地龙黄芪方对酒精性肝损伤的保护作用及机制

Protective effect and mechanism of Earthworm-astragalus Formula on alcoholic liver injury

摘要

目的 基于“中药吃干榨尽”理念，将地龙蛋白提取副产物乙醇上清液与黄芪进行配伍，制备地龙黄芪方，系统评价其对酒精性肝损伤的抑制作用，并探究其潜在作用机制。 方法 按地龙副产物与黄芪1∶40的比例混合制备地龙黄芪方，采用液质联用技术对其化学成分进行鉴定。通过乙醇脱氢酶激活实验、自由基清除实验评估其体外抗氧化活性；利用酒精损伤细胞模型和小鼠急性酒精性肝损伤模型，观察该方对细胞活力、谷胱甘肽耗竭、肝功能及肝组织病理形态的改善作用，采用蛋白质印迹法和定量逆转录聚合酶链式反应（quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR）技术分析其潜在作用机制。 结果 从地龙黄芪方中鉴定出17种蛋白质和49种小分子成分。该方可有效激活乙醇脱氢酶活性，清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）和过氧化氢（hydrogen peroxide，H₂O₂）；在细胞及动物模型中均能显著减轻酒精诱导的肝损伤，抑制谷胱甘肽耗竭，改善肝功能指标与肝组织病理损伤，其作用机制与下调以下蛋白或基因的表达密切相关：抗氧化相关的缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）、血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA），以及抗炎相关的核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）。 结论 地龙黄芪方可通过调控HIF-1α/NF-κB信号通路相关蛋白及基因的表达，抑制氧化应激反应与炎症反应，进而缓解酒精性肝损伤。为地龙蛋白提取副产物的高值化利用和相关护肝产品的开发提供了实验依据。

Abstract

Objective Based on the concept of “exhaustive utilization of Chinese medicinal materials”， the ethanol supernatant， a by-product of earthworm protein extraction， was combined with Astragalus membranaceus to prepare the Earthworm-astragalus Formula （EAF）. The protective effect of EAF against alcoholic liver injury was systematically evaluated， and its potential mechanism of action was explored. Methods EAF was prepared by mixing the earthworm by-product and Astragalus membranaceus at a ratio of 1∶40. Its chemical components were identified using liquid chromatography-mass spectrometry. The in vitro antioxidant activity was assessed through alcohol dehydrogenase activation and free radical scavenging assays. By using an alcohol-induced cell injury model and a mouse model of acute alcoholic liver injury， the effects of EAF on cell viability， glutathione depletion， liver function， and hepatic histopathology were observed. Western blotting and quantitative reverse transcription polymerase chain reaction （qRT-PCR） were used to analyze the potential mechanism of action. Results Seventeen proteins and 49 small-molecule components were identified from EAF. EAF effectively activated alcohol dehydrogenase activity and scavenged 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl （DPPH） and hydrogen peroxide （H₂O₂）. In both cell and animal models， EAF significantly alleviated alcohol-induced liver injury， inhibited glutathione depletion， and improved liver function indicators and hepatic histopathological damage. Its mechanism of action was closely related to the downregulation of antioxidant-related ［hypoxia-inducible factor-1α （HIF-1α）； vascular endothelial growth factor A （VEGFA）］ and anti-inflammatory-related ［nuclear factor κB （NF-κB）； interleukin-6 （IL-6）； tumor necrosis factor-α （TNF-α）］ proteins or genes. Conclusion EAF can alleviate alcoholic liver injury by regulating the expression of proteins and genes related to the HIF-1α/NF-κB signaling pathway， thereby inhibiting oxidative stress and inflammatory responses. This study provides an experimental basis for the high-value utilization of by-products from earthworm protein extraction and the development of related hepatoprotective products.

