芒果苷通过调节核因子E2相关因子2/血红素加氧酶-1信号通路改善帕金森综合征小鼠的神经损伤

Neuroprotective effect of mangiferin in Parkinson syndrome mice by regulating the nuclear factor-erythroid 2-related factor 2/hemeoxygenase-1 signaling pathway

摘要

目的 探讨芒果苷（mangiferin， MGF）是否可通过调节核因子E2相关因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2， Nrf2）/血红素加氧酶-1（hemeoxygenase-1， HO-1）信号通路，改善帕金森综合征（Parkinson syndrome， PS）小鼠的神经损伤。 方法 将实验小鼠随机分为对照（control， CK）组、模型（Model）组、MGF低剂量（low-dose mangiferin， MGF-L）组、MGF高剂量（high-dose mangiferin， MGF-H）组、MGF-H+ML385（Nrf2/HO-1信号通路抑制剂）组。采用转棒实验、爬杆实验评估小鼠的运动功能；苏木精-伊红（hematoxylin-eosin， HE）染色观察小鼠的脑部黑质区病理形态；利用透射电镜观察黑质区神经元超微结构；检测指标包括：小鼠海马神经元凋亡率，海马组织中肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）、白细胞介素（interleukin， IL）-6、IL-10和IL-1β的表达水平，海马组织中丙二醛（malondialdehyde， MDA）含量、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）及过氧化氢酶（catalase， CAT）活性，黑质区酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase， TH）、多巴胺转运蛋白（dopamine transporter， DAT）、神经元内α-突触核蛋白（α-synuclein， α-syn）、泛素结合蛋白（sequestosome-1， P62）、Nrf2及HO-1蛋白表达水平。 结果 与CK组比较，Model组小鼠的黑质区神经元损伤明显，线粒体肿胀；爬杆时间，海马神经元凋亡率，海马组织TNF-α、IL-6和IL-1β水平及MDA含量，以及黑质区α-syn、P62蛋白表达水平均显著升高（P<0.05）；转棒实验下落潜伏时间、海马组织IL-10水平、SOD和CAT活性，以及黑质区TH、DAT、Nrf2、HO-1蛋白表达水平和海马组织Nrf2、HO-1蛋白表达水平均显著降低（P<0.05）。与Model组比较，MGF-L组和MGF-H组小鼠的黑质区神经元和线粒体损伤显著改善；爬杆时间，海马神经元凋亡率，海马组织TNF-α、IL-6和IL-1β水平及MDA含量，以及黑质区α-syn、P62蛋白表达水平均显著降低（P<0.05）；转棒实验下落潜伏时间、海马组织IL-10水平、SOD和CAT活性，以及黑质区TH、DAT、Nrf2、HO-1蛋白表达水平和海马组织Nrf2、HO-1蛋白表达水平均显著升高（P<0.05）。ML385可显著减弱MGF对PS小鼠神经损伤的改善作用（P<0.05）。 结论 MGF可能通过激活Nrf2/HO-1信号通路，降低PS小鼠体内炎症反应、氧化应激水平及神经元凋亡率，减轻神经损伤，进而改善其运动功能。

