维利西呱通过调控线粒体稳态改善老年大鼠心力衰竭血管舒张功能机制的研究

Study on the mechanism of vericiguat in improving diastolic function in elderly rats with heart failure by regulating mitochondrial homeostasis

摘要

目的 探讨维利西呱对老年心力衰竭（heart failure， HF）大鼠血管舒张功能的作用，并探讨线粒体稳态在其中发挥的作用，为HF的治疗提供新思路。 方法 将大鼠随机分为对照组、模型组和维利西呱给药组，采用阿霉素诱导建立老年HF大鼠模型。通过心脏超声评估心脏功能，血管张力实验检测主动脉舒张能力的变化，并用透射电子显微镜观察线粒体形态，免疫荧光检测心肌组织活性氧（reactive oxygen species， ROS）水平，免疫蛋白印迹法（Western blotting）检测沉默信息调节因子3/叉头框蛋白O3a（sirtuin 3/forkhead box O3a， SIRT3/FOXO3a）通路的激活水平。 结果 与对照组比较，模型组大鼠的左室舒张末内径（left ventricle internal diameter in diastole， LVIDd）、左室收缩末内径（left ventricle internal diameter in systole， LVIDs）、左室舒张末容积（left ventricle end-diastolic volume， LVEDV）、左室收缩末容积（left ventricle end-systolic volume， LVESV）均显著升高，左室舒张期前壁厚度（left ventricular anterior wall thickness in diastole， LVAWd）、左室收缩期前壁厚度（left ventricular anterior wall thickness in systole， LVAWs）、左室舒张期后壁厚度（left ventricular posterior wall thickness in diastole， LVPWd）、左室收缩期后壁厚度（left ventricular posterior wall thickness in systole， LVPWs），心输出量（cardiac output， CO）、左心室短轴缩短率（left ventricular fractional shortening， LVFS）和左室射血分数（left ventricular ejection fractions， LVEF）均明显降低。与模型组比较，维利西呱组的LVIDd、LVIDs、LVEDV、LVESV均显著降低，LVAWd、LVAWs、LVPWd、LVPWs、CO、LVFS、LVEF均显著升高。维利西呱可明显改善模型大鼠的主动脉舒张功能。此外，维利西呱能显著降低ROS水平，改善线粒体形态，抑制线粒体裂变并激活SIRT3/FOXO3a信号通路。 结论 维利西呱通过激活SIRT3/FOXO3a信号通路调节线粒体稳态，改善由阿霉素诱导的老年HF大鼠的血管舒张功能，为HF的治疗提供潜在的治疗方向。

Abstract

Objective To investigate the effects of vericiguat on diastolic function in elderly rats with heart failure （HF） and to elucidate the underlying role of mitochondrial homeostasis， thereby providing novel insights for HF treatment. Methods The animals were randomly assigned to 3 groups： control， model （HF）， and vericiguat treatment. A rat model of age-related heart failure was established using doxorubicin induction. Cardiac function was assessed by echocardiography. Aortic vasodilation was evaluated through vascular tension assays. Mitochondrial ultrastructure was examined by transmission electron microscopy. Myocardial reactive oxygen species （ROS） levels were quantified by immunofluorescence staining. The activation status of the sirtuin 3/forkhead box O3a （SIRT3/FOXO3a） signaling pathway was determined by Western blotting analysis. Results Compared with the control group， the model group exhibited significantly increased left ventricular internal diameter in diastole （LVIDd） and systole （LVIDs）， left ventricular end-diastolic volume （LVEDV）， and left ventricular end-systolic volume （LVESV）， alongside significantly decreased left ventricular anterior wall thickness in diastole （LVAWd） and left ventricular anterior wall thickness in systole （LVAWs）， left ventricular posterior wall thickness in diastole （LVPWd） and left ventricular posterior wall thickness in systole （LVPWs）， cardiac output （CO）， left ventricular fractional shortening （LVFS）， and left ventricular ejection fraction （LVEF） （P<0.05）. Conversely， the vericiguat group demonstrated significant improvements in all these parameters relative to the model group （P<0.05）. Furthermore， vericiguat markedly enhanced aortic vasodilation， reduced myocardial ROS levels， ameliorated mitochondrial morphological integrity， inhibited excessive mitochondrial fission， and activated the SIRT3/FOXO3a signaling pathway. Conclusion Vericiguat improves doxorubicin-induced diastolic dysfunction in aged heart failure rats by activating the SIRT3/FOXO3a signaling pathway and restoring mitochondrial homeostasis， offering a promising therapeutic strategy for heart failure management.

