基于双检测器联用指纹图谱结合多指标成分定量的加味逍遥丸的质量评价

Quality evaluation of Jiawei Xiaoyao Pills based on dual-detector fingerprinting and multi-component determination

摘要

目的 建立高效液相色谱-二极管阵列-蒸发光散射检测器（high performance liquid chromatography-photo-diode array-evaporative light scattering detector，HPLC-PDA-ELSD）联用技术，构建双检测器联用指纹图谱结合多指标成分同步测定加味逍遥丸（Jiawei Xiaoyao Pills，JWXYP）的质量评价方法。 方法 样品用含体积分数0.5%氨水的体积分数50%甲醇水溶液超声提取，采用Infinity Lab Poroshell 120 EC-C₁₈（100 mm×4.6 mm，2.7 μm）色谱柱；以体积分数0.1%甲酸水溶液（A）-含体积分数0.1%甲酸的乙腈溶液（B）为流动相，梯度洗脱；流速为1.2 mL·min^-1；柱温为30 ℃；PDA检测器检测波长为254 nm；ELSD漂移管温度为115 ℃，载气流速为2.7 mL·min^-1。建立15批样品的双检测器指纹图谱，通过单味药材对照完成共有峰归属，采用液相色谱-四级杆飞行时间质谱（liquid chromatography-quadrupole-time of flight-mass spectrometry，LC-Q-TOF-MS）对共有峰进行定性鉴定，并对8个指标性成分进行定量分析。 结果 建立了HPLC-PDA-ELSD双检测器联用的指纹图谱分析方法，共标识共有峰27个；15批样品指纹图谱的相似度均大于0.997。8个指标成分（氧化芍药苷、京尼平龙胆双糖苷、栀子苷、芍药苷、丹皮酚、甘草酸、柴胡皂苷A、柴胡皂苷D）含量分别为0.368~0.592、1.935~2.325、6.509~7.514、5.453~7.477、1.375~2.008、1.630~2.191、0.724~0.902、0.514~0.719 mg·g^-1。统计学分析结果显示，各成分在15批样品中含量波动范围（P值）为75%~125%，RSD<15%，批间成分含量的一致性良好。 结论 该研究采用PDA-ELSD双检测器联用技术，较传统单一指纹图谱可更全面地评价JWXYP的批间一致性；所建立的基于薄壳型色谱填料的8种成分同步测定方法专属性强，分析效率高，所得含量的一致性与含量水平可为JWXYP的整体质量评价与控制提供科学依据与参考。

Abstract

Objective To establish a quality evaluation method for Jiawei Xiaoyao Pills （JWXYP） by combining dual-detector fingerprinting with simultaneous multi-component determination using high performance liquid chromatography-photo-diode array-evaporative light scattering detector （HPLC-PDA-ELSD）. Methods The samples were ultrasonically extracted with 50% methanol aqueous solution containing 0.5% ammonia （v/v）. Chromatographic separation was performed on an Infinity Lab Poroshell 120 EC-C₁₈ column （100 mm×4.6 mm， 2.7 μm） using a mobile phase consisting of 0.1% formic acid in water （v/v） and 0.1% formic acid in acetonitrile （v/v） with gradient elution. The flow rate was 1.2 mL·min^-1， and the column temperature was 30 ℃. The detection wavelength of the PDA detector was set at 254 nm. The ELSD was operated with a drift tube temperature of 115 ℃ and a carrier gas flow rate of 2.7 mL·min^-1. Dual-detector fingerprints of 15 batches of samples were established， and common peak assignments were completed by comparison with single herb references. The common peaks were qualitatively identified by liquid chromatography-quadrupole-time of flight-mass spectrometry （LC-Q-TOF-MS）， and 8 indicator components were quantitatively analyzed. Results An HPLC-PDA-ELSD dual-detector fingerprint method was established， identifying 27 common peaks. The fingerprint similarities of 15 batches were all>0.997. The content ranges of the 8 marker components （oxypaeoniflorin， genipin gentiobioside， geniposide， paeoniflorin， paeonol， glycyrrhizic acid， saikosaponin A， and saikosaponin D） were 0.368-0.592， 1.935-2.325， 6.509-7.514， 5.453-7.477， 1.375-2.008， 1.630-2.191， 0.724-0.902， and 0.514-0.719 mg·g^-1， respectively. Statistical analysis showed that the content fluctuation range （P value） of each component across the 15 batches was 75%-125%， with RSD <15%， indicating good inter-batch consistency. Conclusion In this study， the PDA-ELSD dual-detector hyphenated technique was adopted， which can more comprehensively evaluate the inter-batch consistency of JWXYP compared with traditional single-detector fingerprinting. The established method for simultaneous determination of the 8 components based on core-shell chromatographic packing exhibited strong specificity and high analytical efficiency. The obtained content consistency and content levels can provide scientific basis and reference for the overall quality evaluation and control of JWXYP.