Abstract

Objective To investigate whether mangiferin （MGF） can ameliorate neurological damage in Parkinson syndrome （PS） mice by regulating the nuclear factor erythroid 2-related factor 2 （Nrf2）/heme oxygenase-1 （HO-1） signaling pathway. Methods The experimental mice were randomly divided into 5 groups： control （CK） group， model group， low-dose mangiferin （MGF-L）， high-dose mangiferin （MGF-H）， and MGF-H+ML385 （an inhibitor of the Nrf2/HO-1 signaling pathway） group. Motor function was evaluated by the pole test and rotarod test. Hematoxylin-eosin （HE） was used to observe the pathological morphology of the substantia nigra in the mice brain. Transmission electron microscopy （TEM） was employed to examine the ultrastructure of substantia nigra neurons. The detection indicators include： the apoptosis rate of mice hippocampal neurons， the expression levels of tumor necrosis factor-α （TNF-α）， interleukin （IL）-6， IL-10 and IL-1β in the hippocampal tissue， the content of malondialdehyde （MDA） in the hippocampal tissue， the activities of superoxide dismutase （SOD） and catalase （CAT）， the protein expression levels of tyrosine hydroxylase （TH）， dopamine transporter （DAT）， α-synuclein （α-syn）， sequestosome-1 （P62）， Nrf2 and HO-1 in the neurons. Results Compared with the CK group， the model group exhibited obvious neuronal damage and mitochondrial swelling in the substantia nigra. The climbing time， hippocampal neuronal apoptosis rate， the levels of TNF-α， IL-6， and IL-1β in hippocampal tissue， MDA content， and the expression levels of α-syn and P62 proteins in the substantia nigra were significantly increased （P<0.05）， whereas the latency to fall in the rotarod test， IL-10 level in hippocampal tissue， SOD and CAT activities， and the protein expression levels of TH， DAT， Nrf2， and HO-1 in the substantia nigra， as well as Nrf2 and HO-1 protein expression in the hippocampus， were significantly decreased （P<0.05）. Compared with the model group， both MGF-L and MGF-H groups showed obvious amelioration of neuronal and mitochondrial damage in the substantia nigra. The climbing time， hippocampal neuronal apoptosis rate， the levels of TNF-α， IL-6， and IL-1β in hippocampal tissue， MDA content， and the expression levels of α-syn and P62 proteins in the substantia nigra were significantly reduced （P<0.05）， while the latency to fall in the rotarod test， IL-10 level in hippocampal tissue， SOD and CAT activities， and the protein expression levels of TH， DAT， Nrf2， and HO-1 in the substantia nigra， as well as Nrf2 and HO-1 protein expression in the hippocampus， were significantly increased （P<0.05）. ML385 attenuated the neuroprotective effects of MGF in PD mice （P<0.05）. Conclusion MGF may reduce inflammation， oxidative stress， and neuronal apoptosis， alleviate neurological damage， and improve motor function in PS mice by activating the Nrf2/HO-1 signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

芒果苷 / 核因子E2相关因子2/血红素加氧酶-1信号通路 / 帕金森综合征 / 神经损伤

Key words

mangiferin / nuclear factor-erythroid 2-related factor 2/hemeoxygenase-1 signaling pathway / Parkinson syndrome / neurological damage

帕金森综合征（Parkinson syndrome， PS）是一种由外伤、脑血管疾病、感染和中毒等因素诱发的神经退行性疾病，其临床主要表现为运动功能障碍、运动迟缓、肌肉僵硬、静息性震颤等，随着病情进展，患者还会出现认知功能障碍^［1］。PS多发于中老年人，随着我国人口老龄化程度的加剧，PS患者数量呈上升趋势，给社会和家庭带来沉重负担^［2］。目前已知PS的发病机制与多巴胺能神经元死亡、背外侧纹状体多巴胺（dopamine， DA）缺失、炎症反应和氧化应激密切相关，临床治疗以DA替代疗法为主，但该疗法治疗效果有限且存在较明显的不良反应^［3］。因此，探索新型治疗策略已成为医学领域的研究热点。芒果苷（mangiferin， MGF）是从芒果属植物中提取的天然化合物，化学式为C₁₉H₁₈O₁₁，已有研究证实其具有抗炎、抗氧化及保护神经等生物学功能^［4］。研究表明，MGF可通过降低氧化应激、抑制神经炎症及细胞凋亡，预防PS和阿尔茨海默症大鼠的神经退行性病变，改善其神经功能^［5］。此外，MGF还可通过抗氧化和抗炎作用减轻亨廷顿舞蹈症大鼠的神经损伤，对神经退行性疾病具有潜在的改善作用^［6］。尽管MGF对神经退行性疾病具有一定的治疗潜力，但其具体作用机制尚未完全明确。核因子E2相关因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2， Nrf2）/血红素加氧酶-1（hemeoxygenase-1， HO-1）信号通路是机体调控氧化应激和炎症反应的关键通路，该通路被激活后可有效抑制炎症反应和氧化损伤^［7］。Huang B等^［8］的研究证实，激活Nrf2/HO-1信号通路可抑制由脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）诱导的PS大鼠神经炎症和氧化应激，减轻多巴胺能神经病变。据此推测，Nrf2/HO-1信号通路可能参与PS小鼠神经炎症和氧化应激的发展过程。本研究通过建立PS小鼠模型，探讨MGF是否通过调控Nrf2/HO-1信号通路改善PS小鼠的神经损伤，为PS的临床治疗提供新的实验依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