Graphical abstract

关键词

地龙黄芪方 / 酒精性肝损伤 / 缺氧诱导因子-1α/核因子κB信号通路 / 地龙副产物 / 作用机制

Key words

Earthworm-astragalus Formula （EAF） / alcoholic liver injury / hypoxia-inducible factor-1α/nuclear factor κB signaling pathway / earthworm by-product / mechanism of action

酒精性肝病（alcohol-related liver disease，ALD）是因长期过量饮酒引发的肝脏疾病^［1］。有研究指出，该病在全球范围内发病率持续处于较高水平^［2］。从作用机制来看，急性酒精摄入会引发多种应激反应和炎症损伤，包括氧化应激、硝化应激、内质网应激及细胞凋亡等病理过程^［3］。酒精在肝脏代谢过程中产生的乙醛等有害物质，可触发炎症反应链，进而损伤肝组织^［4-5］。同时，其可导致活性氧和脂质过氧化物异常堆积，增加线粒体代谢压力，引发脂肪代谢紊乱和肝脏过度炎症反应^［6-7］。ALD作为全球慢性肝病的主要诱因之一，若未及时干预，可进一步进展为脂肪肝、肝纤维化甚至肝癌^［8］。因此，在肝病早期实施有效干预具有重要意义。

地龙是中医常用药材，性寒味咸，归脾、肝、膀胱经，常用于镇惊、通络、平喘及利水。研究表明，地龙包含蛋白质类、酶类、氨基酸类、核苷类、脂类及微量元素等多种化学成分^［9-15］。目前工业化生产过程中主要聚焦于蚓激酶等蛋白质的提取，而提取后约70%的副产物（含未充分提取的蛋白质和小分子物质）尚未得到有效利用^［16］。基于地龙“归肝经”的中医理论，上述副产物可能对肝脏具有潜在的保护作用。补阳还五汤是治疗气虚血瘀型中风后遗症的经典方剂，其中黄芪具有补气的功效，地龙具有活血通络的作用。两药配伍既能调和地龙的寒性，又能维持其通络化瘀的功效^［17］。现代研究已将该方剂应用于动脉硬化、脑卒中等的治疗^［18］，且其在慢性肾小球肾炎、脂肪肝及肝纤维化等疾病中也展现出一定的治疗效果^［19-20］。

为积极响应“中药资源循环利用策略”，将中药资源产业化各环节产生的未被有效利用的“废弃物”纳入循环利用体系，实现资源吃干榨尽、物尽其用^［21］。本研究拟将地龙副产物与黄芪配伍，探究该配伍在ALD治疗中的药理作用及相关机制。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Fresco 21型高速冷冻离心机、UHPLC-Q-Exactive Ultimate 3000型超高效液相色谱-四极杆-静电轨道场离子阱质谱，均购自美国赛默飞世尔科技有限公司；Multiskan GO型酶标仪（芬兰热电科技仪器有限公司）；AH480型全自动生化分析仪（美国贝克曼库尔特有限公司）；SWE-FP型研磨机（武汉赛维尔生物科技有限公司）；ChemiDoc MP Imaging System型多功能凝胶成像系统、T100 Thermal Cycler型聚合酶链式反应仪，均购自上海伯乐生命医学产品有限公司。

1.2 试药

乙腈（色谱纯，美国赛默飞世尔科技有限公司）；甲酸（色谱纯，上海西格玛奥德里奇贸易有限公司）；超纯水（广州屈臣氏食品饮料有限公司）；红星二锅头（清香型，规格为100 mL，酒精度56%vol）；焦磷酸钠缓冲液（pH=8.8，赛维尔生物科技有限公司）；过氧化氢溶液（分析纯，国药集团化学试剂有限公司，批号10011218）；乙醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase，ADH，批号S10110）、氧化性辅酶Ⅰ（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NAD⁺，批号R38011）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH，批号S30629）、硫酸亚铁（批号T20691）；水杨酸（批号S24100），均购自上海源叶生物科技有限公司；细胞增殖及毒性检测试剂盒（cell counting kit-8，CCK-8，批号MA0218-3，大连美仑生物技术有限公司）；还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）测定试剂盒（批号A006-2-1，南京建成生物工程研究所）；水飞蓟宾胶囊（国药准字H20049299，天津天士力圣特制药有限公司）；缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）抗体（批号20960-1-AP）、核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）抗体（批号80979-1-RR）、白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）抗体（批号21865-1-AP）、β-肌动蛋白（β-actin）抗体（批号66009-1-Ig），均购自武汉三鹰生物技术有限公司。

