依帕司他联合黄连紫草湿性敷料对糖尿病溃疡大鼠核因子- κ B/c-Jun氨基末端激酶/磷脂酰肌醇3-激酶通路及巨噬细胞极化的影响

Effects of epalrestat combined with Coptis chinensis-Radix lithospermi wet dressing on nuclear transcription factor- κ B/c-Jun N-terminal kinase/phosphatidylinositol 3-kinase pathway and macrophage polarization in diabetic ulcer rats

摘要

目的 探究依帕司他联合黄连紫草湿性敷料对糖尿病溃疡（diabetes ulcer，DU）大鼠核因子-κB/c-Jun氨基末端激酶/磷脂酰肌醇3-激酶（nuclear transcription factor-κB/c-Jun N-terminal kinase/ phosphatidylinositol 3-kinase，NF-κB/JNK/PI3K）通路及巨噬细胞极化的调控作用。 方法 将75只大鼠随机分为对照组、模型组、依帕司他组、黄连紫草湿性敷料组、依帕司他联合黄连紫草湿性敷料组，每组15只。建立DU大鼠模型。依帕司他组给予依帕司他100 mg·kg^-1灌胃；黄连紫草湿性敷料组给予创面外敷黄连紫草湿性敷料；依帕司他联合黄连紫草湿性敷料组给予依帕司他100 mg·kg^-1灌胃联合黄连紫草湿性敷料外敷；对照组、模型组给予质量分数5%羧甲基纤维素钠灌胃并外敷碘伏纱布，连续干预15 d。检测各组大鼠的创面愈合率；采用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测血清干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ）、白细胞介素（interleukin，IL）-1β、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、IL-4、IL-10、IL-13水平；通过苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色、Masson染色观察创面组织病理学改变及胶原沉积情况；通过流式细胞术检测创面组织M1/M2型巨噬细胞比例；免疫组织化学技术、蛋白印迹法（Western blotting）检测创面组织中B淋巴细胞抗原B7-2（B-lymphocyte activating antigen B7-2，CD86）、诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、Toll样受体4（Toll like receptor 4，TLR-4）、巨噬细胞甘露糖受体（macrophage mannose receptor，CD206）、抵抗素样α（resistin like α，Retnlα）、几丁质酶样3（chitinase 3-like 1，Chil3）、NF-κB p65、p-NF-κB p65、JNK、p-JNK、PI3K、p-PI3K的表达水平。 结果 与对照组比较，模型组大鼠的创面愈合率显著降低，创面组织炎性浸润明显，胶原和新生血管生成较少；血清IFN-γ、IL-1β、TNF-α水平均显著升高，IL-4、IL-10、IL-13水平均显著降低，创面组织M1型巨噬细胞比例显著升高，CD86、iNOS、TLR-4、p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-JNK/JNK表达均显著升高；M2型巨噬细胞比例显著降低，CD206、Retnlα、Chil3、p-PI3K/PI3K表达均显著降低（P<0.05）。与模型组比较，依帕司他组、黄连紫草湿性敷料组、依帕司他联合黄连紫草湿性敷料组大鼠的创面愈合率均显著升高，创面组织炎性浸润均减少，胶原和血管生成均增多；血清IFN-γ、IL-1β、TNF-α水平均显著降低；IL-4、IL-10、IL-13水平均显著升高；M1型巨噬细胞比例均显著降低，CD86、iNOS、TLR-4、p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-JNK/JNK表达均显著降低；M2型巨噬细胞比例均显著升高，CD206、Retnlα、Chil3、p-PI3K/PI3K表达均显著升高；且依帕司他联合黄连紫草湿性敷料组作用效果优于依帕司他组和黄连紫草湿性敷料组（P<0.05）。 结论 依帕司他联合黄连紫草湿性敷料可通过调节NF-κB/JNK/PI3K通路及巨噬细胞极化，减轻局部炎症反应，促进DU大鼠创面愈合。