LD-SY96型酶标仪（山东海曼科学仪器有限公司）；JP-2880Plus型凝胶成像分析系统（上海金鹏分析仪器有限公司）；BDS型倒置荧光显微镜（北京赛百奥科技有限公司）。

1.2 试药

MGF（批号M114062，质量分数≥98%）、1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine， MPTP，批号M338296，质量分数≥98%），均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；Nrf2/HO-1信号通路抑制剂ML385（批号SML1833，质量分数≥98%，美国Sigma公司）；肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）、白细胞介素（interleukin，IL）-6、IL-10、IL-1β 酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA）试剂盒（批号：PA135426、PA137518、PA137453、PA137462），丙二醛（malondialdehyde， MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）试剂盒（批号：PA146538、PA146721、PA146395），均购自南京赛泓瑞生物科技有限公司；苏木精-伊红（hematoxylin-eosin， HE）染色、脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal-deoxynucleotidyl transferase-mediated nick end labeling，TUNEL）、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid， BCA）试剂盒（批号：G1120、T2130、PC0020），均购自北京索莱宝生物科技有限公司；酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase， TH）、多巴胺转运蛋白（dopamine transporter， DAT）、神经元内α-突触核蛋白（α-synuclein， α-syn）、泛素结合蛋白（sequestosome-1， P62）、Nrf2、HO-1、β-actin一抗（批号：ab278064、ab12352、ab64581、ab91526、ab62352、ab13248、ab8227）及二抗IgG（批号ab133470），均购自英国Abcam公司。

1.3 实验动物

雄性C57BL/6小鼠60只，购自滨州医学院，体质量为（19±1） g，饲养温度为22~25 ℃，湿度为55%~65%，12 h/12 h明暗交替，自由进食、饮水。

2 方法

2.1 造模、给药与分组

取50只小鼠构建PS模型，每日给予小鼠腹腔注射30 mg·kg^-1的MPTP（用质量分数0.9%氯化钠溶液配制），每日1次，连续注射7 d。当小鼠出现立毛、弓背、震颤、倦怠、流涎及运动功能测试异常即可判断PS模型构建成功^［9］。43只小鼠模型构建成功后，选取40只小鼠随机分为4组：模型（Model）组、MGF低剂量（low-dose mangiferin， MGF-L）组、MGF高剂量（high-dose mangiferin， MGF-H）组、MGF-H+ML385组，每组10只；剩余10只未造模小鼠作为对照（control， CK）组。

MGF-L组和MGF-H组小鼠每日分别灌胃给予20、40 mg·kg^-1的MGF^［10］；MGF-H+ML385组小鼠每日灌胃给予40 mg·kg^-1的MGF，同时腹腔注射30 mg·kg^-1的ML385^［11］；CK组和Model组给予等体积的质量分数0.9%氯化钠溶液，灌胃和腹腔注射方式与给药组一致，每日1次，连续干预3周。

2.2 小鼠运动功能的检测

2.2.1 转棒实验

将小鼠置于转棒仪上，适应1 min后启动仪器，在30 s内将转速调整到26 r·min^-1，记录小鼠从转棒上跌落的时间（即下落潜伏时间），每只小鼠重复检测3次，取平均值。

2.2.2 爬杆实验

选取长为50 cm、直径为1 cm的木杆，顶部放置直径2.5 cm的软木小球，木杆表面做粗糙处理以防滑；将木杆倾斜45°放置于小鼠笼中，将小鼠头朝下置于木杆顶部的软木小球上，使其沿着木杆向下攀爬，记录小鼠从顶部爬至底部的时间，每组小鼠重复检测3次，每次间隔10 min，取平均值。

2.3 样本采集

药物干预结束后，将小鼠断头处死，在冰浴条件下快速取出完整大脑，用无菌生理盐水清洗干净，分离大脑黑质区和海马区组织，分装后置于-80 ℃冰箱中保存。

2.4 HE染色观察大脑黑质区病理形态

将小鼠黑质区脑组织用4%多聚甲醛固定24 h，经梯度乙醇脱水、石蜡包埋后，切成5 μm厚的切片，按照HE染色试剂盒说明书进行染色，经二甲苯透明、中性树胶封片后，置于光学显微镜下观察黑质区病理形态并拍照。