1.3 实验动物

C57BL/6雄性小鼠，8周龄，体质量为20~22 g，购自北京斯贝福生物科技有限公司。小鼠饲养于屏障环境动物房内，温度为（22±2） ℃，相对湿度为40%~70%，12 h/12 h明暗交替照明，自由摄食与饮水，适应性饲养3 d后开始实验。

1.4 细胞

人肝癌细胞（human hepatocellular carcinomas，HepG2）购自北京中生奥邦生物科技有限公司（货号：06.0060），实验所用细胞经短串联重复序列（short tandem repeat，STR）鉴定，结果与标准细胞系数据库一致，证明其身份正确、无交叉污染。实验所用细胞传代代数为5~10代。

2 方法

2.1 地龙黄芪方样品的制备

选取地龙蚓激酶蛋白制备过程中产生的乙醇上清液部分^［22］，按1∶40（m/V）比例与黄芪混合后静置16 h^［23］。以6 000 r·min^-1离心15 min，收集上清液，经减压浓缩后，用蒸馏水稀释为2.4、1.2、0.6 mg·mL^-1 3个质量浓度，分别作为地龙黄芪方高、中、低质量浓度组。

2.2 地龙黄芪方中蛋白质类成分的鉴定

2.2.1 色谱条件

采用Acclaim PepMapTM RSLC C₁₈色谱柱（50 μm × 150 mm，2 μm），以含体积分数0.1%甲酸水溶液（A）-含体积分数0.1%甲酸的体积分数80%乙腈溶液（B）为流动相，梯度洗脱；流速为0.3 μL·min^-1；进样量为1 μL；柱温为35 ℃；液相色谱柱用体积分数92%的A液进行平衡。梯度洗脱程序：0~98 min，8% B→28% B；98~113 min，28% B→37% B；113~117 min，37% B→100% B；117~120 min，100% B；121~126 min，100% B→8% B。

2.2.2 质谱条件

酶解产物经液相色谱分离后进行质谱分析，分析时间为120 min；检测方式为正离子模式；扫描范围为m/z 400~1 800；一级分辨率为60 000，二级分辨率为15 000；碰撞能为28 eV。

2.2.3 数据处理

质谱原始数据使用Proteome Discoverer 2.5软件进行蛋白模拟碎裂、理论肽段匹配等处理，根据爱胜蚯蚓属蛋白数据库进行蛋白鉴定，并在表格中标注样本中肽段可信度。参考标准如下：High表示高可信度；Peak Found表示二级谱图可检测其峰值；Not Found表示二级谱图未检测到。

2.3 地龙黄芪方中小分子类成分的鉴定

2.3.1 色谱条件

采用Waters UPLC BEH C₁₈色谱柱（2.1 mm×150 mm，1.7 μm），以乙腈（A）-含体积分数0.1%甲酸水溶液（B）为流动相；流速为0.3 mL·min^-1；进样量为10 μL；柱温为35 ℃；以5%的A液进行平衡。梯度洗脱程序为：0~5 min，95% B；5~30 min，95% B→10% B；30~35 min，10% B；35~36 min，10% B→95% B；36~40 min，95% B。

2.3.2 质谱条件

采用电喷雾电离源（electrospray ionization，ESI），扫描模式设置为全扫描；同时以正、负离子模式扫描，扫描范围为100~1 500 m/z；毛细管温度为320 ℃；汽化温度为400 ℃；喷雾电压为3.5 kV（正离子）和-3 kV（负离子）；鞘气流速为35 L·min^-1，辅助气流速为10 L·min^-1。

