制何首乌高效液相色谱指纹图谱的建立及质量控制

Establishment of HPLC fingerprint of processed Polygonum multiflorum for quality control

摘要

目的 建立制何首乌高效液相色谱（high-performance liquid chromatography， HPLC）指纹图谱的质量控制方法。 方法 系统考察提取方式、提取溶剂及提取时间，确定供试品的最佳制备工艺；优化检测波长、梯度洗脱条件等色谱参数，获得最优检测条件，并完成精密度、稳定性、重复性等方法学验证。 结果 对15批制何首乌样品进行测定，采用中药指纹图谱相似度评价系统（2012.0版）进行分析，结果显示，15批样品与对照指纹图谱的相似度均在0.953~1.000之间，表明其质量一致性良好；同时结合测定结果，制订了以2，3，5，4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-d-葡萄糖苷为参比峰的各共有峰相对百分峰面积限度。 结论 建立的制何首乌HPLC指纹图谱质量控制方法操作简便、结果准确可靠，且重复性良好，可全面反映制何首乌的内在质量，为制何首乌的质量控制提供科学依据和实用技术支撑。

Abstract

Objective To establish a quality control method of the high-performance liquid chromatography （HPLC） fingerprint for processed Polygonum multiflorum. Methods The optimal sample preparation procedure was determined through systematic investigation of extraction methods， extraction solvents， and extraction time. Chromatographic parameters， including detection wavelength and gradient elution conditions， were optimized to obtain the best detection conditions. Comprehensive method validation， including precision， stability， and repeatability， was performed. Results Fifteen batches of processed Polygonum multiflorum were analyzed by using the Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprints of Traditional Chinese Medicine （Version 2012.0）. The similarities between the 15 batches and the reference fingerprint ranged from 0.953 to 1.000， indicating good quality consistency. Based on the analytical results， the relative percentage peak area limits for each common peak were established by using 2，3，5，4'-tetrahydroxystilbene-2-O-β-d-glucoside as the reference peak. Conclusion The HPLC fingerprint quality control method for processed Polygonum multiflorum established in this study is simple， accurate， reliable， and reproducible. It can comprehensively reflect the intrinsic quality of processed Polygonum multiflorum and provide scientific basis and practical technical support for quality control of processed Polygonum multiflorum.

Graphical abstract

关键词

制何首乌 / 高效液相色谱（HPLC）指纹图谱 / 质量控制 / 方法学验证

Key words

processed Polygonum multiflorum / high-performance liquid chromatography （HPLC） fingerprint / quality control / method validation

制何首乌为蓼科蓼属植物何首乌（Polygonum multiflorum Thunb）的干燥块根经炮制而成，是我国传统名贵中药材。其性微温，味苦、甘、涩，归肝、心、肾经，具有补肝肾、益精血、乌须发、强筋骨、化浊降脂的功效，常用于血虚萎黄、眩晕耳鸣、须发早白、腰膝酸软、肢体麻木、崩漏带下、高脂血症的治疗^［1］。制何首乌的化学成分复杂，含二苯乙烯类、黄酮类、苯丙素类、甾醇类等多种活性成分，其中二苯乙烯苷为其标志性活性成分，其含量与药材质量密切相关^［2-9］。

饮片质量的均一性与稳定性是中药制剂用药安全、有效的前提，而制何首乌的质量易受产地、采收时间、炮制工艺等多种因素影响，不同饮片生产企业所用设备、工艺参数不一致，导致不同企业生产的制何首乌质量差异显著。传统质量控制方法多以单一或少数指标成分为检测对象，难以全面反映药材的内在质量，也无法有效表征其成分的整体性与关联性。中医整体观决定了需对中药中多种成分进行综合评价，而中药及其制剂中化学成分的多样性、复杂性及相互间的协同作用，导致单一成分或少数成分难以准确、全面地反映中药的质量和疗效。指纹图谱技术是近年逐渐发展起来的一项质量控制技术，具有信息量大、特征性强、可整体控制多种组分的特点^［10-15］。本研究参照《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）（2025年版）一部及相关文献^［16-23］，建立了以二苯乙烯苷为主要指标的制何首乌高效液相色谱（high-performance liquid chromatography， HPLC）指纹图谱方法，通过共有峰归属及共有峰相对峰面积限定，实现对制何首乌质量的科学控制。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-2030C 3D型高效液相色谱仪、AUY 120型十万分之一天平，均购自日本岛津公司；KQ-5200型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；HX-200型高速中药粉碎机（浙江省永康市溪岸五金药具厂）；UPL-WATER型超纯水仪（内蒙古飞翔仪器有限公司）；SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）。