Abstract

Objective To investigate the regulatory effects of epalrestat combined with Coptis chinensis-Radix lithospermi wet dressing on the nuclear transcription factor-κB/c-Jun N-terminal kinase/phosphatidylinositol 3-kinase （NF-κB/JNK/PI3K） pathway and macrophage polarization in diabetic ulcer （DU） rats. Methods Seventy-five rats were randomly divided into control group， model group， epalrestat group， Coptis chinensis-Radix lithospermi wet dressing group， and epalrestat combined with Coptis chinensis-Radix lithospermi wet dressing group， with 15 rats in each group. The DU rat model was established. The epalrestat group was given 100 mg·kg^-1 epalrestat by gavage. The Coptis chinensis-Radix lithospermi wet dressing group received topical application of Coptis chinensis-Radix lithospermi wet dressing on the wound surface. The epalrestat combined with Coptis chinensis-Radix lithospermi wet dressing group was given 100 mg·kg^-1 epalrestat by gavage combined with topical Coptis chinensis-Radix lithospermi wet dressing. The control group and model group were administered 5% sodium carboxymethyl cellulose by gavage and treated with iodophor gauze externally. All interventions were given for 15 consecutive days. The wound healing rate of rats in each group was measured. Enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） was used to detect the serum levels of interferon-γ （IFN-γ）， interleukin （IL）-1β， tumor necrosis factor-α （TNF-α）， IL-4， IL-10， and IL-13. Hematoxylin-eosin （HE） staining and Masson staining were performed to observe histopathological changes and collagen deposition in wound tissues. Flow cytometry was used to detect the proportion of M1/M2 macrophages in wound tissues. Immunohistochemistry and Western blotting were used to detect the expression levels of B-lymphocyte activating antigen B7-2 （CD86）， inducible nitric oxide synthase （iNOS）， Toll like receptor 4 （TLR-4）， macrophage mannose receptor （CD206）， resistin like α （Retnlα）， chitinase 3-like 1 （Chil3）， NF-κB p65， p-NF-κB p65， JNK， p-JNK， PI3K， and p-PI3K in wound tissues. Results Compared with the control group， the wound healing rate in the model group was significantly decreased， accompanied by severe inflammatory infiltration， and less collagen and neovascularization in wound tissues. The serum levels of IFN-γ， IL-1β and TNF-α were significantly increased， while the serum levels of IL-4， IL-10 and IL-13 were significantly decreased. The proportion of M1 macrophages was significantly increased， and the expression levels of CD86， iNOS， TLR-4， p-NF-κB p65/NF-κB p65 and p-JNK/JNK were significantly increased. The proportion of M2 macrophages was significantly decreased， and the expression levels of CD206， Retnlα， Chil3 and p-PI3K/PI3K were significantly decreased （P<0.05）. Compared with the model group， the wound healing rate in the epalrestat group， Coptis chinensis-Radix lithospermi wet dressing group and epalrestat combined with Coptis chinensis-Radix lithospermi wet dressing group were significantly increased， accompanied by alleviated inflammatory infiltration， increased collagen deposition and angiogenesis. The serum levels of IFN-γ， IL-1β and TNF-α were significantly decreased， while the serum levels of IL-4， IL-10 and IL-13 were significantly increased. The proportion of M1 macrophages and the expression levels of CD86， iNOS， TLR-4， p-NF-κB p65/NF-κB p65 and p-JNK/JNK were significantly decreased. The proportion of M2 macrophages and the expression levels of CD206， Retnlα， Chil3 and p-PI3K/PI3K were significantly increased. Furthermore， the therapeutic effect in the epalrestat combined with Coptis chinensis-Radix lithospermi wet dressing group was superior to that in the epalrestat group and Coptis chinensis-Radix lithospermi wet dressing group （P<0.05）. Conclusion Epalrestat combined with Coptis chinensis-Radix lithospermi wet dressing can alleviate local inflammatory response and promote wound healing in DU rats by regulating the NF-κB/JNK/PI3K pathway and macrophage polarization.