2.5 透射电镜观察黑质区神经元的超微结构

取黑质区组织切成2 mm×2 mm×2 mm的小块，用体积分数2.5%戊二醛固定24 h，经梯度脱水、环氧树脂包埋后，切成约90 nm厚的薄片；醋酸铀-柠檬酸铅双重染色，置于透射电镜下观察神经元超微结构并拍照。

2.6 TUNEL染色检测海马区神经元的凋亡

将小鼠海马区脑组织用体积分数4%多聚甲醛固定、石蜡包埋、切片后，经梯度脱腊至水；用体积分数3%过氧化氢溶液封闭内源性过氧化物酶15 min，按照TUNEL试剂盒说明书加入相应试剂进行染色，4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色标记细胞核；置于荧光显微镜下拍照，随机选取5个视野，计算细胞凋亡率。凋亡率（%）=（TUNEL阳性细胞数量/DAPI染色细胞核总数）×100%。

2.7 ELISA试剂盒检测海马组织TNF-α、IL-6、IL-10、IL-1β的水平

称取适量海马组织，冰浴条件下研磨制成匀浆，4 ℃条件下以3 500 r·min^-1离心10 min，取上清液；按照EILSA试剂盒说明书操作，依次加入反应试剂、显色试剂、终止试剂，用酶标仪检测450 nm波长处的吸光度值，根据标准曲线计算各细胞因子的水平。

2.8 商品化试剂盒检测海马组织MDA含量、SOD及CAT活性

取2.7项下离心获得的海马组织上清液，按照MDA、SOD、CAT试剂盒说明书的操作步骤，分别检测MDA含量、SOD及CAT活性。

2.9 Western blotting检测相关蛋白的表达水平

取小鼠海马区和黑质区组织，加入放射性免疫沉淀（radio immunoprecipitation assay，RIPA）裂解液，冰上裂解30 min。在4 ℃条件下，以12 000 r·min^-1离心15 min，取上清液。采用BCA法测定蛋白浓度，100 ℃水浴变性10 min。蛋白样品经体积分数10%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis， SDS-PAGE）分离后，采用湿转法将蛋白转移至聚偏二氟乙烯［poly（vinylidenefluoride）， PVDF］膜，用质量分数5%脱脂奶粉室温封闭2 h；分别加入TH、DAT、α-syn、P62、Nrf2、HO-1、β-actin（1∶1 500）一抗，4 ℃孵育过夜；TBST缓冲液洗膜后，加入辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记二抗（1∶5 000），室温孵育1 h。再次洗涤后，采用增强型化学发光（enhanced chemiluminescence， ECL）试剂盒显影，用Image J软件分析各蛋白条带的灰度值，以β-actin为内参，计算各目的蛋白的相对表达量。

2.10 统计学方法

采用Graphpad Prism 8.0.1软件对数据进行处理。计量资料以（\overline{x}\pm s）表示；多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 MGF对各组小鼠运动能力的影响

与CK组比较，Model组小鼠转棒实验下落潜伏时间显著缩短，爬杆时间显著延长（P<0.05）；与Model组比较，MGF-L组和MGF-H组小鼠的下落潜伏时间均显著延长，爬杆时间均显著缩短（P<0.05）；与MGF-H组比较，MGF-H+ML385组小鼠的下落潜伏时间显著缩短，爬杆时间显著延长（P<0.05）。结果表明，MGF可显著改善PS小鼠的运动功能，而ML385可逆转MGF的这一改善作用。见表1。

3.2 MGF对小鼠脑部黑质区病理形态的影响

HE染色结果显示，CK组小鼠脑内黑质区神经元形态正常，排列整齐，胞质染色均匀，核仁清晰；Model组小鼠黑质区神经元数量显著减少，胞质染色加深，核仁染色异常，部分神经元出现变性、空泡化改变；MGF-L组和MGF-H组小鼠黑质区神经元损伤明显改善，神经元数量有所恢复，变形、空泡化现象减轻；MGF-H+ML385组小鼠黑质区神经元损伤程度显著高于MGF-H组。表明MGF可改善PS小鼠黑质区病理损伤，而ML385可拮抗MGF的这一保护作用。见图1。

