黄芪甲苷通过调控谷胱甘肽过氧化物酶4介导的铁死亡通路对慢性心力衰竭大鼠心脏功能的保护作用

Protective effect of astragaloside Ⅳ on cardiac function in rats with chronic heart failure through regulating the ferroptosis mediated by glutathione peroxidase 4

摘要

目的 基于慢性心力衰竭大鼠模型，探讨黄芪甲苷通过调控谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4， GPX4）介导的铁死亡通路对心脏功能的保护作用及机制。 方法 采用结扎大鼠冠状动脉左前降支建立慢性心力衰竭模型，术后24 h，黄芪甲苷组给予黄芪甲苷灌胃，假手术组与模型组给予等体积生理盐水灌胃，连续干预4周。通过超声心动图评估大鼠的心功能；酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA）检测血清N末端B型利钠肽前体（N-terminal pro-B-type natriuretic peptide， NT-proBNP）水平；生化试剂盒检测心肌组织丙二醛（malondialdehyde， MDA）、谷胱甘肽（glutathione， GSH）及铁离子（Fe²⁺）含量；苏木素伊红（hematoxylin and eosin， H&E）染色观察心肌组织形态；蛋白印迹法（Western blotting）检测心肌组织铁死亡关键蛋白GPX4的表达水平。 结果 与模型组比较，黄芪甲苷组血清NT-proBNP水平、MDA和Fe²⁺含量均显著降低，GSH水平显著升高，心肌组织病理损伤与氧化应激显著减轻（P<0.05）。黄芪甲苷治疗增加了GPX4表达，从而缓解了慢性心力衰竭心肌细胞铁死亡。 结论 黄芪甲苷使冠状动脉结扎致心力衰竭模型大鼠的心功能明显好转，减少心肌细胞因铁过载受到的氧化应激损伤，上调GPX4的表达水平从而抑制铁死亡可能是其作用机制之一。

Abstract

Objective To investigate the role of astragaloside Ⅳ in glutathione peroxidase 4 （GPX4）-mediated myocardial cell ferroptosis based on a rat model of chronic heart failure （CHF）. Methods A rat model of CHF was established by ligating the left anterior descending coronary artery， 24 hours after surgery， the administration group was given astragaloside Ⅳ by gastric tube injection， while the sham operation group and model group were given an equal volume of normal saline， and the intervention lasted for 4 weeks. The changes in cardiac function were measured by echocardiography， the level of N-terminal pro-B-type natriuretic peptide （NT-proBNP） in serum was determined by enzyme-linked immunosorbent assay， the contents of malondialdehyde （MDA）， glutathione （GSH）， and iron ions （Fe²⁺） in myocardial tissue were determined by biochemical kits， and the morphology of myocardial tissue was observed by hematoxylin and eosin （H&E） staining. The level of GPX4 protein expression in myocardial tissue was determined by Western blotting method. Results Astragaloside Ⅳ significantly reduced the expression level of serum NT-proBNP and as well as MDA and Fe²⁺ contents in myocardial tissue， while increased the GSH level， thereby alleviating the cardiac injury and oxidative stress in chronic heart failure （P<0.05）. Additionally， astragaloside Ⅳ treatment increased GPX4 expression， thus relieved iron-induced cell death in CHF myocardial cells. Conclusion Astragaloside Ⅳ significantly improves the cardiac function of rats with CHF induced by coronary ligation， reduces the oxidative stress injury of cardiomyocytes caused by iron overload， and reduces the expression level of GPX4 to inhibit ferroptosis may be one of its mechanisms of action.

Graphical abstract

关键词

黄芪甲苷 / 慢性心力衰竭 / 铁死亡 / 谷胱甘肽过氧化物酶4 / N末端B型利钠肽前体

Key words

astragaloside Ⅳ / chronic heart failure / ferroptosis / glutathione peroxidase 4 / N-terminal pro-B-type natriuretic peptide

