缠结密切相关，可能造成自由基及凋亡相关基因表达失调，导致神经细胞凋亡，影响疾病发生^［15］。因此，找到与阿尔兹海默病发病相关的血清标志物，能够快速诊断阿尔兹海默病并进行早期干预，是减缓病情进展的重要手段。

VILIP-1是在神经细胞中发现的钙结合蛋白，当细胞受损时释放到脑脊液中，是阿尔茨海默病潜在的生物标志物^［16］。胡金雅等^［17］研究发现，阿尔兹海默病患者血清VILIP-1表达水平升高，并且老年认知功能障碍患者血清VILIP-1表达水平高于健康人群。在本研究中，阿尔兹海默病患者的血清VILIP-1表达水平升高，并且随着病情加重血清VILIP-1表达水平进一步升高，这与胡金雅等^［17］的研究结果一致，表明VILIP-1参与到阿尔兹海默病的发生和发展过程中，可能是因为VILIP-1是脑细胞损伤的潜在指标，由于脑细胞作为钙传感器的功能受损时，VILIP-1释放到脑脊液中，VILIP-1高表达与脑神经细胞损伤紧密相关，最终造成阿尔茨海默病的发生^［18］。此外，VILIP-1可能与阿尔兹海默病患者脑脊液中经典的生物标志物淀粉样β蛋白和tau蛋白水平有关，VILIP-1与其他标志物共同参与阿尔茨海默病的病理过程^［19］。

PARK2是一种含有环指结构域（really interesting new gene， RING结构域）的E3泛素连接酶，PARK2基因的突变与早发性帕金森病相关，近年来PARK2水平与认知功能关系的报道较多^［20］。周小燕等^［21］研究发现，老年帕金森病认知功能障碍患者的血清PARK2表达水平降低，并且随着认知功能的下降PARK2表达水平进一步下降。在本研究中，阿尔兹海默病患者血清PARK2表达水平降低，并且随着病情加重血清PARK2表达水平进一步降低，这与周小燕等^［22］的研究结果一致，表明PARK2参与阿尔兹海默病的发生和发展，可能的机制是PARK2参与泛素化有助于错误折叠蛋白的清除，PARK2低表达可能导致泛素-蛋白酶系统功能受损，影响Aβ淀粉样蛋白和Tau在内的异常蛋白清除，促进病理蛋白的积累，导致神经功能损伤，影响患者的认知功能，最终引起疾病发生^［22］。此外，PARK2低表达可能导致线粒体功能障碍，影响细胞的能量代谢和钙稳态，最终导致阿尔兹海默病的发生^［23］。

Pearson相关分析显示，阿尔茨海默病患者血清VILIP-1与MMSE评分呈负相关，与炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17呈正相关；血清PARK2表达水平与MMSE评分呈正相关，与TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17呈负相关，表明VILIP-1和PARK2可能在阿尔茨海默病的病理过程中发挥着不同的机制作用，VILIP-1可能通过促进炎症反应参与阿尔茨海默病的病理过程，而PARK2可能在抑制炎症和保护神经功能方面发挥作用。ROC曲线结果表明，联合诊断血清VILIP-1、PARK2水平阿尔兹海默病患病AUC值为0.883，显著大于VILIP-1、PARK2单独诊断，表明联合诊断效能较高，具有早期识别阿尔兹海默病的重要作用。

综上所述，在本研究中阿尔茨海默病患者血清VILIP-1表达水平升高，PARK2表达水平降低，二者水平与病情严重程度有关，二者联合检测对阿尔茨海默病有较高的诊断价值。但本研究存在样本量较少，个体差异大，未能深入研究VILIP-1、PARK2参与阿尔兹海默病疾病发生和发展机制等不足，还需在后续的研究中进一步完善。

参考文献

[1] FERRARI C， SORBI S.1The complexity of Alzheimer’s disease：An evolving puzzle［J］. Physiol Rev，2021，101（3）：1047-1081．

[2] BEATA B K， WOJCIECH J， JOHANNES K，et al. Alzheimer’s disease—Biochemical and psychological background for diagnosis and treatment［J］. Int J Mol Sci，2023，24（2）：1059．

[3] ZHANG F， XIAN D， FENG J，et al. Causal relationship between Alzheimer’s disease and cardiovascular disease：A bidirectional Mendelian randomization analysis［J］. Aging，2023，15（17）：9022-9040．

[4] SCHELTENS P， DE STROOPER B， KIVIPELTO M， et al. Alzheimer’s disease［J］.Lancet，2021， 397（10284）： 1577-1590．

[5] KLYUCHEREV T O， OLSZEWSKI P， SHALIMOVA A A，et al. Advances in the development of new biomarkers for Alzheimer’s disease［J］. Transl Neurodegener，2022，11（1）：25．