1.2 试药

二苯乙烯苷对照品（批号110844-202317，质量分数为97.9%，中国食品药品检定研究院）；甲醇（分析纯）、乙醇（分析纯）、磷酸（色谱纯），均购自天津科密欧试剂有限公司；甲醇、乙腈，均为色谱纯，均购自美国TEDIA公司；水为实验室超纯水仪自制。制何首乌由清华德人西安幸福制药有限公司提供，15批次制何首乌来源信息见表1。

2 方法与结果

2.1 方法优化过程

2.1.1 提取方式的考察

分别考察超声、回流两种提取方式对制何首乌药材总提物峰面积、总峰数及色谱图的影响。结果显示，回流提取的峰面积略高于超声提取，两种提取方式所得的峰个数基本一致，但回流提取色谱图中存在一个高丰度峰，影响谱图整体解析效果；超声提取所得色谱图各峰峰高比例适宜，且超声提取具有简便易行、节省能耗的优势，故确定超声为最佳提取方式。见表2、图1。

2.1.2 提取溶剂的考察

分别考察甲醇，体积分数70%、50%、30%甲醇，无水乙醇，体积分数70%、50%、30%乙醇8种溶剂对制何首乌总提取物峰面积、总峰数及色谱图的影响。结果显示，体积分数70%甲醇提取所得的总峰面积及总峰数均高于其他溶剂，但该溶剂提取所得谱图中存在一个高丰度峰，几乎掩盖其他低丰度峰，影响色谱图整体观察效果与解析结果；甲醇提取所得色谱图的基线平稳，各峰峰高差异较小且分布均匀，故确定甲醇为最佳提取溶剂。见表3、图2。

2.1.3 提取时间的考察

分别考察超声10、20、30 min对制何首乌药材总提物峰面积、总峰数及色谱图的影响。结果显示，超声20、30 min的提取效率相当，且均高于超声10 min。从节约能耗、提高实验效率的角度考虑，最终确定超声20 min为最佳提取时间。见表4、图3。

综合上述实验结果，确定供试品溶液最佳制备工艺为：取制何首乌粉末（过4号筛）约0.5 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定质量，超声（功率200 W，频率40 kHz）处理20 min，放冷后再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.4 检测波长的考察

采用HPLC对供试品溶液进行全波长扫描，结果显示，在222 nm波长处，色谱图基线平稳、色谱峰数量较多，各峰峰高差异不明显，大部分成分能在此波长处检出且分离度良好，故确定222 nm为指纹图谱的检测波长。见图4。

2.1.5 梯度洗脱条件的考察

为实现供试品溶液中各成分在较短时间内的良好分离，采用梯度洗脱方式，考察不同梯度洗脱条件对分离效果的影响。以乙腈（A）-体积分数0.1%磷酸溶液（B）为流动相，比较3种梯度洗脱条件，并结合不同梯度洗脱条件下供试品溶液的色谱图，确定梯度洗脱条件。结果显示，梯度洗脱条件3出峰数最多，各峰分离度最好，峰形较好，洗脱时间适中，最终确定梯度洗脱条件3为最佳洗脱条件。见表5、图5。

2.2 色谱条件

采用Inertsil ODS-3 C₁₈色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈（A）-体积分数0.1%磷酸溶液（B）为流动相，进行梯度洗脱，梯度洗脱程序为0~25 min，5% A→30% A；25~30 min，30% A→40% A；30~32 min，40% A→60% A；32~50 min，60% A→80% A）；流速为1.0 mL·min^-1；检测波长为222 nm；柱温为35 ℃；进样量为10 μL。

2.3 溶液的制备

2.3.1 对照品溶液

取二苯乙烯苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含0.748 mg的对照品储备液。精密量取对照品储备液1 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得质量浓度为74.8 μg·mL^-1的二苯乙烯苷对照品溶液。

2.3.2 供试品溶液

取制何首乌样品S1粉末（过4号筛）约0.5 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定质量，超声（功率200 W，频率40 kHz）处理20 min，放冷后再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.4 方法学验证

2.4.1 精密度考察

取制何首乌样品（S1），按照2.3.2项下方法制成供试品溶液，按照2.2项下色谱条件连续进样测定6次，以二苯乙烯苷为参照峰，计算共有峰的相对保留时间（relative retention time， RRT）和相对峰面积（relative peak area， RPA），并计算相对标准偏差（relative standard deviation， RSD）。结果显示，各共有峰RRT的RSD均小于1%，RPA的RSD均小于1%，表明仪器的精密度良好。见表6。

