红景天苷通过调节大鼠肉瘤蛋白/加速纤维肉瘤蛋白/细胞外信号调节激酶1/2信号通路对冠心病大鼠血管内皮损伤的影响

Effect of salidroside on endothelial injury in coronary heart disease rats by regulating the rat sarcoma protein/rapidly accelerated fibrosarcoma/extracellular signal-regulated kinase 1/2 signaling pathway

摘要

目的 探讨红景天苷（salidroside，SAL）通过调节大鼠肉瘤蛋白（rat sarcoma， Ras）/加速纤维肉瘤蛋白（rapidly accelerated fibrosarcoma， Raf）/细胞外信号调节激酶1/2（extracellular signal regulated kinase 1/2，ERK1/2）信号通路，对冠心病（coronary heart disease， CHD）大鼠血管内皮损伤的保护作用及机制。 方法 构建CHD大鼠模型，随机分为CHD组、ERK抑制剂SCH772984组（腹腔注射15 mg·kg^-1 SCH772984），红景天苷低剂量（low-dose salidroside，L-SAL）组、中剂量（medium-dose salidroside， M-SAL）组、高剂量（high-dose salidroside，H-SAL）组（分别腹腔注射7.5、15.0、30.0 mg·kg^-1 SAL），SAL+ERK激活剂特丁基对苯二酚（tert-butylhydroquinone， TBHQ）组（腹腔注射30 mg·kg^-1 SAL+35 mg·kg^-1 TBHQ），每组10只；另随机选取10只正常大鼠作为对照组。对照组和CHD组给予等量生理盐水。采用超声心动图评估心功能；苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色观察冠状动脉血管组织病理形态；全自动生化分析仪检测血清三酰甘油（triglyceride，TG）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL-C）、高密度脂蛋白（high-density lipoprotein，HDL-C）水平；酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA）检测内皮活性物质［一氧化氮（nitric oxide，NO）、内皮素-1（endothelin-1， ET-1）］水平；Western blotting检测冠状动脉血管组织Ras、Raf、ERK1/2蛋白表达。 结果 对照组内皮细胞排列有序，动脉血管管壁形态均匀，无炎性细胞浸润；与对照组比较，CHD组内皮细胞排列紊乱、内膜部分脱落伴有大量炎性细胞浸润，左室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF）、左心室缩短分数（left ventricular shortening fraction，LVFS）、HDL-C、NO表达均显著降低，TC、TG、LDL-C、ET-1水平及Ras、Raf、ERK1/2蛋白表达均显著升高（P<0.05）；与CHD组比较，SCH772984组及L-SAL组、M-SAL组、H-SAL组的内皮细胞排列较为规整，炎性细胞浸润减轻，LVEF、LVFS、HDL-C、NO水平均显著升高，TC、TG、LDL-C、ET-1水平及Ras、Raf、ERK1/2蛋白表达显著降低（P<0.05）；与H-SAL组比较，SAL+TBHQ组内皮细胞损伤且炎性细胞浸润加重，LVEF、LVFS、HDL-C、NO水平均显著降低，TC、TG、LDL-C、ET-1水平及Ras、Raf、ERK1/2蛋白表达均显著升高（P<0.05）。 结论 SAL可改善CHD大鼠血管内皮损伤，其机制可能与抑制Ras/Raf/ERK1/2信号通路活化有关。