3.3 MGF对小鼠脑部黑质区神经元超微结构的影响

透射电镜观察结果显示，CK组小鼠黑质区神经元超微结构正常，线粒体形态规则，嵴完整清晰，溶酶体数量正常；Model组小鼠部分神经元线粒体明显肿胀，线粒体嵴断裂、减少，甚至消失，溶酶体数量显著减少；MGF-L组和MGF-H组小鼠神经元出现自噬小体，线粒体肿胀程度明显减轻，线粒体嵴结构逐渐恢复，溶酶体数量有所增加；MGF-H+ML385组小鼠部分神经元仍存在明显线粒体肿胀，未观察到自噬小体。表明MGF可改善PS小鼠黑质区神经元超微结构损伤，促进自噬发生，而ML385可抑制MGF的这一作用。见图2。

3.4 MGF对小鼠海马神经元凋亡的影响

TUNEL染色结果显示，绿色荧光为TUNEL阳性细胞，CK组海马区仅见少量TUNEL阳性细胞；Model组海马区TUNEL阳性细胞数量显著增多；MGF-L组和MGF-H组海马区TUNEL阳性细胞数量显著减少；MGF-H+ML385组海马区TUNEL阳性细胞数量较MGF-H组显著增多。定量分析结果显示，与CK组比较，Model组海马神经元凋亡率显著升高（P<0.05）；与Model组比较，MGF-L组和MGF-H组海马神经元凋亡率显著降低（P<0.05）；与MGF-H组比较，MGF-H+ML385组海马神经元凋亡率显著升高（P<0.05）。表明MGF可抑制PS小鼠海马神经元凋亡，而ML385可逆转MGF的抗凋亡作用。见图3、表2。

3.5 MGF对小鼠海马组织TNF-α、IL-6、IL-10、IL-1β水平的影响

与CK组比较，Model组的TNF-α、IL-6、IL-1β水平均显著升高，IL-10水平均显著降低（P<0.05）；与Model组比较，MGF-L组和MGF-H组的TNF-α、IL-6、IL-1β水平均显著降低，IL-10水平均显著升高（P<0.05）；与MGF-H组比较，MGF-H+ML385组的TNF-α、IL-6、IL-1β水平均显著升高，IL-10水平显著降低（P<0.05）。表明MGF可抑制PS小鼠海马组织的炎症反应，而ML385可削弱MGF的抗炎作用。见表3。

3.6 MGF对小鼠海马组织MDA含量、SOD和CAT活性的影响

与CK组比较，Model组的MDA含量显著升高，SOD和CAT活性均显著降低（P<0.05）；与Model组比较，MGF-L组和MGF-H组的MDA含量均显著降低，SOD和CAT活性均显著升高（P<0.05）；与MGF-H组比较，MGF-H+ML385组的MDA含量显著升高，SOD和CAT活性均显著降低（P<0.05）。表明MGF可减轻PS小鼠海马组织的氧化应激损伤，而ML385可逆转MGF的抗氧化作用。见表4。

3.7 MGF对小鼠黑质区TH、DAT、α-syn、P62、Nrf2、HO-1蛋白表达水平的影响

与CK组比较，Model组的α-syn、P62蛋白表达水平均显著升高，TH、DAT、Nrf2和HO-1蛋白表达水平均显著降低（P<0.05）；与Model组比较，MGF-L组和MGF-H组的α-syn、P62蛋白表达水平均显著降低，TH、DAT、Nrf2、HO-1蛋白表达水平均显著升高（P<0.05）；与MGF-H组比较，MGF-H+ML385组的α-syn、P62蛋白表达水平均显著升高，TH、DAT、Nrf2、HO-1蛋白表达水平均显著降低（P<0.05）。见图4、表5。

3.8 MGF对小鼠海马组织Nrf2和HO-1蛋白表达水平的影响

与CK组比较，Model组的Nrf2和HO-1蛋白表达水平均显著降低（P<0.05）；与Model组比较，MGF-L组和MGF-H组的Nrf2和HO-1蛋白表达水平均显著升高（P<0.05）；与MGF-H组比较，MGF-H+ML385组的Nrf2和HO-1蛋白表达水平均显著降低（P<0.05）。见图5、表6。