[6] MAVROUDIS I A， PETRIDIS F， CHATZIKONSTANTINOU S，et al. A Meta-analysis on the levels of VILIP-1 in the CSF of Alzheimer’s disease compared to normal controls and other neurodegenerative conditions［J］. Aging Clin Exp Res，2021，33（2）：265-272．

[7] XIE Y， YAO Z. Relationships of serum VILIP-1，NSE，and ADP levels with postoperative cognitive dysfunction in elderly patients undergoing general anesthesia：A retrospective，observational study［J］. J Int Med Res，2023，51（5）：03000605231172447．

[8] MADSEN D A， SCHMIDT S I， BLAABJERG M，et al. Interaction between parkin and α-synuclein in PARK2-mediated Parkinson’s disease［J］. Cells，2021，10（2）：283．

[9] CASTELLAZZI M， PATERGNANI S， DONADIO M，et al. Autophagy and mitophagy biomarkers are reduced in sera of patients with Alzheimer’s disease and mild cognitive impairment［J］. Sci Rep，2019，9：20009．

[10] 田金洲，解恒革，王鲁宁，等. 中国阿尔茨海默病痴呆诊疗指南（2020年版）［J］. 中华老年医学杂志，2021，40（3）：269-283．

[11] TIAN Jinzhou， XIE Hengge， WANG Luning，et al. Chinese guideline for the diagnosis and treatment of Alzheimer’s disease dementia（2020）［J］. Chinese Journal of Geriatrics，2021，40（3）：269-283．

[12] CAI Y， LIU J， WANG B，et al. Microglia in the neuroinflammatory pathogenesis of Alzheimer’s disease and related therapeutic targets［J］. Front Immunol，2022，13：856376．

[13] PERNECZKY R，DOM G， CHAN A，et al. Anti-amyloid antibody treatments for Alzheimer’s disease［J］. Eur J Neurol，2024，31（2）：e16049．

[14] IQBAL K. Tau and Alzheimer’s disease：Past，present and future［J］. Cytoskeleton，2024，81（1）：116-121．

[15] SEARS S M， HEWETT S J. Influence of glutamate and GABA transport on brain excitatory/inhibitory balance［J］. Exp Biol Med （Maywood），2021，246（9）：1069-1083．

[16] RAJESH Y， KANNEGANTI T D. Innate immune cell death in neuroinflammation and Alzheimer’s disease［J］. Cells，2022，11（12）：1885．

[17] MOLINUEVO J L， AYTON S， BATRLA R，et al. Current state of Alzheimer’s fluid biomarkers［J］. Acta Neuropathol，2018，136（6）：821-853．

[18] 胡金雅，孟祥安，李艳丽，等. 脑动脉狭窄程度联合血清Tau蛋白、Aβ和VILIP-1检测对老年认知功能障碍的预测价值［J］. 中风与神经疾病杂志，2022，39（8）：709-712．

[19] HU Jinya， MENG Xiang’an， LI Yanli，et al. Predictive value of cerebral artery stenosis combined with serum Tau protein，Aβ and VILIP-1 in elderly cognitive impairment［J］. Journal of Apoplexy and Nervous Diseases，2022，39（8）：709-712．

[20] MCGROWDER D A， MILLER F，VAZ K，et al. Cerebrospinal fluid biomarkers of Alzheimer’s disease：Current evidence and future perspectives［J］. Brain Sci，2021，11（2）：215．

[21] Dage J L， Eloyan A， Thangarajah M， et al. Cerebrospinal fluid biomarkers in the longitudinal early-onset Alzheimer’s disease study［J］. Alzheimers Dement， 2023， 19（9）： S115-S125.

[22] QUINN P M J， MOREIRA P I， AMBRÓSIO A F，et al. PINK1/PARKIN signalling in neurodegeneration and neuroinflammation［J］. Acta Neuropathol Commun，2020，8（1）：189．

[23] 周小燕，杨丹，张敏，等. 老年帕金森病患者血清PARK2、GFAP和BDNF表达对疾病分期和认知功能的评估［J］. 中国老年学杂志，2023，43（9）：2142-2145．

[24] ZHOU Xiaoyan， YANG Dan， ZHANG Min，et al. Evaluation of serum PARK2， GFAP， and BDNF expression in elderly Parkinson’s disease patients for disease staging and cognitive function［J］. Chinese Journal of Gerontology，2023，43（9）：2142-2145．

[25] HWANG I， KIM B S， LEE H Y，et al. PA2G4/EBP1 ubiquitination by PRKN/PARKIN promotes mitophagy protecting neuron death in cerebral ischemia［J］. Autophagy，2024，20（2）：365-379．

[26] Barazzuol L， Giamogante F， Brini M， et al. PINK1/Parkin mediated mitophagy，Ca²⁺ signalling，and ER-mitochondria contacts in Parkinson’s disease［J］. Int J Mol Sci， 2020， 21（5）： 1772-1789.

基金资助

河南省医学科技攻关计划项目(LH-GJ20210555)

开封市科技局项目(2003033)