Graphical abstract

关键词

加味逍遥丸 / 高效液相色谱-二极管阵列-蒸发光散射检测器 / 指纹图谱 / 含量测定 / 质量评价

Key words

Jiawei Xiaoyao Pills / high performance liquid chromatography-photo-diode array-evaporative light scattering detector / fingerprinting / quantitative analysis / quality evaluation

中药的疗效与其制剂的质量密切相关，采用指纹图谱结合多功效成分含量测定是目前兼顾“质量概貌”与“质量属性”的中药复方制剂质量控制的有效方法。现有研究已在指纹图谱构建和多成分定量领域取得显著进展，但仍存在提升空间；单一检测器只能实现单方面指纹图谱检测，而中药复方制剂组方药味复杂，成分多样，多检测器串联可从多维度采集指纹图谱，进而实现尽可能多成分的整体指纹图谱表征。目前指纹图谱和成分定量研究中多采用紫外检测器，该检测器仅适用于具有紫外吸收的成分，对弱紫外吸收或无紫外吸收的成分则无法检测；蒸发光散射检测器（evaporative light scattering detection，ELSD）和质谱仪可实现此类成分的检测，但质谱仪在工业生产中应用较少。因此，将二极管阵列（photo-diode array，PDA）检测器与ELSD串联，用于指纹图谱构建和含量测定方法的建立，可实现中药复杂体系多成分的整体定性与定量表征。

加味逍遥丸（Jiawei Xiaoyao Pills，JWXYP）具有疏肝清热、健脾养血的功效，临床常用于治疗乳腺增生、痛经、围绝经期综合征等妇科疾病，消化不良、慢性胃炎等消化系统疾病，代谢相关性脂肪性肝病、糖尿病等代谢性疾病及抑郁症^［1-2］。JWXYP为第一批国家非处方药，源自明代名医薛己所著的《内科摘要》，系在《太平惠民和剂局方》“逍遥散”的基础上加丹皮、栀子化裁而成，由柴胡、栀子、牡丹皮、白芍、当归、白术、茯苓、薄荷、甘草9味药材细粉，辅以生姜汁制成水泛丸。其化学成分繁杂，涵盖单萜苷、有机酸及三萜皂苷等成分^［3］，其中柴胡皂苷等弱紫外吸收成分的检测是现行质量控制的难点。《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）（2020年版）仅以芍药苷为单一质控指标，难以全面反映其质量特性。目前，李明月等^［4］建立的超高效液相色谱-紫外（ultra-performance liquid chromatography-ultraviolet，UPLC-UV）指纹图谱仅鉴定34个共有峰中的8种成分（栀子苷、芍药苷等），未覆盖柴胡关键功效成分；白永涛等^［5］建立的高效液相色谱-紫外-质谱（high performance liquid chromatography-ultraviolet-mass spectrometry，HPLC-UV-MS）联用方法虽可检测白术内酯Ⅱ等弱吸收成分，但均未涉及柴胡皂苷A等疏肝解郁核心功效成分^［6］，与制剂“疏肝”的主治功效存在脱节。因此，其质量评价方法仍需进一步完善。