2.4 ADH激活法检测地龙黄芪方的体外酒精代谢能力

参照文献^［24］中方法进行操作，在反应管中依次加入1.5 mL焦磷酸钠缓冲液、1.0 mL NAD⁺溶液和0.1 mL样品溶液（二锅头或地龙黄芪方），混匀后置于25 ℃反应5 min；随后加入0.1 mL ADH溶液，混匀后立即测定340 nm波长处的吸光度值A，5 min后再次测定，两次吸光度的差值记为A₁，反映NAD⁺还原情况。对照组以等量去离子水替代样品溶液，吸光度变化值记为A₀，计算ADH激活率。ADH激活率（%）＝［（A₁-A₀）/A₀］×100%。每组实验均重复3次。

2.5 DPPH清除法检测地龙黄芪方的抗氧化能力

参考文献^［25］中的方法，准确称取DPPH粉末20 mg，置于干燥烧杯中，加入无水乙醇搅拌溶解后，转移至250 mL量瓶中，用无水甲醇定容至刻度，即得2×10^-4 mol·L^-1 DPPH溶液。

采用96孔板实验，分为空白组、样品组、DPPH组，每组设置3个重复孔。空白组加入200 µL无水乙醇，DPPH组加入100 µL无水乙醇和 100 µL DPPH溶液，样品组加入100 µL样品（二锅头或地龙黄芪方）及100 µL DPPH溶液。加样完毕后，将96孔板置于酶标仪中，振荡混匀，室温避光反应30 min，于517 nm波长处测定吸光度值A，分别记录空白组A₀、样品组Aₜ、DPPH组A₁，计算DPPH自由基清除率。DPPH自由基清除率（%）＝［1-（A_t-A₀）/A₁］×100%。

2.6 水杨酸法检测地龙黄芪方的抗氧化能力

参考文献^［26］中的方法，向试管中依次加入3 mL硫酸亚铁溶液、3 mL水杨酸溶液、3 mL样品（二锅头或地龙黄芪方）溶液，再加入3 mL过氧化氢（hydrogen peroxide，H₂O₂）溶液启动反应；混匀后37 ℃反应30 min，冷却至室温，于510 nm波长处测定吸光度值A，记为A₁。以去离子水替代样品溶液测得A₀；以去离子水替代H₂O₂溶液测得A₂，计算羟基自由基清除率。羟基自由基清除率（%）＝［1-（A₁-A₂）/A₀］×100%。

2.7 地龙黄芪方体外抗酒精性肝细胞损伤能力及抵抗细胞GSH耗竭能力的评价

2.7.1 细胞培养条件

选取HepG2，使用含体积分数10%胎牛血清和体积分数1%青霉素-链霉素双抗的杜氏改良eagle培养基（Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM），于37 ℃、含体积分数5% CO₂培养箱中培养。

2.7.2 CCK-8检测细胞生存率

将HepG2细胞以5×10³个·孔^-1的密度接种于96孔板中，每孔加入100 μL培养基，培养24 h使细胞贴壁。将细胞分为5组：空白组（KB组）、模型组（MX组）、低质量浓度组（D组，0.6 mg·mL^-1）、中质量浓度组（Z组，1.2 mg·mL^-1）、高质量浓度组（G组，2.4 mg·mL^-1）。吸弃原培养基后分组处理：KB组加入200 μL新鲜培养基；MX组加入200 μL含体积分数56%乙醇的培养基；D组、Z组、G组分别加入100 μL含体积分数56%乙醇的培养基及100 μL对应质量浓度的地龙黄芪方溶液。37 ℃培养24 h后，每孔加入10 μL CCK-8试剂，继续反应1 h，酶标仪测定450 nm波长处的吸光度值（A）。每组实验均重复3次。

2.7.3 细胞GSH含量的测定

细胞分组及培养操作同2.7.2项，采用GSH含量测定试剂盒，取细胞上清液20 μL加入96孔板中，依次加入试剂一应用液、试剂二、试剂三和试剂四，混匀后室温静置5 min。使用酶标仪在420 nm波长处测定各孔吸光度（A），每组实验均独立重复3次。

2.8 实验动物造模、分组与给药

参照文献^［27-30］中的方法建立急性酒精性肝损伤小鼠模型。选取8周龄雄性C57BL/6小鼠，适应性喂养3 d后随机分为6组，每组5只，分别为空白组（KB组）、模型组（MX组）、阳性药水飞蓟宾组（Y组）、低质量浓度组（D组，0.6 mg·mL^-1）、中质量浓度组（Z组，1.2 mg·mL^-1）、高质量浓度组（G组，2.4 mg·mL^-1）。