Abstract

Objective To investigate the protective effect and mechanism of salidroside （SAL） on endothelial injury in rats with coronary heart disease （CHD） by regulating the rat sarcoma protein （Ras）/rapidly accelerated fibrosarcoma （Raf）/extracellular signal-regulated kinase 1/2 （ERK1/2） signaling pathway. Methods A CHD rat model was constructed and randomly divided into CHD group， ERK inhibitor SCH772984 group （intraperitoneal injection of 15 mg·kg^-1 SCH772984）， low-dose salidroside group （L-SAL）， medium-dose salidroside group （M-SAL）， high-dose salidroside group （H-SAL） （intraperitoneal injection of 7.5， 15.0， and 30.0 mg·kg^-1 SAL， respectively）， and SAL+ ERK activator tert-butylhydroquinone（TBHQ） group （injection of 30 mg·kg^-1 SAL+35 mg·kg^-1 TBHQ）， with 10 rats in each group. Additionally； 10 normal fed rats were randomly selected as control group. The control group and CHD group were given the same amount of physiological saline. The cardiac function was evaluated by echocardiography. Hematoxylin-eosin （HE） staining was applied to observe the histopathological morphology in coronary artery vascular tissue. Automatic biochemical analyzer was applied to detect the levels of triglyceride （TG）， total cholesterol （TC）， low-density lipoprotein （LDL-C）， and high-density lipoprotein （HDL-C） in the serum of CHD rats. Enzyme-linked immunosorbnent assay （ELISA） was applied to detect the levels of endothelial active substances ［nitric oxide （NO） and endothelin-1 （ET-1）］ in CHD rats. Western blotting was applied to detect the expression of Ras， Raf， and ERK1/2 proteins in coronary artery tissue. Results The endothelial cells in the control group were arranged in an orderly manner， with uniform morphology of arterial vessel walls and no inflammatory cell infiltration. Compared with the control group， the CHD group showed disordered arrangement of endothelial cells， partial shedding of the intima， accompanied by extensive inflammatory cell infiltration， as well as significantly decreased left ventricular ejection fraction （LVEF）， left ventricular shortening fraction （LVFS）， HDL-C， and NO expression， while the levels of TC， TG， LDL-C， ET-1， and the expression of Ras， Raf， and ERK1/2 proteins were significantly increased （P<0.05）. Compared with the CHD group， the SCH772984 group， L-SAL group， M-SAL group， and H-SAL group exhibited a more regular arrangement of endothelial cells， alleviated inflammatory cell infiltration， significantly increased levels of LVEF， LVFS， HDL-C， and NO， and significantly decreased levels of TC， TG， LDL-C， ET-1， along with reduced expression of Ras， Raf， and ERK1/2 proteins （P<0.05）. Compared with the H-SAL group， the SAL+TBHQ group displayed endothelial cell damage and aggravated inflammatory cell infiltration， significantly decreased levels of LVEF， LVFS， HDL-C， and NO， and significantly increased levels of TC， TG， LDL-C， ET-1， as well as elevated expression of Ras， Raf， and ERK1/2 proteins （P<0.05）. Conclusion SAL can improve vascular endothelial injury in CHD rats， and its mechanism may be related to the inhibition of the activation of the Ras/Raf/ERK1/2 signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

红景天苷 / 大鼠肉瘤蛋白/加速纤维肉瘤蛋白/细胞外信号调节激酶1/2信号通路 / 冠心病 / 血管内皮损伤

Key words

salidroside / rat sarcoma protein/rapidly accelerated fibrosarcoma/extracellular signal regulated kinase 1/2 signaling pathway / coronary heart disease / vascular endothelial injury

冠心病（coronary heart disease， CHD）是常见的心血管疾病（cardiovascular disease， CVD），是世界范围内导致死亡和残疾的主要原因之一，也是导致35岁以上人群死亡的第三大原因。CHD同样是我国居民的主要死亡原因，在大多数低、中等收入国家，CHD的疾病负担正迅速加重，已成为亟待解决的重大公共卫生问题^［1］。

目前，经皮冠状动脉介入治疗和冠状动脉旁路移植术已广泛应用于CHD的临床治疗，显著改善了患者的临床症状和远期预后，但仍有部分患者因CHD病情复杂或存在严重弥漫性病变，导致药物和手术治疗效果不佳^［2］。血管内皮作为血管壁的重要屏障，其连接功能可维持血管稳态，保护血管组织免受各类危险因素的损伤，并通过细胞旁通路调节组织与血液间的物质交换。内皮功能障碍是血管早期损伤的特征性标志，可破坏血管稳态，是导致CHD发生、发展的重要原因^［3］。因此，深入探讨CHD患者血管内皮损伤的分子机制，对提高CHD的治疗效果、改善患者预后具有重要的理论意义和临床价值。

大鼠肉瘤蛋白（rat sarcoma，Ras）是参与正常细胞增殖、分化和恶性转化的重要调控分子，致癌性Ras激活后可通过其广泛的下游信号通路调控多种细胞生物学过程，包括抑制细胞凋亡、促进细胞增殖等。加速纤维肉瘤蛋白（rapid accelerated fibrosarcoma，Raf）/细胞外信号调节激酶1/2（extracellular signal regulated kinase 1/2，ERK1/2）通路作为Ras下游的关键信号级联通路，在多种重大疾病的发展中发挥着重要的作用^［4］。相关研究表明，在动脉粥样硬化的发展过程中，Ras/Raf/ERK1/2通路的异常激活可驱动血管钙化，进而参与CHD的病理进程^［5］。