4 讨论

PS是一种以黑质纹状体区多巴胺能神经元缺失和多巴胺含量减少为核心特征的神经退行性疾病^［12］，其发病机制复杂，氧化应激、炎症反应、线粒体功能障碍等多种因素均可引起神经元死亡，进而诱发PS的发生、发展^［13］。研究表明，PS的发病与遗传、环境、个人生活习惯及年龄等多种因素相关，据统计，到2030年全球PS患者人数将超过1 000万，已成为严重威胁人类健康的神经退行性疾病之一^［14］。目前，临床治疗PS的药物主要以缓解症状为主，无法有效延缓疾病进展，因此，开发新型治疗药物及探索其作用机制具有重要的临床意义。MGF是一种从植物中提取的天然多酚化合物，已有大量研究证实其具有改善神经退行性病变的生物学功能^［15］。Huang W等^［15］的研究结果显示，MGF可减轻PS小鼠的氧化应激、线粒体功能障碍及神经细胞损伤，显著改善小鼠的运动功能。Zhou H等^［16］的研究也证实，MGF可减轻PS小鼠的氧化损伤，提高抗氧化酶活性，改善其运动功能。据此推测，MGF对PS具有潜在的治疗效果。

已有研究证实，炎症反应和氧化应激是PS发生、发展的关键环节，神经炎症和氧化损伤可诱导神经细胞凋亡，进一步加重PS的病理损伤。TNF-α、IL-6、IL-1β是重要的促炎细胞因子，其过度表达可加重组织炎症损伤，诱导细胞凋亡。IL-10是主要的抗炎细胞因子，可通过抑制促炎因子的表达和释放，减轻炎性损伤。MDA为脂质过氧化的终产物，其含量可直接反映细胞氧化损伤的程度。CAT和SOD是机体重要的抗氧化酶，可清除体内氧自由基和活性氧，降低组织氧化损伤^［8］。本研究结果显示，PS模型小鼠海马组织中促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平及氧化产物MDA含量均显著升高，抗炎因子IL-10水平及抗氧化酶SOD和CAT活性均显著降低；而MGF干预后，可显著降低促炎因子的表达和MDA含量，提高抗炎因子水平和抗氧化酶活性，表明MGF可通过抑制炎症反应和氧化应激，减轻PS小鼠的神经损伤。

PS是一种神经系统疾病，其核心病理特征是黑质致密部多巴胺能神经元死亡，导致纹状体末端DA含量减少。TH是DA合成通路中的限速酶，其表达水平降低会直接导致DA合成减少。DAT是位于DA神经元突触前膜的转运蛋白，可将突触间隙的DA主动摄取回突触前膜，维持突触的正常生理功能，其表达水平可反映纹状体突触前多巴胺能神经纤维末梢的功能状态^［17］。本研究结果显示，模型组小鼠的黑质区TH、DAT蛋白表达水平均显著降低，表明PS小鼠的多巴胺能神经元功能受损；而MGF干预后，TH、DAT蛋白表达水平均显著升高，表明MGF可改善多巴胺能神经元功能，增加DA的合成与转运，从而减轻神经损伤。此外，PS的另一个典型病理特征是毒性α-syn错误折叠聚集形成路易氏小体，大量聚集的α-syn可促进PS的进展。自噬是细胞的一种自我保护机制，可介导细胞内异常蛋白及受损细胞器的降解，α-syn大量聚集后可诱导自噬途径激活，从而降解异常聚集的α-syn，发挥神经保护作用；P62作为自噬通路中的关键调控蛋白，当自噬通路被抑制时，P62无法被有效降解而在细胞内蓄积，进而导致α-syn等毒性蛋白的异常聚集，加重神经元损伤^［18］。本研究结果显示，Model组小鼠的黑质区α-syn、P62蛋白表达水平均显著升高，表明PS小鼠存在α-syn异常聚集和自噬功能受损；MGF干预后，α-syn和P62蛋白表达水平均显著降低，结合HE染色和透射电镜观察结果发现，MGF可显著改善小鼠黑质区神经元的形态和线粒体结构，减轻神经损伤，同时改善小鼠运动功能。以上结果表明，MGF可通过降低PS小鼠的炎症反应、氧化应激及神经元凋亡，减轻神经损伤，改善其运动功能。