Graphical abstract

关键词

糖尿病溃疡 / 依帕司他 / 黄连紫草湿性敷料 / 核因子-κB/c-Jun氨基末端激酶/磷脂酰肌醇3-激酶通路 / 巨噬细胞极化

Key words

diabetic ulcer / epalrestat / Coptis chinensis-Radix lithospermi wet dressing / nuclear transcription factor-κB/c-Jun N-terminal kinase/phosphatidylinositol 3-kinase pathway / macrophage polarization

糖尿病溃疡（diabetic ulcer，DU）是糖尿病严重的慢性并发症之一，主要因长期高血糖状态导致神经与血管功能受损，进而引发皮肤溃疡性病变^［1］。该溃疡多发于足部，即糖尿病足溃疡（diabetic foot ulcer，DFU），临床表现以局部组织破损、坏死为主，严重时可导致截肢，甚至危及患者生命^［2］，其创面愈合困难是目前临床诊疗中亟待解决的重点与难点问题。

现有研究表明，高血糖、感染、持续炎症反应及血管、神经病变是导致DU创面难以愈合的主要因素^［3］。核因子-κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）作为细胞内广泛存在的转录因子，参与炎症反应、细胞增殖及凋亡等多种生理病理过程，其异常激活可诱导白细胞介素（interleukin，IL）-1、IL-6、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等多种促炎因子过量表达，引发慢性炎症反应并降低细胞增殖能力，最终延缓创面愈合^［4］。

c-Jun氨基末端激酶/磷脂酰肌醇3-激酶（c-Jun N-terminal kinase/phosphatidylinositol 3-kinase，JNK/PI3K）通路是应激激活的重要信号通路，在DU创面愈合过程中发挥关键调控作用：JNK的异常激活可诱导细胞凋亡，且与NF-κB通路存在相互作用，共同抑制炎症消退^［5］；而PI3K作为重要的信号转导分子，其激活可促进细胞存活、增殖及新生血管形成，同时抑制过度炎症反应，为创面愈合提供有利条件^［6］。上述研究结果表明，NF-κB/JNK/PI3K通路间存在复杂的交叉调控关系，共同参与DU创面愈合的调控过程。

此外，巨噬细胞极化在DU创面愈合中也扮演着重要角色。创面愈合早期，M1型（促炎性）巨噬细胞通过分泌促炎因子（IL-1、IL-6、TNF-α）及趋化因子，招募免疫细胞聚集于创面，清除病原体和受损组织；随着炎症进程推进，巨噬细胞需向M2型（抗炎/修复型）极化，通过分泌抗炎因子（如IL-13）及生长因子［转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等］，刺激细胞增殖、分化和迁移，促进新生血管生成、胶原沉积，加速创面愈合^［7］。但长期高血糖状态可诱导M1型巨噬细胞过度激活，同时阻碍其向M2型极化，导致炎症反应持续存在，进而延缓DU创面愈合^［8］。因此，调控巨噬细胞正常极化和功能，将成为治疗DU创面愈合的有效干预手段。

依帕司他作为一种醛糖还原酶抑制剂，主要用于糖尿病神经性病变的治疗^［9］，近年来研究发现其对糖尿病神经病变相关性下肢溃疡^［10］及糖尿病足^［11］亦具有良好的临床疗效。黄连紫草湿性敷料源于紫草油方化裁，具有活血祛瘀、清热除湿、解毒生肌的功效，已有研究证实，该敷料可通过改善DFU患者足背动脉血流灌注、减轻局部炎症反应，促进创面愈合^［12-13］。

然而，目前关于依帕司他及黄连紫草湿性敷料对DU大鼠NF-κB/JNK/PI3K通路的调控作用及巨噬细胞极化的影响尚未明确，二者联合应用是否能对DU创面愈合产生协同增益作用也缺乏实验依据。基于此，本研究探究依帕司他联合黄连紫草湿性敷料对DU大鼠NF-κB/JNK/PI3K通路及巨噬细胞极化的影响，为中西医结合治疗DU提供可靠的理论与实验支撑。

1 仪器与材料

1.1 仪器

ACCU-CHEK型血糖仪（瑞士Roche公司）；Multiskan FC型酶标仪（美国Thermo公司）；EM UC7型超薄切片机（德国Leica公司）；BMJ-Ⅲ型包埋机（常州市中威电子仪器有限公司）；BA410型显微镜（麦克奥迪实业集团有限公司）；CytoFLEX型流式细胞仪（美国Beckman公司）；1658001型蛋白电泳仪（美国Bio-Rad公司）。