Graphical abstract

关键词

维利西呱 / 线粒体稳态 / 心力衰竭 / 舒张功能

Key words

vericiguat / mitochondrial homeostasis / heart failure / diastolic function

心力衰竭（heart failure， HF）是全球范围内严重威胁老年人健康的慢性疾病之一，尤其是以舒张功能障碍为特征的心力衰竭在老年群体中的发病率逐年上升^［1-2］。研究表明，HF的病理生理机制复杂，涉及心肌细胞能量代谢紊乱、氧化应激反应增强及线粒体功能失调等多种机制^［3-5］。近年来，线粒体稳态在HF病程中的关键作用逐渐成为研究热点^［6-7］。维持线粒体稳态不仅能够改善心肌细胞的能量代谢，还可减少氧化应激损伤，从而改善心肌功能^［8］。因此，探索调控线粒体稳态的潜在治疗策略对改善老年HF患者的预后具有重要意义。

维利西呱是一种可溶性鸟苷酸环化酶（guanylate cyclase， GC）刺激剂，能够通过增强GC信号通路促进一氧化氮生成并改善心血管功能^［9］。现有研究表明，维利西呱在改善慢性HF患者心肌收缩功能及减少住院风险方面具有显著效果^［10-11］。然而，维利西呱是否能够通过调控线粒体稳态改善老年HF患者的舒张功能，目前尚不清楚。进一步探讨维利西呱的作用机制将为该药物的临床应用提供新的理论依据，同时可能为老年HF的治疗开辟新的研究方向。

基于此，本研究通过构建老年HF动物模型，探讨维利西呱对心肌线粒体稳态及舒张功能的具体作用机制。

1 仪器与试药

1.1 仪器

VisualSonics Vevo3100型高分辨率小动物超高影像系统（日本Fujifilm公司）；159928型离体组织浴槽（美国Radnoti公司）；CKX53型倒置相差显微镜（日本Olympus公司）；LSM800型激光共聚焦显微镜（德国Zeiss公司）；Mini-PROTEAN Tetra型电泳仪、Mini Trans-Blot Module型转膜仪，均购自美国Bio-Rad公司；5200 Multi型化学发光成像系统（中国Tanon公司）。

1.2 试药

去甲肾上腺素（norepinephrine， NE， 质量分数为99%，批号HY-13715）、乙酰胆碱（acetylcholine， Ach， 质量分数为99%，批号HY-B0282）、硝普钠（sodium nitroprusside， SNP，质量分数为99%，批号HY-B0564）、阿霉素（质量分数为99%，批号HY-15142），均购自MedChemExpress公司；氯化钾（potassium chloride，KCL，质量分数为99%，批号P816357），购自上海麦克林生化科技股份有限公司。

1.3 实验动物

SPF级SD大鼠30只，22~24周龄，体质量为（220±20） g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司（动物许可证号：SYXK（京）2022-0052）。实验前适应性喂养1周，温度为20~22 ℃，相对湿度为45%~55%，昼夜间隔12 h。

2 方法

2.1 HF大鼠模型的制备及给药

将大鼠随机分为对照组、模型组和给药组，每组10只。其中模型组和给药组大鼠每周腹腔注射阿霉素4 mg·kg^-1，连续给药6周后，经过彩色多普勒超声检测左室射血分数（left ventricular ejection fraction， LVEF），当LVEF≤60%时表示造模成功，对照组注射相同体积的生理盐水。造模成功后给药组按照10 mg·kg^-1的剂量灌胃维利西呱，每日1次，持续给药2周，对照组和模型组灌胃等量的生理盐水。