Nrf2/HO-1信号通路是机体调控氧化损伤和炎症反应的关键通路，Nrf2作为一种转录因子，在正常状态下与抑制蛋白结合形成复合体，处于静息状态；当机体受到氧化应激或炎症刺激时，Nrf2被激活并进入细胞核，进一步激活下游HO-1等抗氧化基因的表达。HO-1过表达可通过清除氧自由基、抑制促炎因子表达，从而抑制炎症反应和氧化损伤，发挥细胞保护作用^［19］。Lü Q K等^［19］的研究结果显示，抑制Nrf2/HO-1信号通路可诱导α-syn蛋白聚集和神经元铁死亡，导致神经损伤和运动功能障碍。Zhang J等^［20］的研究也证实，激活Nrf2/HO-1信号通路可降低黑质区多巴胺能神经元的氧化损伤和凋亡，改善小鼠运动功能。本研究结果显示，Model组小鼠黑质区和海马组织中Nrf2、HO-1蛋白的表达水平均显著降低，表明PS小鼠的Nrf2/HO-1信号通路被抑制；MGF干预后，Nrf2、HO-1蛋白表达水平均显著提高，表明MGF可激活Nrf2/HO-1信号通路。为进一步验证MGF的作用靶点，本研究在MGF干预的基础上加入Nrf2/HO-1信号通路抑制剂ML385，结果显示，ML385可显著降低MGF对PS小鼠神经损伤的改善作用。综合以上结果可知，MGF可通过激活Nrf2/HO-1信号通路，发挥对PS小鼠的神经保护作用。

综上所述，MGF可通过激活Nrf2/HO-1信号通路，降低PS小鼠的炎症反应、氧化应激水平及神经元凋亡率，减轻神经损伤，进而改善其运动功能。由于PS的发病机制极为复杂，MGF调控Nrf2/HO-1信号通路的具体分子机制仍需进一步深入研究，为MGF用于PS的临床治疗提供更充分的实验依据。

参考文献

[1] Tang F， Zhou L Y， Li P，et al. Inhibition of ACSL4 alleviates Parkinsonism phenotypes by reduction of lipid reactive oxygen species［J］. Neurotherapeutics，2023，20（4）：1154-1166．

[2] 刘茂林，郝永茂，李丰，等. 丁苯酞联合多奈哌齐对老年帕金森病患者自主神经功能、认知功能及血清神经导向因子-1水平的影响［J］. 西北药学杂志，2025，40（1）：147-152．

[3] Liu Maolin， Hao Yongmao， Li Feng，et al. Influence of the combination therapy of butylphthalide and donepezil on autonomic nervous system function，cognitive function and serum netrin-1 level in elderly Parkinson’s disease patients［J］. Northwest Pharmaceutical Journal，2025，40（1）：147-152．

[4] Ciocca M， Seemungal B M， Tai Y F. Spinal cord stimulation for gait disorders in Parkinson’s disease and atypical Parkinsonism：A systematic review of preclinical and clinical data［J］. Neuromodulation，2023，26（7）：1339-1361．

[5] He Z， Zhu H， Liu J，et al. Mangiferin alleviates trimethylamine-N-oxide （TMAO）-induced atherogenesis and modulates gut microbiota in mice［J］. Food Funct，2023，14（20）：9212-9225．

[6] Feng S T， Wang Z Z， Yuan Y H，et al. Mangiferin：A multipotent natural product preventing neurodegeneration in Alzheimer’s and Parkinson’s disease models［J］. Pharmacol Res，2019，146：104336．

[7] Lum P T， Sekar M， Seow L J，et al. Neuroprotective potency of mangiferin against 3-nitropropionic acid induced Huntington’s disease-like symptoms in rats：Possible antioxidant and anti-inflammatory mechanisms［J］. Front Pharmacol，2023，14：1189957．

[8] Ren J， Yuan L， Wang W，et al. Tricetin protects against 6-OHDA-induced neurotoxicity in Parkinson’s disease model by activating Nrf2/HO-1 signaling pathway and preventing mitochondria-dependent apoptosis pathway［J］. Toxicol Appl Pharmacol，2019，378：114617．

[9] Huang B， Hu G， Zong X，et al. α-Cyperone protects dopaminergic neurons and inhibits neuroinflammation in LPS-induced Parkinson’s disease rat model via activating Nrf2/HO-1 and suppressing NF-κB signaling pathway［J］. Int Immunopharmacol，2023，115：109698．

[10] 李华，赵颖倩，郭婕，等. 电针调节CD8⁺T细胞对帕金森病模型小鼠黑质区神经元损伤的保护机制研究［J］. 中国康复医学杂志，2023，38（9）：1177-1184．