1.2 试药

依帕司他片（批号H20040012，规格为50 mg·片^-1，南京海陵药业有限公司）。黄连紫草湿性敷料：将紫草、生黄芪（各20 g），乳香、党参（各15 g），黄连、当归、黄柏、没药、赤芍、金果榄、甘草（各10 g）等中药，置于1 000 mL香油中浸泡24 h，煎制，冷却，涂布在纱条上制成黄连紫草湿性敷料。链脲佐菌素（streptozotocin，STZ，上海泽叶生物科技有限公司）；苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色试剂盒（批号ST2022）、Masson染色试剂盒（批号R21866），均购自上海尚宝生物科技有限公司；干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ）、IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-10酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（批号：ml064291、ml037361、ml002859、ml107056、ml037371），均购自上海酶联生物科技有限公司；IL-13 ELISA试剂盒（批号CB10199-Ra，上海科艾博生物技术有限公司）；B淋巴细胞抗原B7-2（B-lymphocyte activating antigen B7-2，CD86）、诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、Toll样受体4（toll like receptor 4，TLR-4）、兔单抗巨噬细胞甘露糖受体（macrophage mannose receptor，CD206）、抵抗素样α（resistin like α，Retnlα）（批号：bs-1035R、bs-0162R、bs-1021R、bsm-55604R、bs-1884R），均购自北京博奥森生物技术有限公司；几丁质酶样3（chitinase 3-like 1，Chil3）（批号MA5-23981，美国Thermo公司）；NF-κB p65、p-NF-κB p65、JNK、p-JNK（批号：YT827、YT828、YT815、YT814），均购自北京百奥莱博生物科技有限公司。

1.3 实验动物

无特定病原体级雄性Sprague Dawley（SD）大鼠，75只，8周龄，体质量为220~240 g，购自郑州大学河南省实验动物中心。大鼠饲养于室温23~26 ℃、湿度50%~60%、12 h循环照明环境中，并可自由摄食、饮水。大鼠适应性饲养1周后进行实验。

2 方法

2.1 模型建立、分组与给药

将75只大鼠随机分为对照组、模型组、依帕司他组、黄连紫草湿性敷料组、依帕司他联合黄连紫草湿性敷料组，每组15只。采用高糖高脂饮食联合腹腔注射STZ构建大鼠糖尿病模型。除对照组外，其余各组大鼠给予高糖高脂饮食喂养30 d，随后一次性腹腔注射小剂量STZ（40 mg·kg^-1）；对照组大鼠给予普通饲料喂养，并腹腔注射等体积柠檬酸缓冲液。注射3 d后，大鼠空腹血糖>16.7 mmol·L^-1判定为糖尿病模型构建成功。

造模成功后，腹腔注射质量分数2%戊巴比妥钠（40 mg·kg^-1）麻醉大鼠，背部备皮、消毒，以剪刀剪切皮肤至筋膜层，制成直径为10 mm的圆形皮肤缺损创面；创面出现明显渗液及出血，即判定为DU模型构建成功^［14］。造模后大鼠继续给予高糖高脂饮食喂养至实验结束。

依帕司他组、依帕司他联合黄连紫草湿性敷料组大鼠给予依帕司他（100 mg·kg^-1）灌胃，连续15 d；对照组、模型组给予质量分数5%羧甲基纤维素钠溶液灌胃^［15］。同时，黄连紫草湿性敷料组、依帕司他联合黄连紫草湿性敷料组大鼠创面予以黄连紫草湿性敷料覆盖，对照组、模型组、依帕司他组创面予以碘伏浸润纱布覆盖。每日干预1次，连续干预15 d。治疗结束后观察大鼠的创面愈合情况；采集腹主动脉血标本备用；颈椎脱臼处死大鼠，收集创面肉芽组织备用。