2.2 超声心功能的检测

造模后14 d，将大鼠以仰卧位固定于实验台上，待心律稳定后开始检测。进行超声心动图检查时，密切观察大鼠的呼吸状态，若出现明显呼吸抑制，则需立即停止检测并给予呼吸支持。采用高频探头在左室长轴及胸骨旁短轴各切面进行超声观察，记录心脏运动情况。在左室长轴切面测量左室舒张末内径（left ventricle internal diameter in diastole， LVIDd）、左室收缩末内径（left ventricle internal diameter in systole， LVIDs）、左室舒张末容积（left ventricle end-diastolic volume， LVEDV）、左室收缩末容积（left ventricle end-systolic volume， LVESV）、左室舒张期前壁厚度（left ventricular anterior wall thickness in diastole， LVAWd）、左室收缩期前壁厚度（left ventricular anterior wall thickness in systole，LVAWs）、左室舒张期后壁厚度（left ventricular posterior wall thickness in diastole， LVPWd）、左室收缩期后壁厚度（left ventricular posterior wall thickness in systole， LVPWs），计算心输出量（cardiac output， CO）、左心室短轴缩短率（left ventricular fractional shortening， LVFS）和左室射血分数（left ventricular ejection fractions， LVEF）。各指标测量连续5个心动周期值，取平均值。待超声检测完成后，各组大鼠进入后续实验操作。

2.3 大鼠胸主动脉血管张力的检测

造模后14 d，每组大鼠随机取3只，将大鼠麻醉后开胸，迅速切除胸主动脉，置于克氏液中。清除血管附着的结缔组织、脂肪组织及小血管，操作时避免过度牵拉以保护血管内皮。分离后，将胸主动脉分成4~5 mm的血管环。将血管环两端固定于支架底部，另一端通过细棉线连接张力换能器，利用生理记录仪记录张力变化。初始施加1.5 g张力，调整并保持张力水平在1.5 g，稳定90 min，并每15 min更换1次克氏液，换液后及时调整张力至1.5 g。稳定后，用60 mmol·L^-1 KCl溶液预收缩血管环2次，选择收缩反应良好的血管环检测血管张力。待血管环稳定时记录初始张力值T₀，向浴槽中加入NE（终浓度1×10^-6 mol·L^-1），待血管收缩至平台期后记录张力值T₁。加入内皮依赖性舒张剂Ach（1×10^-9~1×10^-4 mol·L^-1）或非内皮依赖性舒张剂SNP（1×10^-11~1×10^-6 mol·L^-1），每个浓度作用至平台期时记录张力值T_x，然后继续加入下一浓度。根据公式计算舒张率：舒张率=（T₁-T_x ）/（T₁-T₀）×100%。

2.4 电镜检测线粒体形态

取大鼠新鲜心肌组织，用电镜固定液和1%锇酸固定。PBS漂洗3次后，依次用体积分数50%、70%、80%、90%、95%的乙醇进行梯度脱水，包埋后用超薄切片机制备60~80 nm的切片，于体积分数2%醋酸铀饱和乙醇溶液染色8 min，用体积分数70%的乙醇和清水清洗后，体积分数2.6%枸橼酸铅溶液染色，超纯水清洗后于室温条件下干燥过夜，在透射电子显微镜下观察线粒体的形态学变化。

2.5 活性氧（reactive oxygen species，ROS）的检测

取大鼠新鲜心肌组织，置于4%多聚甲醛中固定，再经蔗糖梯度脱水后，用OCT包埋制成冰冻切片。将冰冻切片置于二氢乙锭（dihydroethidium， DHE）染色液中孵育，使用荧光显微镜进行拍照。