慢性心力衰竭（chronic heart failure， CHF）作为各类心血管疾病的最终表现，其高再入院率和死亡率一直是全球医疗领域面临的挑战^［1］。据报道，83%的CHF患者每年至少住院1次，其中43%的患者每年至少住院4次^［2］，严重影响患者的寿命和生活质量，构成重大公共卫生问题。细胞死亡是心血管疾病重要的病理生理过程^［3］，铁死亡是一种相对较新的细胞死亡类型^［4］，其特征为铁过载引起大量活性氧（reactive oxygen species， ROS）和脂质过氧化产物生成，与心肌细胞过度死亡及心功能恶化密切相关^［5］。由胱氨酸/谷氨酸转运系统介导的System Xc-/谷胱甘肽（glutathione， GSH）/谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4， GPX4）途径是抵抗细胞铁死亡的关键抗氧化系统之一^［6］，GSH作为该途径的辅助因子^［7］，GPX4可有效清除过度积累的脂质过氧化物，减少氧化应激反应，保护细胞免受脂质过氧化物的损伤，从而抑制铁死亡进程^［8］。因此，GPX4的调控被认为是干预铁死亡的重要途径。

近年来，传统中药因多靶点、多途径、不良反应小的独特优势，在心血管疾病调控铁死亡的研究中展现出广阔的应用前景^［9-11］。多项研究表明，多种中药及其活性成分具有调控铁死亡的作用^［11-13］。例如，丹参中的丹参酮ⅡA可通过抑制GPX4活性、促进铁死亡，在心肌缺血再灌注损伤中发挥保护作用^［14］。黄芪甲苷作为传统中药黄芪的活性成分之一，具有广泛药理作用，不仅能增强机体的免疫功能，还兼具强心、降压、降血糖、利尿、抗衰老和抗疲劳等多种功效。近年来研究发现，黄芪甲苷在降低ROS释放、保护心肌细胞免受氧化应激损伤方面效果显著^［15］。李泽华等^［16］研究发现，黄芪甲苷可通过核因子E2-相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2， NRF2/HO-1）信号通路减轻心肌细胞氧化应激反应，缓解小鼠心肌缺血再灌注损伤。此外，它还能阻止钙超载，减少心肌细胞凋亡，对抗心肌肥厚与心肌纤维化进程^［17］。这一系列积极作用提示，黄芪甲苷对心肌具有重要保护作用。

然而，目前尚无研究评估黄芪甲苷对CHF大鼠的保护作用，其潜在机制仍不明确。基于此，本研究通过构建CHF大鼠模型，首次揭示黄芪甲苷在体内GPX4介导的心肌细胞铁死亡中的作用，为黄芪甲苷在CHF治疗中的应用提供新的理论依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

DY15K型电子天平、FA2004N型精密电子天平，均购自上海菁海仪器有限公司；SF-TDL-5C型台式低速离心机（上海菲恰尔分析仪器有限公司）；Research plus型手动单道移液器（德国Eppendorf公司）；DK-80型恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）；BCD-249LCK型-20 ℃低温冰箱、DW-HL388型-80 ℃低温冰箱，均购自合肥美菱股份有限公司；xMark^TM型酶标仪（美国Bio-Rad公司）；Chemiscope 3000型化学发光成像仪系统（上海勤翔科学仪器有限公司）；GL-88型漩涡混合器（海门其林贝尔仪器制造有限公司）；Neofuge型台式离心机（上海力申科学仪器有限公司）；D6 Vet型彩色多普勒超声检测仪（深圳市理邦精密仪器有限公司）。

1.2 试药

黄芪甲苷（批号A274907-5g，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；大鼠N末端B型利钠肽前体（N-terminal pro-B-type natriuretic peptide， NT-proBNP）酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（批号CSB-E08752r，武汉华美生物工程有限公司）；丙二醛（malondialdehyde， MDA）检测试剂盒（批号A003-1-2）、GSH检测试剂盒（批号A006-2-1），均购自南京建成生物工程研究所有限公司；Fe²⁺检测试剂盒（批号BC5415，北京索莱宝科技有限公司）；苏木素染液（批号CTS-1097，福州迈新生物技术开发有限公司）；伊红染液（批号ZLI-9613）、中性树胶（批号ZLI-9555），均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；放射免疫沉淀试验细胞裂解液（radio-immunoprecipitation assay lysis buffer， RIPA，批号AR0105）、苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride， PMSF，批号AR1192），均购自武汉博士德生物工程有限公司；β-Actin抗体（批号100166-MM10，北京义翘神州科技股份有限公司）；GPX4抗体（批号DF6701，美国Affinity公司）；辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase， HRP）标记山羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G， IgG） H&L（批号ab205718，美国Abcam公司）；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid， BCA）蛋白定量试剂盒（批号DQ111-01，北京全式金生物技术股份有限公司）。