为有效、全面地控制JWXYP的质量，本研究提出HPLC-PDA-ELSD双检测器联用指纹图谱结合多指标成分定量评价策略：PDA检测器适用于分析栀子苷、丹皮酚等含共轭结构的成分，ELSD则可有效捕获柴胡皂苷A等弱紫外吸收的三萜类成分；通过优化提取溶剂体系（含体积分数0.5%氨水的体积分数50%甲醇），协同提升皂苷类成分的溶出率与稳定性，即借助碱化溶剂稳定柴胡皂苷类成分，利用弱碱性环境规避糖苷类化合物的降解风险。该方法通过双检测器互补，突破传统单一检测器模式对成分类型的限制，实现复杂体系中多类型成分的同步分析及双检测器指纹图谱表征。相较于现有方法，该方法提升了指纹图谱的特征性与覆盖度，强化了君药柴胡的质量监控，为阐明“成分-功效”关联及生产工艺优化提供了更全面的数据支撑。这种多维度的质控模式符合中药复方多组分协同作用的特点，对推进中成药标准化研究具有参考意义。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260型超高效液相色谱仪-6550型串联四极杆-飞行时间质谱联用仪（美国Agilent公司），配备ELSD 6100检测器（加拿大Alltech Technology公司）；AT201型电子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；3-18KS型离心机（美国Sigma公司）；1000C型多功能粉碎机（永康市红太阳机电有限公司）；5305型真空浓缩仪（德国Eppendorf公司）；KQ-300DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Milli-Q型超纯水系统（美国Millipore公司）。

1.2 试药

JWXYP共15批，由北京同仁堂科技发展有限公司提供（批号：23082041、23081941、23081961、23082023、23081993、23081973、23081977、23082003、23082045、23081957、23082008、23082070、23082096、23082048、23081981，编号分别为S1~S15）。

对照品：芍药苷（批号AFCE0452，质量分数≥98%）、氧化芍药苷（批号AFDJ2508，质量分数≥98%）、甘草酸（批号AFCE1008，质量分数≥98%）、柴胡皂苷A（批号AFBI0805，质量分数≥98%）、柴胡皂苷D（批号AZBL2801，质量分数≥98%），均购自成都埃法生物科技有限公司；丹皮酚（批号ST01480120，质量分数≥98%）、京尼平龙胆双糖苷（批号ST56070120，质量分数≥98%），均购自上海诗丹德标准技术服务有限公司；绿原酸（批号RFS-L00701908029，质量分数≥98%）、阿魏酸（批号RFS-A-002-181216，质量分数≥98%）、藁本内酯（批号RFS-G01001909024，质量分数≥98%），均购自成都瑞芬思生物科技有限公司；栀子苷（批号FY18380403，质量分数≥98%，南通飞宇生物科技有限公司）；芦丁（批号MUST-16031813，质量分数≥98%，成都曼思特生物科技有限公司）；1，2，3，4，6-没食子酰葡萄糖（批号P28M9F54631，质量分数≥98%，上海源叶生物科技有限公司）。

单味药材饮片：柴胡、栀子（姜炙）、牡丹皮、白芍、当归、白术（麸炒）、茯苓、甘草、薄荷，均由北京同仁堂科技发展有限公司提供，经北京中医药大学王学勇教授鉴定：柴胡为伞形科柴胡属植物柴胡Bupleurum chinense DC.的干燥根；栀子为茜草科植物栀子Gardenia jasminoides Ellis的干燥成熟果实；牡丹皮为毛茛科芍药属植物牡丹Paeonia suffruticosa Andr.的干燥根皮；白芍为毛茛科植物芍药Paeonia lactiflora Pall.的干燥根；当归为伞形科植物当归Angelica sinensis （Oliv.） Diels的干燥根；白术为菊科植物白术Atractylodes macrocephala Koidz.的干燥根茎；茯苓是多孔菌科真菌茯苓Poria cocos （Schw.） Wolf的干燥菌核；薄荷为唇形科植物薄荷Mentha haplocalyx Briq.的地上部分；甘草为豆科植物甘草 Glycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥根及根茎。

试剂：乙腈（色谱纯）、甲醇（色谱纯）、乙腈（质谱纯）、甲醇（质谱纯），均购自Fisher Chemical公司；甲酸（美国Thermo Fisher Scientific公司）；超纯水由Milli-Q纯水仪（美国Millipore公司）制得。