2.2 创面愈合率测定

分别于治疗第5、10、15天观察创面愈合情况，并计算创面愈合率。创面愈合率=［（原始创面面积-未愈合创面面积）/原始创面面积］×100%。

2.3 血清IFN-γ、IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-10、IL-13水平的检测

采集大鼠腹主动脉血，以3 000 r·min^-1离心10 min，分离血清待测。于酶标板中依次加入50 μL稀释标准品和待测样本，立即加入50 μL生物素标记抗体，轻轻振荡混匀，37 ℃孵育1 h；弃去孔内液体，加满洗涤液洗涤，重复3次。每孔加入80 μL辣根过氧化物酶标记链霉亲和素，轻轻振荡混匀，37 ℃孵育30 min，弃去孔内液体，加满洗涤液洗涤，重复3次。每孔依次加入50 μL底物A、B，轻轻振荡混匀，37 ℃避光孵育10 min。迅速加入50 μL终止液，于450 nm波长处测定各孔的吸光度值，绘制标准曲线并计算血清IFN-γ、IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-10、IL-13水平。

2.4 创面组织病理学的观察

2.4.1 HE染色

收集大鼠创面肉芽组织，修剪为组织块，体积分数4%多聚甲醛固定过夜，流水冲洗后经梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋。使用超薄切片机制备4 μm厚石蜡切片，脱蜡至水，依次进行二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水、流水冲洗，苏木精染液染色、流水冲洗、蓝化液返蓝、流水冲洗，伊红染液染色，流水冲洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，置于光学显微镜下观察。

2.4.2 Masson染色

取上述石蜡切片脱蜡至水，置于Bouin固定液中37 ℃孵育2 h，流水冲洗；依次经天青石蓝染液染色、流水冲洗，苏木精染液染色、流水冲洗，酸性乙醇分化、流水冲洗，丽春红品红染液染色、流水冲洗，磷钼酸处理、苯胺蓝染液染色，弱酸溶液处理，脱水透明后封片，置于光学显微镜下观察。

2.5 免疫组织化学染色检测创面组织p-NF-κB p65、p-JNK、p-PI3K的表达

取上述石蜡切片脱蜡至水，体积分数3%过氧化氢室温避光孵育10 min以封闭内源性过氧化物酶，流水冲洗；枸橼酸钠缓冲液高压煮沸3 min，冷却后磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）洗涤2次；体积分数3%胎牛血清37 ℃封闭15 min，加入p-NF-κB p65、p-JNK、p-PI3K一抗稀释液（1∶200）37 ℃孵育2 h，PBS洗涤2次；加入生物素标记二抗稀释液（1∶500）37 ℃孵育1 h，PBS洗涤2次；二氨基联苯胺显色，自来水终止反应，苏木精复染，流水冲洗，脱水透明后封片，置于光学显微镜下观察并测定平均光密度（mean optical density，MOD）值。

2.6 流式细胞术检测创面组织M1、M2型巨噬细胞的比例

收集大鼠创面肉芽组织并剪碎，体积分数0.25%胰蛋白酶37 ℃消化30 min，加入含体积分数5%胎牛血清的Dulbecco’s改良培养基（Dulbecco’s modification of Eagle’s medium，DMEM）终止消化；经70 μm细胞滤网过滤，收集细胞悬液，以1 500 r·min^-1离心5 min，收集细胞沉淀。以流式染色缓冲液重悬细胞，加入藻红蛋白-花青素标记的整合素αM（integrin αM-phycoerythrin-cyanine7，CD11b-PE-Cy7）、荧光素异硫氰酸酯标记的CD86（CD86-fluorescein isothiocyanate，CD86-FITC）抗体或CD11b-PE-Cy7、CD206-PE抗体，混匀后避光孵育30 min。流式染色缓冲液洗涤并重悬细胞，转移至流式管，采用流式细胞仪检测M1、M2型巨噬细胞的数量。

2.7 蛋白印迹法（Western blotting）检测创面组织相关蛋白的表达

收集大鼠创面肉芽组织，剪碎后加入细胞裂解液提取蛋白，以10 000 r·min^-1离心10 min，取上清液，采用二喹啉甲酸法测定蛋白浓度。蛋白样品与上样缓冲液混匀，沸水浴变性。制备十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶，上样后先以90 V电压电泳至分离胶界面，再以120 V电泳至凝胶底部。转印采用滤纸-凝胶-转印膜-滤纸夹层结构，100 V恒压电泳1 h。转印膜经体积分数5%脱脂牛奶封闭2 h，加入CD86、iNOS、TLR-4、CD206、Retnlα、Chil3、NF-κB p65、p-NF-κB p65、JNK、p-JNK、PI3K、p-PI3K一抗稀释液（1∶1 000）4 ℃孵育过夜；洗涤后加入二抗稀释液（1∶5 000）室温孵育2 h，洗涤后加入增强型化学发光试剂显色，凝胶成像系统采集图像；以β-肌动蛋白（β-actin）为内参，计算各蛋白相对表达水平。