KB组每日灌胃蒸馏水（0.01 mL·g^-1）；其余各组每日灌胃56%vol红星二锅头（0.01 mL·g^-1）以诱导肝损伤。各治疗组在灌胃酒精后1 h给予相应药物：Y组灌胃水飞蓟宾溶液（按人与小鼠等效剂量比值9.1换算，每日剂量为0.031 85 mg·g^-1，用蒸馏水配制成3.185 mg·mL^-1，灌胃体积0.01 mL·g^-1）；D、Z、G组分别灌胃质量浓度为0.6、1.2、2.4 mg·mL^-1的药液，灌胃体积均为0.01 mL·g^-1；MX组在灌胃酒精后灌胃等体积蒸馏水。连续干预14 d，每2 d称量一次体质量，观察小鼠饮酒后的行为状态。

第14天给药后，小鼠禁食、自由饮水。末次给药12 h后称定质量并麻醉，采集全血，置于1.5 mL离心管中。采血后处死小鼠，分离心、肝、脾、肺、肾等脏器，称量肝脏湿质量并计算肝脏指数。肝脏指数（%）＝（肝脏湿质量/体质量）×100%。取部分肝组织置于-80 ℃冰箱中保存，剩余部分及其他脏器置于体积分数4%多聚甲醛中固定。以MX组小鼠血清丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）水平显著高于KB组，且肝组织病理切片出现明显空泡变性和脂肪沉积，作为酒精性肝损伤模型构建成功的判定标准。

2.9 血清生化指标的检测

全血置于4 ℃静置2 h后，以3 000 r·min^-1离心10 min，收集血清。使用全自动生化分析仪检测相关血清生化指标，数据进行统计学分析。

2.10 脏器组织病理检查

采用苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色、油红O染色观察脏器组织病理变化，每组3只小鼠。肝脏经体积分数4%多聚甲醛固定后，石蜡包埋、切片、脱蜡、水化，染色、脱水封片，显微镜下镜检并采集图像；油红O染色面积采用Image Lab软件统计分析。

2.11 肝脏蛋白表达情况的检测

每组5只小鼠，分别取50 mg肝组织，加入500 μL裂解缓冲液，按照100︰1比例加入磷酸酶抑制剂，匀浆后于4 ℃下以12 000 r·min⁻¹离心10 min，收集上清液并测定蛋白浓度。按比例加入5×上样缓冲液，95 ℃变性10 min。冷却至室温后进行凝胶电泳、转膜。依次进行一抗（4 ℃孵育过夜）、二抗（室温孵育2 h）孵育。采用Image Lab软件分析目的条带灰度值，并进行统计学分析。

2.12 肝脏相关基因表达情况的检测

采用定量逆转录聚合酶链式反应（quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR）法测定缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）、核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）基因的表达水平，每组3只小鼠。cDNA操作条件：50 ℃退火10 min，85 ℃延伸5 s，制备完成后置于-80 ℃保存。qPCR反应条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性10 s， 60 ℃退火30 s，循环40次。熔解曲线程序采用仪器默认设置。统计各基因循环阈值（cycle threshold，CT），计算相对表达量。引物信息见表1。

2.13 统计学方法

采用GraphPad Prism 8软件对数据进行处理。多组间首先进行单因素方差分析（One-way ANOVA）进行整体比较。若方差分析提示差异有统计学意义，则进一步采用最小显著性差异法（LSD法）进行两两比较。P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 地龙黄芪方中蛋白质类成分的鉴定

采用超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱联用技术（ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole/electrostatic field Orbitrap high resolution mass spectrometry，UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS）对地龙黄芪方进行蛋白质类成分鉴定，共检测到17种来源于爱胜蚓属的蛋白质类成分，包括与凝血相关的溶血纤维蛋白酶、蚓激酶，与抗氧化相关的过氧化氢酶，以及与代谢相关的甘油醛-3-磷酸脱氢酶、α-淀粉酶等。见表2。