2 方法与结果

2.1 仪器参数

2.1.1 色谱条件

使用 Infinity Lab Poroshell 120 EC-C₁₈色谱柱（100 mm×4.6 mm，2.7 μm）；以体积分数0.1%甲酸水溶液（A）-含体积分数0.1%甲酸的乙腈溶液（B）；梯度洗脱：0~7 min，95% A；7~20 min，95% A→85% A；20~25 min，85% A→80% A；25~35 min，80% A→75% A；35~40 min，75% A→66% A；40~55 min，66% A；55~65 min，66% A→10% A；流速为1.2 mL·min^-1；柱温为30 ℃；紫外检测波长为254 nm；ELSD漂移管温度为115 ℃；漂移管载气流速为2.7 mL·min^-1；进样量为10 μL。

2.1.2 质谱条件

采用双路安捷伦喷射流电喷雾离子源（electrospray ionization，ESI），流动相分流比为1∶3，采用电喷雾正负离子模式进行全扫描；干燥气体积流量为11 L·min^-1；干燥气温度为250 ℃；雾化气压力为241 kPa；毛细管电压为3.5 kV，喷嘴电压为500 V（＋）/1 000 V（－），碎裂电压为380 V；一级扫描范围m/z 100~1 500，二级扫描范围m/z 50~1 200；二级碰撞能量分别为10、20、40 eV。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液

分别精密称取各对照品适量，置于2.5 mL量瓶中，加入体积分数50%甲醇溶解并定容至刻度，得各对照品储备液。分别吸取各对照品储备液适量，置于5 mL量瓶中，加入体积分数50%甲醇溶液定容至刻度，制成质量浓度均为100 μg·mL^-1的混合对照品溶液，经0.22 μm微孔滤膜过滤后，于4 ℃冰箱中保存。

2.2.2 供试品溶液

将JWXYP粉碎研细后过3号筛，取粉末约1 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密量取10 mL含体积分数0.5%氨水的体积分数50%甲醇溶液，称定质量，超声处理30 min，放冷后以体积分数50%甲醇补足减失质量，摇匀，以12 000 r·min^-1离心10 min，取上清1 mL，真空浓缩至干，加入1 mL体积分数50%甲醇复溶，经0.22 μm微孔滤膜过滤，即得质量浓度为100 mg·mL^-1的供试品溶液。

2.2.3 单味药材饮片溶液

取各单味药材饮片，按照2.2.2项下方法制备单味药材饮片溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度实验

取样品（S1）适量，精密称定，按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，按照2.1.1项下色谱条件连续进样测定6次，以栀子苷为参照峰，测得各成分共有峰保留时间、相对峰面积的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）均在0.23%~3.94%之间，表明仪器的精密度良好。

2.3.2 重复性实验

取样品（S1）适量，精密称定，按照2.2.2项下方法平行制备6份供试品溶液，按照2.1.1项下色谱条件进样测定，以栀子苷为参照峰，测得各成分共有峰保留时间、相对峰面积的RSD均在1.45%~3.48%之间，表明该方法的重复性良好。

2.3.3 稳定性实验

取样品（S1）适量，精密称定，按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、6、9、12、24 h按照2.1.1项下色谱条件进样测定，以栀子苷为参照峰，测得各成分共有峰保留时间、相对峰面积的RSD均在0.24%~3.43%之间，表明样品在24 h内稳定性良好。

2.4 JWXYP指纹图谱的研究

2.4.1 指纹图谱的建立及相似度分析

取15批样品（S1~S15）适量，精密称定，按照2.2.2项下方法分别制备供试品溶液，按照2.1.1项下色谱条件进样测定，将所得各色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版），以S1样品图谱为参照图谱，采用中位数法，设定时间窗宽度为0.10 min，对色谱峰进行多点校正后自动匹配，生成对照指纹图谱，见图1。通过对15批次JWXYP样品指纹图谱分析，根据峰面积占比共标定1~27号峰为JWXYP指纹图谱的共有峰。15批JWXYP样品（S1~S15）的指纹图谱与对照指纹图谱（R）自动匹配，其相似度范围为0.997~0.999，表明15批样品的制备工艺稳定，批间一致性良好。