2.8 统计学方法

采用SPSS 27.0统计学软件对数据进行处理。计量资料以（\overline{x}±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组大鼠创面愈合情况的比较

随着时间的推移，各组大鼠创面均呈逐渐愈合的趋势；治疗15 d后，对照组大鼠的创面基本完全愈合。与对照组比较，模型组大鼠的创面愈合率显著降低（P<0.05）；与模型组比较，依帕司他组、黄连紫草湿性敷料组、依帕司他联合黄连紫草湿性敷料组大鼠的创面愈合率均显著升高（P<0.05）；且依帕司他联合黄连紫草湿性敷料组大鼠的创面愈合率显著高于依帕司他组、黄连紫草湿性敷料组（P<0.05）。见图1、表1。

3.2 各组大鼠创面组织病理学的比较

随时间推移，各组大鼠创面组织逐渐修复并愈合；治疗15 d后，对照组创面修复最为完整，表现为瘢痕组织形成、新生血管丰富及炎症反应显著消退。与对照组比较，模型组大鼠治疗5 d后创面可见明显炎性细胞浸润；治疗10、15 d后创面仍可见少量炎性浸润。与模型组比较，依帕司他组、黄连紫草湿性敷料组、依帕司他联合黄连紫草湿性敷料组治疗5 d后创面炎性浸润程度均减轻；治疗10、15 d后可见大量胶原纤维和新生血管形成；且依帕司他联合黄连紫草湿性敷料组的改善效果更为显著。见图2。

随着时间的推移，各组大鼠创面胶原沉积逐渐增多；治疗15 d后，对照组创面胶原排列更为致密。与对照组比较，模型组治疗5 d后创面仅见少量胶原沉积；治疗10、15 d后胶原沉积有所增加但仍不明显。与模型组比较，依帕司他组、黄连紫草湿性敷料组、依帕司他联合黄连紫草湿性敷料组大鼠治疗5 d后的创面胶原沉积均显著增多；治疗10、15 d后可见大量胶原沉积；且依帕司他联合黄连紫草湿性敷料组的效果更为显著。见图3。

3.3 各组大鼠NF-κB/JNK/PI3K通路表达水平的比较

与对照组比较，模型组大鼠的创面组织p-NF-κB、p-JNK的MOD值均显著升高，p-PI3K的MOD值显著降低（P<0.05）；与模型组比较，依帕司他组、黄连紫草湿性敷料组、依帕司他联合黄连紫草湿性敷料组的p-NF-κB、p-JNK的MOD值均显著降低，p-PI3K的MOD值显著升高（P<0.05）；且依帕司他联合黄连紫草湿性敷料组的p-NF-κB、p-JNK的MOD值均显著低于依帕司他组、黄连紫草湿性敷料组，p-PI3K的MOD值显著高于依帕司他组、黄连紫草湿性敷料组（P<0.05）。见图4、表2。

与对照组比较，模型组大鼠的创面组织p-NF-κB/NF-κB、p-JNK/JNK蛋白比值均显著升高，p-PI3K/PI3K蛋白比值显著降低（P<0.05）；与模型组比较，依帕司他组、黄连紫草湿性敷料组、依帕司他联合黄连紫草湿性敷料组的p-NF-κB/NF-κB、p-JNK/JNK蛋白比值均显著降低，p-PI3K/PI3K蛋白比值显著升高（P<0.05）；且依帕司他联合黄连紫草湿性敷料组p-NF-κB/NF-κB、p-JNK/JNK蛋白比值均显著低于依帕司他组、黄连紫草湿性敷料组，p-PI3K/PI3K蛋白比值均显著高于依帕司他组、黄连紫草湿性敷料组（P<0.05）。见图5、表2。