2.4.2 稳定性考察

取制何首乌样品（S1），按照2.3.2项下方法制成供试品溶液，按照2.2项下色谱条件分别于0、2、4、8、12、24 h进样分析，以二苯乙烯苷为参照峰，计算共有峰的RRT和RPA，并计算RSD。结果表明，各共有峰RRT的RSD均小于1%，RPA的RSD均小于5%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。见表7。

2.4.3 重复性实验

取制何首乌样品（S1）6份，按照2.3.2项下方法分别制成供试品溶液，按照2.2项下色谱条件分别进样检测，计算共有峰的RRT和RPA，并计算RSD。结果显示，各共有峰的RRT的RSD均小于1%，RPA的RSD均小于4%，表明此实验方法的重复性良好。见表8。

2.4.4 指纹图谱的建立与相似度分析

取15批次制何首乌药材和对照品，按照2.3.2项下方法分别制成供试品溶液，按照2.2项下色谱条件分别进样检测，采用中药指纹图谱相似度评价系统（2012.0版）进行相似度评价。以S1为参照图谱，生成对照图谱R，确定5个共有峰，其中3号峰为二苯乙烯苷。15批制何首乌的指纹图谱与对照指纹图谱的相似度均介于0.953~1.000之间。见图6~图9、表9。

2.4.5 共有峰相对百分峰面积的考察

以3号峰（二苯乙烯苷）为参照峰，计算其余共有峰的相对峰面积。结果显示，1号峰的最低相对峰面积为0.087，2号峰的最低相对峰面积为0.064，4号峰的最低相对峰面积为0.180，5号峰的最低相对峰面积为0.141，最终确定1、2、4、5号峰的相对百分峰面积限度分别不得低于8.7%、6.4%、18.0%、14.1%。见表10。

3 结论

本研究围绕制何首乌HPLC指纹图谱构建开展系统研究，以建立其专属质量控制方法为核心目标，突破传统单一或少数指标成分检测的局限性，建立了基于HPLC的多指标成分指纹图谱质量评价方法。通过系统优化供试品制备工艺和色谱检测条件，确定甲醇超声提取20 min为供试品最佳制备工艺，以及以Inertsil ODS-3 C₁₈柱为色谱柱、222 nm为检测波长、乙腈-体积分数0.1%磷酸溶液为流动相的梯度洗脱色谱条件。方法学验证结果表明，该方法的精密度高、稳定性好、重复性佳，符合中药指纹图谱研究的方法学要求。对15批次制何首乌的实际测定结果显示，各批次药材与对照指纹图谱的相似度均在0.953以上，质量一致性良好；同时结合测定数据制订了各共有峰的相对百分峰面积限度，为制何首乌的质量判定提供了明确的量化指标。

《中国药典》（2025年版）一部对制何首乌的质量检测以少数指标成分（二苯乙烯苷、游离蒽醌）定量为核心，虽建立了明确的含量限值标准，为基础质量把控提供了依据，但难以契合中药多成分协同起效的整体特性。本研究建立的制何首乌HPLC指纹图谱方法，突破了传统检测方法的局限性，实现了对制何首乌内在质量的全面、整体、精准评价，在质量控制层面表现出显著优势，且具备广阔的应用前景。在制何首乌饮片研究方面，该方法可用于制何首乌饮片炮制工艺优化、饮片质量分级等相关研究；在以制何首乌为原料的中药制剂领域，该方法可实现两大应用：一是制剂原料一致性验证，确保制剂生产中所用制何首乌原料的质量稳定性；二是制剂整体质量表征，通过建立制剂指纹图谱，结合药材指纹图谱实现“药材-制剂”的特征峰对应与溯源，解决中药制剂“成分复杂、质量难控”的难题，保障制剂的临床疗效与用药安全。

综上所述，本研究建立的制何首乌HPLC指纹图谱方法突破了《中国药典》（2025年版）单一指标检测的局限性，实现了对制何首乌质量的整体、精准、量化评价，不仅完善了制何首乌的质量控制体系，还为中药多维度质量评价提供了依据，在制何首乌全产业链质量管控及中药产业高质量发展中具有重要的应用价值。

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基金资助

秦创原建设两链融合重大专项项目(23LLRHZDZX0013)

“两链”融合企业（院所）联合重点专项(2022LL-JB-29)