2.4.2　共有峰的药材归属 对指纹图谱色谱峰进行药材来源归属，对标定的27个共有峰进行归属和指认，结果见表1，各共有峰与单味药材的对比见图2。

2.4.3 共有峰的指认

为进一步明确27个共有峰对应的成分，采用液相色谱-四极杆-飞行时间质谱联用（liquid chromatography-quadrupole-time of flight-mass spectrometry，LC-Q-TOF-MS）技术，结合2.1.1项下色谱条件与2.1.2项下质谱条件对其进行分析鉴定。通过与对照品比对，确定其中13个共有峰对应的成分；进一步通过分析质谱裂解信息和紫外吸收波长，结合相关文献报道数据，推断出其余14个共有峰对应的成分。样品在正负离子模式下的总离子流色谱图（total ion chromatogram，TIC）见图3，共有峰鉴定结果见表1。

表 1　JWXYP指纹图谱中27个共有峰的鉴定及归属

Tab.1 Identification of 27 common peaks in JWXYP fingerprints and their corresponding sources

2.5 JWXYP特征指标成分含量的测定

2.5.1 对照品溶液的制备

取各对照品适量，精密称定，分别置于2.5 mL量瓶中，加入体积分数50%甲醇溶解并定容至刻度，制成氧化芍药苷、京尼平龙胆双糖苷、栀子苷、芍药苷、丹皮酚、甘草酸、柴胡皂苷A、柴胡皂苷D质量浓度分别为 2.50、0.50、1.50、2.50、2.50、2.50、0.20、0.20 mg·mL^-1的对照品储备溶液，经0.22 μm微孔滤膜过滤后，于4 ℃冰箱中保存备用。

2.5.2 系统适应性考察

精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液、空白溶剂（体积分数50%甲醇）各10 μL，按照2.1.1项下色谱条件进样分析，结果见图4。供试品溶液在与氧化芍药苷（峰6）、京尼平龙胆双糖苷（峰7）、栀子苷（峰8）、芍药苷（峰9）、丹皮酚（峰19）、甘草酸（峰23）、柴胡皂苷A（峰24）、柴胡皂苷D（峰27）对照品相应的保留时间位置上，均出现相同保留时间的色谱峰，且分离度（resolution，R）均大于1.5；空白溶剂无相应色谱峰，对测定无干扰。

2.5.3 线性关系及检出限、定量限的考察

分别精密吸取2.5.1项下对照品储备溶液适量，按一定比例梯度稀释成7个不同质量浓度的混合对照品溶液，按照2.1.1项下色谱条件进样测定。以对照品质量浓度为横坐标（x），峰面积为纵坐标（y），绘制标准曲线，计算回归方程及相关系数（r），结果见表2。结果显示，各对照品在相应质量浓度范围内线性关系良好。精密吸取对照品溶液，逐级稀释后进样测定，分别以信噪比（signal-to-noise ratio，S/N）=3和S/N=10计算8个对照品的检出限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantification，LOQ）。见表2。

2.5.4 精密度实验

取样品（S1）适量，精密称定，按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，按照2.1.1项下色谱条件连续进样测定6次，测得氧化芍药苷、京尼平龙胆双糖苷、栀子苷、芍药苷、丹皮酚、甘草酸、柴胡皂苷A、柴胡皂苷D的峰面积RSD分别为1.19%、0.65%、0.23%、1.66%、0.44%、0.38%、3.02%、1.65%，均小于5%，表明仪器的精密度良好。

2.5.5 重复性实验

取样品（S1）适量，精密称定，按照2.2.2项下方法平行制备6份供试品溶液，按照2.1.1项下色谱条件进样测定，测得氧化芍药苷、京尼平龙胆双糖苷、栀子苷、芍药苷、丹皮酚、甘草酸、柴胡皂苷A、柴胡皂苷D的峰面积RSD分别为3.42%、3.16%、1.82%、2.42%、2.34%、2.36%、3.40%、4.23%，均小于5%，表明该方法的重复性良好。