3.4 各组大鼠巨噬细胞极化水平的比较

与对照组比较，模型组大鼠血清中M1型巨噬细胞相关促炎因子IFN-γ、IL-1β、TNF-α水平均显著升高，M2型巨噬细胞相关抗炎因子IL-4、IL-10、IL-13水平均显著降低（P<0.05）；与模型组比较，依帕司他组、黄连紫草湿性敷料组、依帕司他联合黄连紫草湿性敷料组的血清IFN-γ、IL-1β、TNF-α水平均显著降低，IL-4、IL-10、IL-13水平均显著升高（P<0.05）；且依帕司他联合黄连紫草湿性敷料组的血清IFN-γ、IL-1β、TNF-α水平均显著低于依帕司他组、黄连紫草湿性敷料组，IL-4、IL-10、IL-13水平均显著高于依帕司他组、黄连紫草湿性敷料组（P<0.05）。见表3。

与对照组比较，模型组大鼠的创面组织M1型巨噬细胞比例显著升高，M2型巨噬细胞比例显著降低（P<0.05）；与模型组比较，依帕司他组、黄连紫草湿性敷料组、依帕司他联合黄连紫草湿性敷料组的创面组织M1型巨噬细胞比例均显著降低，M2型巨噬细胞比例均显著升高（P<0.05）；且依帕司他联合黄连紫草湿性敷料组的M1型巨噬细胞比例均显著低于依帕司他组、黄连紫草湿性敷料组，M2型巨噬细胞比例均显著高于依帕司他组、黄连紫草湿性敷料组（P<0.05）。见图6、表4。

与对照组比较，模型组大鼠的创面组织M1型标志物CD86、iNOS、TLR-4蛋白表达均显著升高，M2型标志物CD206、Retnlα、Chil3蛋白表达均显著降低（P<0.05）；与模型组比较，依帕司他组、黄连紫草湿性敷料组、依帕司他联合黄连紫草湿性敷料组的CD86、iNOS、TLR-4蛋白表达均显著降低，CD206、Retnlα、Chil3蛋白表达均显著升高（P<0.05）；且依帕司他联合黄连紫草湿性敷料组的CD86、iNOS、TLR-4蛋白表达均显著低于依帕司他组、黄连紫草湿性敷料组，CD206、Retnlα、Chil3蛋白表达显著高于依帕司他组、黄连紫草湿性敷料组（P<0.05）。见图7和表5。

4 讨论

高血糖环境可加剧溃疡局部炎症反应，抑制血管形成和胶原合成，对创面愈合产生显著不利影响^［16］。研究表明，依帕司他对DFU具有明确的治疗效果，可有效改善血管弹性和机体炎症状态^［17-18］。此外，黄连紫草湿性敷料也被证实可减轻DFU患者的全身炎症反应，加速溃疡创面愈合^［13］。然而，依帕司他联合黄连紫草湿性敷料促进DU创面愈合的具体分子机制尚未完全阐明。

本研究通过切除糖尿病大鼠背部全层皮肤构建DU模型，并给予依帕司他联合黄连紫草湿性敷料治疗。结果显示，随着干预时间的延长，各组大鼠创面均呈现不同程度愈合。其中，模型组创面炎性浸润明显，新生血管和胶原生成较少，创面愈合程度显著低于各治疗组；而各治疗组炎性浸润减轻，血管新生和胶原生成增多，以依帕司他联合黄连紫草湿性敷料组效果最为显著，表明依帕司他联合黄连紫草湿性敷料能够促进DU大鼠的创面愈合。

在DU病理进程中，NF-κB通路激活可通过介导促炎因子释放，加重溃疡局部炎症反应和组织损伤^［19］。JNK通路作为调控细胞凋亡、炎症反应和纤维化过程的重要通路，其过度激活可促进细胞凋亡、炎症因子分泌和组织纤维化，进而延缓溃疡愈合^［20］。PI3K在细胞增殖、存活和代谢调控中发挥关键作用，PI3K通路激活可促进细胞增殖、迁移和血管新生，对创面修复和愈合至关重要^［21］。