红景天苷（salidroside，SAL）是从红景天属植物中提取的小分子活性糖苷，具有抗氧化、抗炎等多种生物活性，目前已被广泛应用于CHD、心肌缺血等心血管疾病的相关研究中^［6］。然而，SAL是否通过调节Ras/Raf/ERK1/2信号通路改善CHD大鼠的血管内皮损伤，其具体作用机制目前尚不明确，亟需进一步深入研究。因此，本研究探讨SAL对CHD大鼠血管内皮损伤的影响及其作用机制，为CHD的临床治疗提供新的思路和实验依据，以提高CHD的治疗效果。

1 仪器与材料

1.1 仪器

BK-400型博科全自动生化分析仪（济南久祥生物技术有限公司）；SPECTRO star Omega型多功能酶标仪（北京融京科技发展有限公司）；H1850型离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；UR820型小动物超声成像系统（上海玉研科学仪器有限公司）；ES300型组织石蜡包埋机（北京莱博瑞杰科技有限公司）；HM325型石蜡切片机（美国Thermo Fisher Scientific）；PES-60型垂直电泳仪（四川杰莱美科技有限公司）；ChemiDoc Go型荧光及化学发光成像系统（上海伯乐生命医学产品有限公司）。

1.2 试药

SAL（批号QY-D10847，质量分数≥98%，上海岑特生物科技有限公司）；特丁基对苯二酚（tert-butylhydroquinone，TBHQ，批号HY-100489，美国MedChemExpress公司）；内皮素1（endothelin-1，ET-1）酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（批号J22757）、一氧化氮（nitric oxide，NO）ELISA试剂盒（批号J23183），均购自武汉吉立德生物科技有限公司；苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色试剂盒（批号YX-DK00686，浙江羽翔生物科技有限公司）；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量试剂盒（批号Bl-WB005，南京森贝伽生物科技有限公司）；增强型化学发光（enhanced chemiluminescence，ECL）试剂盒（批号DDM1547A，上海西宝生物科技股份有限公司）；β-肌动蛋白（β-actin，批号ab156302）、Ras（批号ab108602）、Raf（批号ab200653）、ERK1/2（批号ab17942）、辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP，批号ab6734），均购自英国Abcam公司。

1.3 实验动物

斯普拉格-道利（Sprague-Dawley，SD）大鼠，体质量为230~350 g，购自杭州希科检测技术有限公司，饲养在标准动物室内，室温为（20.5±1.2） ℃，湿度为（50.3%±3%），自由进食、饮水。

2 方法

2.1 动物建模、分组和给药

大鼠前6周给予高脂饲料喂养，随后腹腔注射盐酸异丙肾上腺素5 mg·kg^-1，每日1次，连续注射3 d。3 d后，采用0.3 mL·100 mg^-1 体积分数10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠，通过心电图观察ST段变化，当心电图ST段升高≥0.1 mV时，表明CHD大鼠模型构建成功^［7］。

另选取10只正常饲养的大鼠作为对照组，该组前6周给予正常饲料喂养，随后腹腔注射等量生理盐水。将建模成功的大鼠随机分为5组，每组10只，分别为CHD组、SCH772984组、L-SAL组、M-SAL组、H-SAL组、SAL+TBHQ组。其中，SCH772984组腹腔注射15 mg·kg^-1 ERK抑制剂SCH772984^［8］；L-SAL组、M-SAL组、H-SAL组分别腹腔注射7.5、15.0、30.0 mg·kg^-1 SAL^［9］，SAL+TBHQ组腹腔注射30 mg·kg^-1 SAL联合35 mg·kg^-1 ERK激活剂TBHQ^［10］。对照组和CHD组腹腔注射等量生理盐水，所有组均连续给药7 d。

2.2 超声心动图评估大鼠的心功能

采用超声心动图系统测量各组大鼠的左心室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF）和左心室缩短分数（left ventricular shortening fraction，LVFS），记录并统计数据。

2.3 样本采集

采用40 mg·kg^-1戊巴比妥钠腹腔麻醉大鼠，分离大鼠颈总动脉并取血，将血液置于4 ℃离心机中，以9 690 r·min^-1离心5 min，取血清，置于-80 ℃冰箱中保存备用。同时，取大鼠冠状动脉，分别用于组织学和蛋白表达检测。

2.4 HE染色观察冠状动脉血管组织病理形态

将冠状动脉血管组织置于体积分数10%多聚甲醛缓冲液中固定，常规石蜡包埋后制成5 μm厚切片；将切片在室温下用HE染色液染色5 min，染色完成后置于显微镜下观察冠状动脉血管组织病理形态，并进行相关统计分析。

2.5 全自动生化分析仪检测血清脂质指标的含量

采用全自动生化分析仪及配套试剂盒，严格按照试剂盒说明书操作，检测各组大鼠血清中三酰甘油（triglyceride，TG）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL-C）、高密度脂蛋白（high-density lipoprotein，HDL-C）的含量。