2.6 线粒体的分离

将新鲜切碎的心脏组织用PBS清洗后，用胰蛋白酶消化以分散组织，并以3 000 r·min^-1离心10 s，收集沉淀。随后，使用玻璃匀浆器将组织沉淀在线粒体分离试剂中匀浆化，以2 500 r·min^-1离心5 min获取上清液，再以12 800 r·min^-1离心10 min得到线粒体沉淀，将线粒体沉淀重悬并用线粒体裂解液裂解以提取线粒体蛋白，最后利用双辛可宁酸法（bicinchoninic acid assay， BCA）检测试剂盒测定线粒体蛋白浓度，Western blotting检测相关蛋白表达。

2.7 Western blotting检测沉默信息调节因子3/叉头框蛋白O3a（sirtuin 3/forkhead box O3a， SIRT3/FOXO3a）通路蛋白的表达

使用RIPA裂解液处理大鼠心肌组织，每5 min涡旋1次，共30 min。在4 ℃、12 000 r·min^-1条件下离心10 min后，收集上清，加入上样缓冲液进行蛋白样品制备，通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis， SDS-PAGE）分离并转移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride， PVDF）膜。采用体积分数5%脱脂牛奶封闭2 h，4 ℃进行一抗过夜。然后用含Tween 20的Tris缓冲盐水（tris-buffered saline with Tween 20， TBST）洗涤5次，每次5 min，再用辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase， HRP）标记的二抗染色2 h，并用TBST洗涤5次，每次5 min。使用增强化学发光（enhanced chemiluminescence， ECL）显色液曝光，灰度值通过ImageJ软件进行分析。

2.8 统计学方法

数据采取GraphPad Prism 9.0统计软件处理。各项指标以（\overline{x}±s）表示，数据来源于至少3次独立实验，多组实验之间的比较采用方差分析检验，组间两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 维利西呱对老年HF大鼠心功能的影响

与对照组比较，模型组大鼠的LVIDd、LVIDs、LVEDV、LVESV均显著升高，LVAWd、LVAWs、LVPWd、LVPWs、CO、LVFS、LVEF均显著降低。与模型组比较，维利西呱组的LVIDd、LVIDs、LVEDV、LVESV均显著降低，LVAWd、LVAWs、LVPWd、LVPWs、CO、LVFS、LVEF均显著升高。见表1。

3.2 维利西呱对老年HF大鼠主动脉舒张功能的影响

与对照组比较，模型组大鼠的内皮依赖性血管舒张作用显著降低，在Ach浓度为1×10^-7~1×10^-4 mol·L^-1时作用显著；与模型组比较，给药组大鼠的内皮依赖性血管舒张作用明显改善，在Ach浓度为1×10^-7~1×10^-4 mol·L^-1时作用明显。与对照组比较，HF大鼠的非内皮依赖性舒张作用明显降低，在SNP浓度为1×10^-9~1×10^-6 mol·L^-1时作用显著；给药组在SNP浓度为1×10^-8~1×10^-7 mol·L^-1时对非内皮依赖性舒张作用的改善显著。见图1。

3.3 大鼠心肌组织线粒体形态的变化

透射电镜检测大鼠心肌组织线粒体形态变化结果显示，与对照组比较，模型组大鼠线粒体大小不一，排列紊乱，结构不清。与模型组比较，给药组大鼠线粒体大小差异减小，排列更加整齐，线粒体肿胀明显减轻。见图2。

3.4 大鼠心肌组织ROS水平的变化

DHE检测大鼠心肌组织ROS水平变化结果显示，与对照组比较，模型组大鼠心肌组织ROS水平显著上升。与模型组比较，给药组大鼠心肌组织ROS水平显著降低。结果表明，维利西呱能有效降低HF大鼠心肌组织的ROS水平。见图3。

3.5 大鼠心肌组织线粒体融合裂变动力学的变化

Western blotting分析结果显示，模型组大鼠心肌组织线粒体融合裂变动力学失衡，表现为心肌细胞线粒体中Mfn2表达显著下调，p-Drp1（Ser616）/Drp1表达上调。但维利西呱治疗显著增强了心肌组织的线粒体融合，抑制了线粒体裂变，维持了线粒体动力学稳态。