1.3 实验动物

无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级雄性SD大鼠30只，体质量为200~220 g，由杭州医学院实验动物中心提供。大鼠饲养环境：温度为20~23 ℃，相对湿度为40%~60%，光照周期12 h·d^-1，自由摄食、饮水。

2 方法

2.1 CHF大鼠模型的建立、分组及给药

CHF大鼠模型参照文献^［18］方法，采用无菌结扎冠状动脉法诱导建立。30只SD大鼠适应性喂养1周后，吸入乙醚麻醉，并使用呼吸机辅助呼吸。于左心耳下距主动脉根部约1.5 mm处穿线结扎左冠状动脉前降支；假手术组大鼠仅穿线，不结扎左冠状动脉前降支。结扎后，假手术组大鼠心电图基本正常，无QRS波群增高、增宽及ST段抬高现象；与假手术组比较，模型组大鼠手术后出现QRS波群增高、增宽、ST段抬高，表明冠状动脉结扎造模成功。见图1。

术后24 h，除假手术组外，其余大鼠采用随机数字表法分为2组，即模型组和黄芪甲苷组。实验开始后，黄芪甲苷组大鼠灌胃40 mg·kg^-1黄芪甲苷，每日1次^［19-20］，假手术组和模型组大鼠灌胃等体积蒸馏水，连续干预4周。末次灌胃30 min后，取各组大鼠左心室心肌组织，液氮速冻后备用。

2.2 大鼠心脏超声检测

大鼠药物干预4周后，通过彩色多普勒超声检测仪检测并分析左心室舒张末期直径（left ventricular end-diastolic diameter， LVEDD）、左心室收缩末期直径（left ventricular end-systolic diameter， LVESD），计算左心室射血分数（ejection fraction， EF）及左心室缩短分数（fractional shortening， FS），每组大鼠检测3次，取平均值。

2.3 ELISA法检测血清中NT-proBNP的含量

大鼠腹腔麻醉后，腹主动脉取血，置于真空采血管中，静置后于4 ℃条件下以3 000 r·min^-1离心20 min，吸取上层血清备用，严格按照ELISA试剂盒说明书操作，检测血清中NT-proBNP的含量。

2.4 大鼠心肌组织Fe²⁺含量、GSH和MDA水平的检测

收集大鼠左心室组织，加入相应提取试剂，进行冰浴匀浆，以12 000 r·min^-1离心15 min后，收集上清。按照试剂盒说明书检测大鼠心肌组织的Fe²⁺含量、GSH和MDA水平。

2.5 心肌组织苏木素伊红（hematoxylin and eosin， H&E）染色观察

取左心室心肌组织，置于体积分数为4%的多聚甲醛溶液中固定48 h，随后依次进行组织脱水、石蜡浸润、包埋，再行切片、贴片、脱蜡复水处理。采用H&E染色试剂盒染色后脱水，在光学显微镜下观察心肌组织的形态学变化，并采集图像。

2.6 Western blotting检测心肌组织中GPX4蛋白的表达

大鼠处死后，迅速取出心脏，置于冰浴玻璃板上解剖，取100 mg缺血心肌组织，加入400 μL RIPA细胞裂解液（RIPA∶PMSF∶广谱磷酸酶抑制剂=100∶1∶1，现配现用），充分混匀于4 ℃放置60 min，以12 000 r·min^-1离心15 min，提取总蛋白。采用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid， BCA）法测定蛋白表达情况，取50 μg蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis， SDS-PAGE）分离后，转移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride membrane， PVDF）膜上。用GPX4抗体（1∶500稀释）孵育膜，随后加入相应HRP偶联二抗孵育。采用增强型化学发光（enhanced chemiluminescence， ECL）检测试剂显影，Image J软件分析条带灰度值，以β-actin蛋白为内参，对GPX4蛋白表达水平进行归一化处理。