3.2 地龙黄芪方中小分子类成分的鉴定

采用UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS技术对地龙黄芪方进行小分子类成分鉴定，共检出49种活性成分，其中地龙来源31种、黄芪来源18种。地龙来源成分包括氨基酸类（如赖氨酸、苯丙氨酸等）、核苷类（如次黄嘌呤、腺嘌呤、腺苷等）、不饱和脂肪酸类（如亚油酸等），此类成分可清除自由基、改善线粒体代谢；黄芪来源成分包括黄酮类（毛蕊异黄酮苷、芒柄花素）和皂苷类（黄芪甲苷Ⅵ），均已被证实具有较强的抗氧化与抗炎作用^［31］。见表3。

表3　地龙黄芪方小分子成分的鉴定结果

Tab.3 Identification results for small molecule components in Earthworm-Astragalus Formula (EAF)

表3（续）　地龙黄芪方小分子成分鉴定结果

Tab.3(Continued) Identification results for small molecule components in Earthworm-Astragalus Formula (EAF)

3.3 地龙黄芪方对体外酒精代谢能力的影响

与对照组比较，地龙黄芪方各质量浓度均显著促进ADH激活（P<0.01），并呈现质量浓度依赖性增强，最高激活率达到16%左右。见图1A。

3.4 地龙黄芪方对体外自由基清除能力的影响

不同质量浓度的地龙黄芪方在清除DPPH自由基和H₂O₂方面均显著高于对照组（P<0.05或P<0.01），且清除效果随质量浓度增加而增强，最高清除率接近1。见图1B~图1C。

3.5 地龙黄芪方对酒精性损伤HepG2细胞生存率的影响

经过地龙黄芪方处理后的细胞存活率均显著高于MX组（P<0.01）。D组细胞存活率恢复至正常范围，Z组、G组则表现出更强的促进肝细胞存活能力。见图2A。

3.6 地龙黄芪方对酒精性损伤HepG2细胞内GSH含量的影响

D组细胞内GSH含量与MX组无显著差异；随着给药质量浓度的增加，细胞内GSH水平逐步上升，Z组、G组的GSH含量均显著高于MX组（P<0.01）。这表明地龙黄芪方能够通过提高肝细胞内GSH含量，抵抗由酒精引起的活性氧积累，维持体内氧化还原稳态平衡。见图2B。

3.7 地龙黄芪方对酒精性肝损伤小鼠肝脏的影响

动物造模过程中，KB组、Y组和G组小鼠体质量持续增长，Z组体质量保持稳定，D组与MX组体质量下降，其中MX组下降幅度最为明显，表明酒精对小鼠整体健康存在明显伤害。各治疗组在药物干预后均出现好转情况，同时G组与Y组体质量增长趋势一致，表明此方具有一定缓解酒精性肝损伤的疗效。脏器方面，MX组小鼠肝脏组织外观可见明显红肿，且其肝脏指数显著高于KB组（P<0.01），表明酒精性肝损伤小鼠模型建构成功，提示摄入酒精后肝脏出现脂肪沉积及组织水肿现象。各治疗组的肝脏指数较MX组显著降低（P<0.05和P<0.01），且地龙黄芪方初步呈现质量浓度依赖性。表明地龙黄芪方同水飞蓟宾能够降低酒精模型小鼠的肝脏指数，有效缓解肝脏水肿及损伤情况。见图3。

3.8 地龙黄芪方对酒精性肝损伤小鼠肝组织的影响

HE染色结果显示，KB组肝细胞结构排列整齐，胞质均匀，核仁清晰可见；MX组肝细胞排列紊乱（见箭头1），胞质中出现大量空泡。部分细胞皱缩、核固缩或溶解（见箭头2），表明酒精摄入已造成实质性肝细胞损伤。Y组基本无空泡，且细胞边界明显，胞质清晰可见。D组、Z组及G组肝组织空泡化程度随给药质量浓度增加而递减，细胞皱缩情况也明显逐渐减少。表明该方通过抗氧化作用减轻了由酒精引起的肝细胞结构损伤。见图4A。