2.5.6 稳定性实验

取样品（S1）适量，精密称定，按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、6、9、12、24 h按照2.1.1项下色谱条件进样测定，测得氧化芍药苷、京尼平龙胆双糖苷、栀子苷、芍药苷、丹皮酚、甘草酸、柴胡皂苷A、柴胡皂苷D的峰面积RSD分别为4.06%、1.11%、0.24%、2.37%、0.69%、0.37%、4.63%、3.30%，均小于5%，表明样品溶液在24 h内稳定性良好。

2.5.7 加样回收率实验

取各成分含量已知的样品（S1）约1 g，精密称定，按100%水平精密加入对照品溶液，按照2.2.2项下方法平行制备6份供试品溶液，按照2.1.1项下色谱条件下进样测定，计算各成分的加样回收率。结果显示，氧化芍药苷、京尼平龙胆双糖苷、栀子苷、芍药苷、丹皮酚、甘草酸、柴胡皂苷A、柴胡皂苷D的平均加样回收率分别为94.12%、92.76%、91.90%、97.71%、90.26%、101.2%、98.75%、101.4%，均处于规定标准范围内，表明该含量测定方法的准确度良好。

2.5.8 样品含量测定

取15批样品，按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，按照2.1.1项下色谱条件进样测定，计算各指标成分的含量。见表3。

2.5.9 15批次制剂中8种成分含量一致性的分析

JWXYP中8种指标性成分含量存在一定差异，因此本实验将各成分含量转换为P值，通过相同水平比较不同成分P值的波动情况，分析各成分在批次间的含量一致性。P值计算公式为P＝C_A/C_B，其中C_A为每批制剂中各成分的含量，C_B为15批次制剂中对应成分的平均含量。将15批次制剂中8种成分的P值导入SPSS 19.0软件进行统计分析，结果见图5。成分P值越接近100%，表明该成分在不同批次间的含量差异越小。本实验规定，批次间成分含量波动上下限在75%~125%范围内为可接受，在90%~110%范围内为波动较小。此外，统计分析结果显示，15批次制剂中8种成分含量的RSD均小于15.00%，各成分含量一致性均符合要求，与箱线图分析结果一致。结合不同批次间主要成分含量对比及指纹图谱相似度分析结果，表明15批次JWXYP样品中各成分含量一致性良好。

3 讨论

3.1 供试品溶液制备方法的选择

JWXYP为水泛丸，是将药物细粉以姜汁为黏合剂制备而成，其制剂工艺未经过提取、浓缩等步骤，因此选择适宜的提取方法和提取溶剂，确保各成分充分溶出，是保障实验结果可靠性的关键。本研究针对柴胡皂苷类成分提取率偏低的问题，对提取溶剂体系进行了系统优化。通过对比加热回流与超声提取两种方法、不同比例甲醇/乙醇溶剂及不同提取时间发现，常规溶剂（体积分数50%的甲醇/乙醇）及提取参数的改变，对提高柴胡皂苷溶出效率的作用有限。基于《中国药典》（2025年版）中柴胡皂苷的氨化甲醇提取方法，进一步考察了不同体积分数氨水（0.1%~25.0%）对成分溶出与稳定性的影响。结果表明，低体积分数氨水（0.5%）可显著提高柴胡皂苷的峰面积（较无氨水条件增加4倍），同时避免芍药苷、1，2，3，4，6-没食子酰葡萄糖等糖苷类成分发生碱性降解，并对其产生促溶出作用（较无氨水条件增加0.15倍）；而高体积分数氨水（>5%）虽能促进柴胡皂苷溶出，却会导致其自身水解及其他活性成分破坏。最终确定采用含体积分数0.5%氨水的体积分数50%甲醇溶液超声提取30 min为最优供试品制备方案，该方案可在保障柴胡皂苷高效溶出的同时，维持多类型成分的稳定性，成功解决皂苷类与糖苷类成分共存体系的提取兼容性难题。