[11] Li Hua， Zhao Yingqian， Guo Jie，et al. Effects of electroacupuncture on the protection of CD8⁺T cell neurons in substantia nigra in Parkinson’s disease model mice［J］. Chinese Journal of Rehabilitation Medicine，2023，38（9）：1177-1184．

[12] 张蕾，赵国发，李楠，等. 芒果苷通过作用于NLRP3炎症小体发挥抗抑郁和神经保护作用［J］. 河北大学学报：自然科学版，2021，41（3）：265-272．

[13] Zhang Lei， Zhao Guofa， Li Nan，et al. Mangiferin reduces stress induced depressive-like behavior and exerts a neuroprotective effect by inhibition of the NLRP3 inflammasome［J］. Journal of Hebei University：Natural Science Edition，2021，41（3）：265-272．

[14] 易宇光，刘昌平，何佳佳. 基于Nrf2/HO-1信号通路探讨虾青素对创伤性脑损伤模型大鼠氧化应激和炎症反应的影响［J］. 中国药房，2023，34（20）：2490-2496．

[15] Yi Yuguang， Liu Changping， He Jiajia. Effects of astaxanthin on oxidative stress and inflammatory reaction in rats with traumatic brain injury based on Nrf2/HO-1 signaling pathway［J］. China Pharmacy，2023，34（20）：2490-2496．

[16] 蒋二丽，常征，贾中兴，等. 疏肝解郁安神汤辅助治疗帕金森病伴睡眠障碍及抑郁的疗效［J］. 西北药学杂志，2024，39（5）：212-217．

[17] Jiang Erli， Chang Zheng， Jia Zhongxing，et al. Efficacy of Shugan Jieyu Anshen Decoction in the adjunctive treatment of Parkinson’s disease with sleep disorder and depression［J］. Northwest Pharmaceutical Journal，2024，39（5）：212-217．

[18] Goldman S M， Weaver F M， Stroupe K T，et al. Risk of Parkinson disease among service members at marine corps base camp Lejeune［J］. JAMA Neurol，2023，80（7）：673-681．

[19] 祁羚，李亚楠，汪瑶，等. 电针对帕金森病模型小鼠运动功能的影响及相关分子机制探讨［J］. 北京中医药大学学报，2024，47（5）：721-728．

[20] Qi Ling， Li Yanan， Wang Yao，et al. Effects of electroacupuncture on motor function and related molecular mechanisms in mice with Parkinson’s disease［J］. Journal of Beijing University of Traditional Chinese Medicine，2024，47（5）：721-728．

[21] Huang W， Wang Y， Huang W. Mangiferin alleviates 6-OHDA-induced Parkinson’s disease by inhibiting AKR1C3 to activate Wnt signaling pathway［J］. Neurosci Lett，2024，821：137608．

[22] Zhou H， Mao Z， Zhang X，et al. Neuroprotective effect of mangiferin against Parkinson’s disease through G-protein-coupled receptor-interacting protein 1 （GIT1）-mediated antioxidant defense［J］. ACS Chem Neurosci，2023：10（2）：127-138．

[23] Gopinath A， Mackie P， Hashimi B，et al. DAT and TH expression marks human Parkinson’s disease in peripheral immune cells［J］. NPJ Parkinsons Dis，2022，8（1）：72．

[24] 张歆悦，祝柳慧，何雨，等. 尼古丁对鱼藤酮诱导帕金森病小鼠模型的神经保护作用机制［J］. 中国组织工程研究，2024，28（35）：5612-5617．

[25] Zhang Xinyue， Zhu Liuhui， He Yu，et al. Neuroprotective mechanism of nicotine in a mouse model of rotenone-induced Parkinson’s disease［J］. Chinese Journal of Tissue Engineering Research，2024，28（35）：5612-5617．

[26] Lü Q K， Tao K X， Yao X Y，et al. Melatonin MT1 receptors regulate the Sirt1/Nrf2/Ho-1/Gpx4 pathway to prevent α-synuclein-induced ferroptosis in Parkinson’s disease［J］. J Pineal Res，2024，76（2）：e12948．

[27] Zhang J， Bai Q， Wen Q，et al. Paeoniflorin protects 1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine-induced Parkinson’s disease mice by inhibiting oxidative stress and neuronal apoptosis through activating the Nrf2/HO-1 signaling pathway［J］. Neuroreport，2023，34（5）：255-266．

基金资助

河北省医学科学研究课题计划项目(20200705)