3.6 维利西呱对大鼠心肌组织SIRT3/FOXO3a通路的影响

Western blotting结果显示，模型组大鼠心肌组织中SIRT3、FOXO3a蛋白的表达水平显著降低，而维利西呱给药干预后大鼠心肌组织中SIRT3、FOXO3a蛋白的表达水平上调，表明维利西呱可能通过激活SIRT3/FOXO3a通路干预线粒体稳态。

4 讨论

本研究构建老年HF大鼠模型，探讨了维利西呱对血管舒张功能的改善作用，特别是其具体的作用机制。研究结果表明，维利西呱可显著改善HF大鼠的心脏功能，降低氧化应激水平，恢复线粒体稳态并提升血管舒张功能，为其在老年HF治疗中潜在的临床应用提供了重要的参考依据。

HF是一种以心功能障碍为特征的复杂综合征，其病理机制涉及细胞代谢紊乱，线粒体功能障碍等^［12-13］。本研究结果显示，模型组采用维利西呱干预后LVEF和LVFS显著上升，同时LVIDd和LVIDs显著下降，表明维利西呱对改善HF引起的心功能障碍具有明显的保护作用。维利西呱作为一种可溶性GC激动剂，通过增强NO/cGMP信号发挥心血管保护作用^［14-15］。其主要作用机制是增加cGMP水平，从而促进心肌收缩。本研究结果显示，维利西呱在老年HF大鼠中具有显著的治疗效果，并能有效改善其线粒体功能。

SIRT3是一种在线粒体中发挥关键作用的酶，其通过调控抗氧化和维持线粒体活性平衡发挥保护线粒体的作用^［16］。FOXO3a作为SIRT3下游的重要因子，直接参与抗氧化过程^［17-18］。本研究发现，HF模型组心肌组织中SIRT3和FOXO3a的表达显著降低，同时线粒体结构损伤水平、氧化应激水平升高。采用维利西呱干预后，SIRT3和FOXO3a的表达显著上升，线粒体形态恢复正常，ROS水平显著降低。这表明维利西呱通过激活SIRT3/FOXO3a信号通路，在减弱氧化应激水平及维持线粒体功能中发挥了重要作用。另外，维利西呱还显著下调了线粒体分裂相关蛋白Drp1的磷酸化水平，提高了线粒体融合蛋白Mfn2的表达，抑制了线粒体过度分裂。这提示维利西呱可能通过调控线粒体分裂与融合来恢复线粒体稳态，进一步支持了其通过SIRT3/FOXO3a信号通路改善心力衰竭的机制。

本研究首次从SIRT3/FOXO3a信号通路的角度系统分析了维利西呱在老年HF治疗中的分子机制。这一发现为其在老年HF治疗中的应用提供了有力支持，同时也为其他心血管保护剂的功能探索与机制研究提供了参考。然而，本研究也存在一些局限性。首先，实验采用大鼠模型，虽然与人类HF在病理上具有相似性，但其在临床中的适用性尚需进一步验证。其次，本研究对维利西呱的长期应用安全性、可能的耐药性及其对不同心血管疾病的广泛适用性尚需进一步探索。

综上所述，维利西呱通过激活SIRT3/FOXO3a信号通路调控线粒体稳态，显著改善了老年HF的血管舒张功能。这一机制不仅深入了对维利西呱药物治疗作用的认识，也为未来老年HF的治疗提供了新靶点和新策略。

参考文献

[1] Shahim B， Kapelios C J， Savarese G，et al. Global public health burden of heart failure：An updated review［J］. Card Fail Rev，2023，9：e11．

[2] 梁景乾，蔡晶茹，怀宝赓，等. 苓桂术甘汤与肾气丸 “同病异治” 慢性心力衰竭的机制［J］. 西北药学杂志，2023，38（3）：54-61．

[3] Liang Jingqian， Cai Jingru， Huai Baogeng，et al. Mechanism of Linggui Zhugan Decoction and Shenqi Pills in the treatment of chronic cardiac failure based on the theory of “treating the same disease with different methods”［J］. Northwest Pharmaceutical Journal，2023，38（3）：54-61．