3.2 色谱条件的选择

通过对比不同色谱柱的分离性能发现，核壳型Poroshell 120 EC-C₁₈色谱柱（100 mm×4.6 mm，2.7 μm）在保证各成分分离度的前提下，较传统C₁₈柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）的分析时间缩短31.6%（65 min vs. 95 min）。该色谱柱采用表面多孔填料设计，兼有高柱效与低背压的优势^［15］，可适配常规HPLC系统，实现多成分的快速分离。在此基础上，本研究采用PDA与ELSD双检测器联用策略，PDA检测器在254 nm波长处可有效捕获酚酸类、环烯醚萜类等具共轭结构的成分，ELSD检测器则突破紫外吸收限制，成功检测柴胡皂苷A等弱紫外吸收成分。二者协同构建的双检测器指纹图谱，覆盖的成分类型更为广泛，较单一检测模式能有效实现君药柴胡指标性成分的测定。通过光谱信号与光散射信号的互补，实现了中药复方中极性跨度大、吸光特性差异显著成分的同步检测，为建立JWXYP“成分-功效”关联的质量评价体系提供了技术支撑。

3.3 检测成分的选择

本研究选取的8种指标成分，兼具质量标志物与功效物质的双重属性：其总峰面积占比达60%，构成了制剂化学物质基础的主体；相关文献证实，该8种成分具有抗抑郁、神经内分泌调节及抗炎等与JWXYP主治功效相关的核心活性^［16-23］，且覆盖了君药（柴胡）、臣药（牡丹皮、栀子）及佐使药（白芍、甘草）的药典质控成分。检测成分的选择综合考虑了成分含量与药效活性，兼顾了处方中的君臣佐使各药味的质量表征。综上所述，确定柴胡皂苷A、柴胡皂苷D、芍药苷、氧化芍药苷、丹皮酚、栀子苷、京尼平龙胆双糖苷和甘草酸为本次实验的主要检测成分。

3.4 指纹图谱及多成分含量测定结果的分析

本研究首次建立了JWXYP的HPLC-PDA-ELSD联用的指纹图谱结合多指标成分定量方法，通过改进提取方法与双检测器联用，协同实现了紫外强吸收成分（酚酸类、单萜苷类）与弱吸收成分（三萜皂苷类）的同步检测，减少了“检测盲区”。构建的双检测器指纹图谱共覆盖27个特征峰，15批次样品指纹图谱相似度均>0.997，结合双维度数据交叉验证，提升了共有峰归属的特异性。定量测定结果显示，8种指标性成分在15批次样品种的平均含量依次为：栀子苷（7.048 mg·g^-1）>芍药苷（6.314 mg·g^-1）>京尼平龙胆双糖苷（2.101 mg·g^-1）>甘草酸（1.930 mg·g^-1）>丹皮酚（1.815 mg·g^-1）>柴胡皂苷A（0.807 mg·g^-1）>柴胡皂苷D（0.676 mg·g^-1）>氧化芍药苷（0.469 mg·g^-1），统计分析结果表明各成分批次间一致性良好。该方法突破了单一检测模式的局限，通过“双检测器指纹表征-多成分定量”的双层级质控策略，为中药复方质量标准的提升提供了兼具系统性与专属性的技术参考。

4 小结

本研究建立了JWXYP HPLC-PDA-ELSD联用的指纹图谱，实现了吸光特性差异显著成分的同步检测（PDA检测器捕获酚酸类、环烯醚萜类等紫外强吸收成分，ELSD检测器突破检测限制，覆盖柴胡皂苷类弱紫外吸收成分），并对其中8种与功效活性相关的指标成分进行了多成分定量方法研究。采用含体积分数0.5%氨水的体积分数50%甲醇溶液超声提取，实现了柴胡皂苷溶出率的提升与糖苷类成分的稳定性保护。提出“双检测器指纹表征-功效成分定量”的双层级质控策略，通过指纹图谱提供制剂整体物质基础信息，多成分定量聚焦关键成分的质量属性，二者通过双检测器数据交叉验证，增强了方法的专属性。该策略结合改良后的提取方法，可显著减少检测盲区，实现中药质量控制从“单一成分控制”转向“成分-功效整体质控”的转变，为JWXYP整体质量标准的提升提供了实验参考。

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基金资助

国家自然科学基金面上项目(8217142005)

北京中医药大学横向科研基金项目(BUCM-2023-JS-FW-195)

北京中医药大学新教师启动基金项目(2025-JYB-XJSJJ-016)