2.6 ELISA检测大鼠内皮活性物质的水平

按照ELISA试剂盒说明书进行操作，将预先包被大鼠NO、ET-1抗体的微孔板取出，依次加入样品、对照品和HRP标记的抗体，每步操作后进行清洗；最后在450 nm波长处测定光密度值，根据标准曲线计算NO、ET-1的浓度。

2.7 Western blotting检测冠状动脉血管组织相关蛋白的表达

采用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的放射免疫沉淀分析缓冲液（radioimmunoprecipitation assay buffer，RIPA）提取冠状动脉组织总蛋白，离心匀浆后，采用BCA蛋白测定法测定总蛋白含量；将蛋白样品进行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），电泳完成后转移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，用5%脱脂乳或牛血清白蛋白封闭；加入β-actin、Ras、Raf、ERK1/2一抗（稀释比均为1∶1 000），4 ℃孵育过夜；次日用含吐温-20的Tris缓冲盐溶液（Tris-buffered saline with Tween 20，TBST）清洗膜后，加入二抗（稀释比1∶1 000），室温孵育1 h；最后采用ECL试剂在成像系统下对蛋白质条带进行成像，使用Image J软件测量条带灰度值，以β-actin为内参进行归一化处理，计算各蛋白的相对表达量。

2.8 统计学方法

采用SPSS 26.0软件分析数据。符合正态分布的计量资料用（\overline{x}\pm s）表示，数据正态性通过Shapiro-Wilk检验进行验证。组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 大鼠心功能的比较

与对照组比较，CHD组的LVEF、LVFS均显著降低（P<0.05）；与CHD组比较，SCH772984组、L-SAL组、M-SAL组、H-SAL组的LVEF、LVFS均显著升高，且各SAL组且呈剂量依赖性（P<0.05）；与H-SAL组比较，SAL+TBHQ组的LVEF、LVFS均显著降低（P<0.05）。见表1。

3.2 冠状动脉血管组织病理形态的比较

对照组内皮细胞排列有序，动脉血管管壁形态均匀，无炎性细胞浸润；CHD组内皮细胞排列紊乱，内膜部分脱落，伴有大量炎性细胞浸润；SCH772984组和L-SAL组、M-SAL组、H-SAL组内皮细胞排列较为有序，炎性细胞浸润减少；SAL+TBHQ组内皮细胞排列混乱，炎性细胞浸润增加。见图1。

3.3 血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C表达的比较

与对照组比较，CHD组的TC、TG、LDL-C表达均显著升高，HDL-C表达显著降低（P<0.05）；与CHD组比较，SCH772984组、L-SAL组、M-SAL组、H-SAL组的TC、TG、LDL-C表达均显著降低，HDL-C表达均显著升高，且各SAL组呈剂量依赖性（P<0.05）；与H-SAL组比较，SAL+TBHQ组的TC、TG、LDL-C表达均显著升高，HDL-C表达显著降低（P<0.05）。见表2。

3.4 内皮活性物质的比较

与对照组比较，CHD组的ET-1显著升高，NO显著降低（P<0.05）；与CHD组比较，SCH772984组、L-SAL组、M-SAL组、H-SAL组的ET-1均显著降低，NO均显著升高，且各SAL组呈剂量依赖性（P<0.05）；与H-SAL组比较，SAL+TBHQ组的ET-1显著升高，NO显著降低（P<0.05）。见表3。

3.5 冠状动脉血管组织中Ras、Raf、ERK1/2蛋白通路蛋白表达的比较

与对照组比较，CHD组的Ras、Raf、ERK1/2蛋白表达均显著升高（P<0.05）；与CHD组比较，SCH772984组、L-SAL组、M-SAL组、H-SAL组的Ras、Raf、ERK1/2蛋白表达均显著降低，且各SAL组呈剂量依赖性（P<0.05）；与H-SAL组比较，SAL+TBHQ组的Ras、Raf、ERK1/2蛋白表达均显著升高（P<0.05）。见图2、表4。