[4] Tsutsui H， Albert N M， Coats A J S，et al. Natriuretic peptides：Role in the diagnosis and management of heart failure：A scientific statement from the heart failure association of the European society of cardiology，heart failure society of America and Japanese heart failure society［J］. J Card Fail，2023，29（5）：787-804．

[5] Shah A K， Bhullar S K， Elimban V，et al. Oxidative stress as a mechanism for functional alterations in cardiac hypertrophy and heart failure［J］. Antioxidants （Basel），2021，10（6）：931．

[6] Lopaschuk G D， Karwi Q G， Tian R，et al. Cardiac energy metabolism in heart failure［J］. Circ Res，2021，128（10）：1487-1513．

[7] Wu C， Zhang Z， Zhang W，et al. Mitochondrial dysfunction and mitochondrial therapies in heart failure［J］. Pharmacol Res，2022，175：106038．

[8] 程相阁，刘万周，王东伟. 淫羊藿苷对心力衰竭大鼠线粒体自噬及能量代谢的影响［J］. 西北药学杂志，2022，37（4）：51-57．

[9] Cheng Xiangge， Liu Wanzhou， Wang Dongwei. Effects of icariin on mitochondrial autophagy and energy metabolism in heart fai-lure rats［J］. Northwest Pharmaceutical Journal，2022，37（4）：51-57．

[10] Zhang D， Wang F， Li P，et al. Mitochondrial Ca²⁺ homeostasis：Emerging roles and clinical significance in cardiac remodeling［J］. Int J Mol Sci，2022，23（6）：3025．

[11] Harada T， Kondo H， Yamasaki H，et al. Effects of vericiguat on redox signaling in cardiomyocyte［J］. Eur Heart J，2023，44（）：ehad655.963．

[12] Sahana U， Wehland M， Simonsen U，et al. A systematic review of the effect of vericiguat on patients with heart failure［J］. Int J Mol Sci，2023，24（14）：11826．

[13] Trujillo M E， Ayalasomayajula S， Blaustein R O，et al. Vericiguat，a novel sGC stimulator：Mechanism of action，clinical，and translational science［J］. Clin Transl Sci，2023，16（12）：2458-2466．

[14] Li A L， Lian L， Chen X N，et al. The role of mitochondria in myocardial damage caused by energy metabolism disorders：From mechanisms to therapeutics［J］. Free Radic Biol Med，2023，208：236-251．

[15] Da Dalt L， Cabodevilla A G， Goldberg I J，et al. Cardiac lipid metabolism，mitochondrial function，and heart failure［J］. Cardiovasc Res，2023，119（10）：1905-1914．

[16] Cai Z， Wu C， Xu Y，et al. The NO-cGMP-PKG axis in HFpEF：From pathological mechanisms to potential therapies［J］. Aging Dis，2023，14（1）：46-62．

[17] Nelissen E， Schepers M， Ponsaerts L，et al. Soluble guanylyl cyclase：A novel target for the treatment of vascular cognitive impairment？［J］. Pharmacol Res，2023，197：106970．

[18] Mishra Y， Kaundal R K. Role of SIRT3 in mitochondrial biology and its therapeutic implications in neurodegenerative disorders［J］. Drug Discov Today，2023，28（6）：103583．

[19] Liu K， Zhu Y， Gao W，et al ．Resveratrol alleviates heart failure by activating foxo3a to counteract oxidative stress and apoptosis［J］. Biomed Pharmacother，2024，181：117716．

[20] Bernardo V S， Torres F F， da Silva D G H. FoxO3 and oxidative stress：A multifaceted role in cellular adaptation［J］. J Mol Med （Berl），2023，101（1/2）：83-99．

基金资助

河北省卫生健康委员会科研项目(20231569)

邯郸市科学技术项目(23422083227)