NF-κB、JNK与PI3K通路间存在复杂交互调控。NF-κB通路激活可通过上调JNK上游信号分子进而激活JNK通路；NF-κB与JNK通路共同激活可诱导凋亡相关基因表达，加速细胞凋亡。PI3K通路激活可通过抑制核因子κB抑制蛋白激酶（inhibitor of nuclear transcription factor κB kinase，IKK）活性，阻止核因子κB抑制蛋白（inhibitor of nuclear transcription factor κB，IkB）蛋白磷酸化和降解，进而抑制NF-κB二聚体释放和核转移；PI3K通路激活与NF-κB通路抑制可减少炎症因子生成和细胞凋亡，减轻炎症损伤。反之，JNK通路激活可抑制PI3K通路活性，JNK通路激活与PI3K通路抑制共同抑制细胞生长与存活^［22］。已有研究证实，NF-κB/JNK/PI3K通路在金黄色葡萄球菌感染相关DFU中发挥重要调节作用^［23］；靶向调控该通路活性可减轻炎症反应、促进血管形成，进而改善感染性DFU创面的愈合情况^［24］。本研究结果显示，模型组大鼠创面组织p-NF-κB/NF-κB、p-JNK/JNK蛋白表达显著升高，p-PI3K/PI3K蛋白表达显著降低，表明DU大鼠存在NF-κB/JNK通路过度激活与PI3K通路受到抑制。各治疗组的p-NF-κB/NF-κB、p-JNK/JNK蛋白表达均显著降低，p-PI3K/PI3K蛋白表达显著升高，其中依帕司他联合黄连紫草湿性敷料组的效果最为显著，表明依帕司他联合黄连紫草湿性敷料可通过调控NF-κB/JNK/PI3K通路促进DU创面愈合。其机制可能为：依帕司他作为醛糖还原酶抑制剂，可通过抑制多元醇代谢通路中的醛糖还原酶活性，减少细胞内山梨醇蓄积，从而减轻NF-κB/JNK通路激活并增强PI3K通路活性，减少细胞凋亡、促进组织修复；同时，黄连紫草湿性敷料中紫草、生黄芪、黄柏等中药成分具有抗炎、调节免疫及促进愈合作用，能够抑制NF-κB和JNK信号转导；二者联合使用可发挥协同增效效应。

在DU微环境中，高血糖和氧化应激等因素可导致巨噬细胞表型失衡，表现为M1型巨噬细胞过度极化及M1向M2型转化受阻，进而导致M2型巨噬细胞数量减少、分泌的生长因子水平降低，进一步加剧M1型极化和慢性炎症的恶性循环，使创面愈合停滞于炎症阶段，延缓修复进程^［25］。研究证实，降低M1型巨噬细胞比例及促炎因子水平，提高M2型巨噬细胞比例及抗炎因子水平，可显著促进DU大鼠溃疡愈合^［26-27］。本研究结果显示，模型组大鼠血清促炎因子IFN-γ、IL-1β、TNF-α水平升高，抗炎因子IL-4、IL-10、IL-13水平降低，创面组织M1型巨噬细胞比例上升，而M2型下降，表明DU大鼠存在明显巨噬细胞极化失衡。各治疗组大鼠M1型巨噬细胞比例及促炎因子表达水平下降，而M2型巨噬细胞比例及抗炎因子表达水平升高，尤其是依帕司他联合黄连紫草湿性敷料组治疗效果最为显著，表明依帕司他联合黄连紫草湿性敷料能够有效调控巨噬细胞极化平衡。其机制可能与二者通过抗炎作用调节巨噬细胞极化方向、减少M1型巨噬细胞浸润、促进M2型巨噬细胞转化有关，进而加速溃疡创面愈合。见图8。

综上所述，依帕司他联合黄连紫草湿性敷料可通过调控NF-κB/JNK/PI3K信号通路及巨噬细胞极化平衡，促进DU大鼠创面愈合，为中西医结合治疗DU提供了实验依据。但本研究也存在一定局限性，相关机制有待进一步深入验证。后续研究将增设通路激动剂或抑制剂干预组，深入阐明其分子机制，并加强临床安全性和有效性评价，为该联合方案的临床转化与应用提供更充分的支撑。

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基金资助

河南省医学科技攻关计划联合共建立项项目(LHGJ20200840)