4 讨论

CHD是一种高发的心血管疾病，主要由动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）引起，导致冠状动脉管腔或微血管变窄或阻塞，主要症状包括胸闷、胸痛、心悸、呼吸困难等^［11］。高血压、高脂血症、糖尿病、吸烟、肥胖等是CHD的主要风险因素，心理压力和不良饮食习惯亦会增加动脉粥样硬化及CHD的发病风险^［12］。CHD的病理机制主要与血管内皮损伤（ET-1升高，NO降低）相关，内皮功能障碍导致脂质沉积（TC、TG、HDL-C升高，HDL-C降低）、炎性浸润，进而形成AS斑块，引起LVEF、LVFS等心功能指标下降，最终导致血管狭窄和心肌缺血^［13］。因此，深入探讨CHD血管内皮损伤的分子机制，对CHD的防治具有重要意义。本研究通过构建CHD大鼠模型发现，模型大鼠的LVEF、LVFS等心功能指标显著下降，TC、TG、HDL-C水平升高，HDL-C水平降低，冠状动脉血管组织出现明显炎性细胞浸润和血管内皮损伤，与上述病理特征一致。

ERK1/2蛋白是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，Ras/Raf/ERK1/2通路在细胞增殖和分化中起重要作用，研究表明该通路的激活可促进肿瘤增殖及炎症反应^［14］，并在多种疾病的发生和发展中发挥关键作用。Tiong Y L等^［15］研究发现，Ras/Raf/ERK通路激活可导致原代神经元细胞周期阻滞并促进分化，而褪黑激素可通过抑制Ras/Raf/ERK通路诱导施万细胞去分化和增殖，进而促进周围神经损伤的恢复。Leung H K M等^［16］研究发现，玉米赤霉烯酮可通过抑制Ras/Raf/ERK通路和促进短链脂肪酸产生，减轻结肠炎相关结直肠肿瘤的发生。Hu T等^［17］研究发现，G蛋白通路抑制因子2可通过抑制Ras/Raf/ERK信号通路，调节吸烟诱导的肺血管重塑。Huang T等^［18］研究发现，INK4基因座反义非编码RNA（antisense noncoding RNA in the INK4 locus，LncRNA ANRIL）通过海绵化miR-399-5p、调控Ras/Raf/ERK信号通路，促进AS进展。本研究结果显示，CHD大鼠冠状动脉组织中Ras、Raf、ERK1/2蛋白表达显著升高；采用ERK抑制剂SCH772984处理后，Ras、Raf、ERK1/2蛋白表达显著降低，同时TC、TG、HDL-C等水平下降，HDL-C水平升高，血管内皮损伤减轻，LVEF、LVFS提高，心功能改善，表明Ras/Raf/ERK1/2通路的异常激活是导致CHD发生、发展的重要原因之一。

SAL具有良好的安全性，可降低血脂异常，改善血液循环，增强机体免疫力，在体内外均表现出多重心脏保护作用^［19］。Tu Z等^［20］研究发现，SAL可通过Notch-整合素β₁亚基信号通路促进促血管生成，保护血脑屏障免受破坏，表明SAL可能是治疗脑血管疾病的潜在候选药物。Li X等^［21］研究发现，SAL注射液可提高心力衰竭大鼠的LVEF和LVFS，使肾血管紧张素-醛固酮系统指标恢复至正常水平，有望成为治疗心力衰竭的潜在新药物。Hsiao Y W等^［22］研究发现，SAL可抑制IL-17及其下游靶基因的表达，降低纤维化和凋亡水平，从而抑制室性心律失常。Yang Y等^［23］研究发现，SAL可通过抑制环状RNA 0097682（circular RNA 0097682，circ_0097682）/微小RNA 671-5p（microRNA 671-5p，miR-671-5p）/泛素特异性蛋白酶46（ubiquitin specific peptidase 46，USP46）通路，改善缺血/再灌注诱导的心肌细胞损伤。Chen P等^［24］研究发现，给心肌梗死小鼠模型注射SAL可显著降低死亡率，改善心功能，减少纤维化和梗死面积；口服SAL可减轻心肌炎症和细胞凋亡，促进血管生成，缓解心肌重塑的病理过程，表明SAL可能是治疗缺血性心血管疾病的潜在有效药物。本研究结果显示，SAL以剂量依赖的方式抑制Ras/Raf/ERK1/2信号通路，降低Ras、Raf、ERK1/2蛋白表达，进而提高LVEF、LVFS水平以改善心功能，降低TC、TG、HDL-C等的水平，抑制血管内皮损伤。此外，ERK激活剂THBQ能逆转SAL的上述保护作用，进一步验证了SAL通过调控Ras/Raf/ERK1/2信号通路发挥CHD保护作用的机制。

综上所述，SAL通过抑制Ras/Raf/ERK1/2信号通路可有效缓解CHD大鼠血管内皮损伤，改善心功能及血脂代谢。但本研究仅聚焦于该信号通路，未来研究可进一步探索SAL发挥作用的其他潜在机制，并验证其临床应用潜力，为CHD的临床治疗提供新思路。

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基金资助

河南省医学科技攻关计划项目(LHGJ20200692)