油红O染色结果表明，MX组肝组织内有大面积深染脂肪滴，着色面积显著大于KB组（P<0.01），反映酒精引起肝脏脂质代谢异常造成脂肪堆积。各治疗组脂肪滴面积明显少于MX组，且D组、Z组及G组油红染色面积呈降低趋势，G组切片中仅见少量细小脂肪滴与Y组相近。表明地龙黄芪方能够有效改善肝脏脂肪积累。见图4B~图4C。

3.9 地龙黄芪方对酒精性肝损伤小鼠肝功能的影响

与KB组比较，MX组血清ALT和AST活性显著升高（P<0.01），反映肝细胞受损严重，表明酒精性肝损伤小鼠模型造模成功。各治疗组ALT和AST活性较MX组均显著降低，且G组与Y组降低水平相近，表明地龙黄芪方能有效改善肝功能，缓解酒精引起的肝细胞损伤与炎症。见图5A~图5B。

血脂检测结果显示，酒精干预引发了小鼠脂代谢紊乱。与MX组比较，各治疗组具有逆转趋势，但只有Z组、G组差异具有统计学意义（见图5C）。上述结果表明酒精负荷可能导致脂质堆积。药物干预后，地龙黄芪方较水飞蓟宾能够显著逆转酒精引起的甘油三酯（triglyceride，TG）升高，这可能是其改善肝脏脂肪代谢的重要体现。

3.10 地龙黄芪方改善酒精性肝损伤的机制研究

MX组肝组织内HIF-1α、NF-κB和IL-6蛋白表达水平均显著高于KB组（P<0.05）。经地龙黄芪方干预后，各蛋白表达量均降低，且G组各蛋白表达量与MX组比较差异均具有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。结果表明该方可能通过调节HIF-1α/NF-κB信号通路，缓解相关氧化应激，抑制酒精激活的炎症因子IL-6，从而发挥肝保护作用。见图6。

在初步发现地龙黄芪方在HIF-1α/NF-κB信号通路具有调节作用后，本研究进一步开展qRT-PCR实验，验证此通路相关基因的表达水平。结果显示，MX组肝组织内HIF-1ɑ、VEGFA、NF-κB和TNF-ɑ基因表达水平均显著高于KB组（P<0.01），表明HIF-1α/NF-κB信号通路出现异常。经地龙黄芪方干预后，HIF-1ɑ和NF-κB基因表达水平下降，且Z组及G组比较差异均有统计学意义（P<0.01），此趋势与蛋白表达下降趋势一致。同时VEGFA和TNF-ɑ分别作为HIF-1ɑ和NF-κB基因的经典下游基因，四者同步下调再一次验证地龙黄芪方通过调节HIF-1α/NF-κB通路发挥肝保护作用。见图7。

4 讨论

本研究首次探讨了地龙副产物与黄芪配伍对ALD的干预作用，结果显示该配伍具有良好的应用前景。地龙副产物为提取蚓激酶等主要蛋白后剩余的组分，其中仍残留多种蛋白质类和酶类。过氧化氢酶可分解过氧化氢，缓解酒精代谢产生的氧化损伤；纤溶酶和蚓激酶作为地龙的主要活性成分，具有抗炎和抗纤维化作用，能够通过影响NF-κB等通路减轻肝脏炎症^［32-33］。热休克蛋白70/60有助于维持肝细胞稳态^［34］；Toll样受体和清道夫受体可能通过调节免疫反应抑制肝脏炎症^［35］。甘油醛-3-磷酸脱氢酶、α-淀粉酶参与糖代谢过程，或通过改善能量代谢减轻由酒精引起的糖原异常^［36］。这些成分共同形成多靶点肝脏保护机制。

从化学组分相互作用的角度进行分析可知，地龙中的过氧化氢酶作为自由基清除剂，可直接中和酒精代谢产生的活性氧；而黄芪黄酮类成分如毛蕊异黄酮可通过激活核因子E2相关因子2/血红素加氧酶-1通路增强细胞的整体抗氧化能力^［37］。二者在抗氧化体系中可能形成“直接-间接”的双重协同机制。此外，地龙中的多不饱和脂肪酸（如亚油酸）具有调节脂代谢与抑制炎症介质生成的作用^［38］，与黄芪皂苷类成分（如黄芪甲苷Ⅵ）在调节脂质积累、抑制肝星状细胞活化方面可能存在协同作用^［39］。在抗炎机制上，地龙蛋白质组分中的纤溶酶、蚓激酶可通过抑制NF-κB信号通路减轻炎症反应；黄芪中的芒柄花素等黄酮类成分也被报道具有类似的NF-κB抑制作用^［40］。二者在抑制关键炎症通路上可能具有协同或增强效应，从而更有效地缓解由酒精诱导的肝脏炎症级联反应。此外，地龙富含小分子氨基酸，其中包括人体必需的8种游离氨基酸，外源补充这些氨基酸也有助于缓解酒精性肝损伤^［41］。综上所述，地龙黄芪方的化学成分在抗氧化、抗炎及调节脂代谢等方面均展现出治疗潜力。且这种由多种活性成分构成的协同作用，可能共同构成了地龙黄芪方缓解酒精性肝损伤的化学物质基础。

药理实验结果表明，地龙黄芪方对酒精性肝损伤具有改善作用。体外实验结果显示，该方能激活ADH并清除自由基，促进酒精代谢和抗氧化。细胞实验中，地龙黄芪方能提高受损肝细胞存活率，增加细胞内GSH含量，维持抗氧化平衡。动物实验进一步研究证实，地龙黄芪方可恢复小鼠体质量，减轻肝脏水肿，降低血清ALT、AST和TG水平，并改善肝细胞空泡化和脂肪堆积，从宏观和微观层面均证明其护肝效果。

机制层面，本研究通过蛋白质印迹与qRT-PCR实验证实，地龙黄芪方能显著下调酒精性肝损伤模型中HIF-1α与NF-κB的表达，并抑制其下游因子VEGFA、TNF-α及IL-6的表达，提示该方可能通过调控HIF-1α/NF-κB信号通路发挥护肝作用。已有研究指出，在酒精性肝损伤过程中，HIF-1α与NF-κB通路之间存在密切的交互作用：ALD主要由长期过量饮酒引起，其核心机制是乙醇及其代谢物对肝脏产生毒性，引发氧化应激、细胞死亡和局部缺氧等问题^［42-43］。缺氧微环境可激活HIF-1α，HIF-1α是调控肝脏脂质代谢的关键因子，能够导致脂肪在肝内异常积聚^［44］。且HIF-1α过度激活会加重缺氧和炎症反应，进而促进NF-κB的核转位与转录活性；NF-κB作为一种调节各种细胞过程的关键转录因子，参与胚胎发育、免疫、凋亡等多种环节。缺血缺氧致使NF-κB活化，诱导相关基因转录和表达，同时激活炎症因子及细胞因子，对HIF-1α调控和炎症反应的持积极反馈，反向上调HIF-1α的表达。且已有研究证实NF-κB抑制剂，如BAY11-7028，可以抑制HIF-1α和VEGFA表达^［45-47］。代表HIF-1α/NF-κB两条通路能够相互促进从而加速疾病进展。本研究观察到HIF-1α与NF-κB在蛋白与基因水平同步下调，提示地龙黄芪方可能同时干预这两个关键节点，打破其恶性循环。相应的，其下游因子VEGFA、TNF-α及IL-6在蛋白与基因层面也呈下降趋势。再次验证地龙黄芪方对HIF-1α/NF-κB信号通路的干预作用，从而能够减轻肝脏代谢负担及脂质堆积。

综上所述，本研究证实地龙黄芪方具有护肝作用，其机制可能与调节HIF-1α/NF-κB通路，从而缓解氧化与炎症应激、避免脂质代谢异常有关。本研究为中药副产物的资源化利用提供了参考，也为开发护肝功能产品提供了新方向。

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基金资助

国家自然科学基金项目(82274082)