2.7 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件分析数据。符合正态分布的计量资料用（\overline{x}\pm s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验（方差齐）或Dunnett’s-T3检验（方差不齐）。不符合正态分布的计量资料用M（P25~P75）表示，多组间比较采用Kruskal-Wallis H检验，两两比较采用Kruskal-Wallis单因素方差分析进行多重比较。P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组大鼠心功能指标的比较

心脏超声检测结果显示，术前各组大鼠的心功能指标均正常。术后4周，与假手术组比较，模型组大鼠的LVEDV、LVESV均显著升高（P<0.05），EF和FS均显著降低（P<0.05），与模型组比较，黄芪甲苷组大鼠的LVEDV、LVESV均显著降低（P<0.05），EF和FS均显著升高（P<0.05）。见表1、图2。

3.2 各组大鼠血清NT-pProBNP含量的比较

与假手术组比较，模型组与黄芪甲苷组血清NT-pProBNP含量均显著升高（P<0.05）；与模型组比较，黄芪甲苷组血清NT-pProBNP含量显著降低（P<0.05）。见表2。

3.3 各组大鼠心肌组织MDA、GSH与Fe²⁺水平的比较

与假手术组比较，模型组心肌组织中的MDA和Fe²⁺水平均显著升高，GSH水平显著降低（P<0.05）；与模型组比较，黄芪甲苷组心肌组织中的MDA和Fe²⁺水平均显著降低，GSH水平显著升高（P<0.05）。见表3。

3.4 各组大鼠心肌组织病理状态的比较

模型组大鼠心肌结构紊乱，心肌间隔稍增宽，横纹消失，部分心肌纤维断裂，部分间质纤维组织增生，可见较多炎性细胞浸润等现象。与模型组比较，黄芪甲苷能够抑制心肌炎症，改善心肌细胞形态，修复瘢痕，保护心肌细胞完整。见图3。

3.5 各组大鼠心肌组织GPX4表达水平的比较

与假手术组比较，模型组大鼠心肌GPX4表达水平显著降低（P<0.05）；与模型组比较，黄芪甲苷组心肌GPX4表达水平显著升高（P<0.05）。表明黄芪甲苷可调控心肌组织GPX4蛋白的表达。见图4。

4 讨论

CHF作为一种常见且严重的心血管疾病，其治疗已成为全球医疗体系面临的严峻挑战。随着现代医学的不断发展，药物和手术疗法为心力衰竭患者提供了多种选择。尽管CHF的现代治疗理念和手段不断改进，但目前西医治疗多针对单一特定靶点，如血管紧张素转换酶抑制剂、β受体阻滞剂和利尿剂等，难以全面覆盖疾病的多个病理生理环节。长期使用此类化学药物还可能导致严重不良反应，包括电解质紊乱、体液流失和低血压^［2］。相比之下，中医药治疗作为历史悠久的传统医学手段，近年来在CHF的治疗中表现出独特的优势和潜力^［21］。黄芪甲苷是从传统中药黄芪中分离的天然皂苷类化合物，具有预防和治疗心血管疾病的作用^［22］，其药理作用涉及多靶点，包括抗心肌肥厚、抗缺血再灌注损伤、抗氧化应激、抑制钙超载和调节血管内皮细胞功能等。此外，NT-proBNP作为心力衰竭的重要生物标志物，其血清质量浓度升高与心力衰竭的严重程度密切相关^［23-24］。本研究结果显示，黄芪甲苷能够有效改善CHF大鼠的心脏泵血功能和心肌收缩能力，显著降低其血清NT-proBNP含量，有望成为CHF治疗的新选择。

铁死亡是一种新型调控性细胞死亡方式，目前已知其调控途径包含铁代谢、GSH代谢及脂质代谢，其中System Xc-/GSH/GPX4途径是调控铁死亡的主要途径^［25］。System Xc-由溶质载体家族7成员11和溶质载体家族3成员2组成，可通过跨质膜交换胱氨酸和谷氨酸，促进GSH合成^［6］。GSH是由半胱氨酸、谷氨酸和甘氨酸合成的高效细胞内抗氧化剂，其清除活性氧分子的核心机制依赖自身还原能力。作为抗氧化剂，GSH与脂质过氧化物反应后，会被GPX4转化为谷胱甘肽二硫化物^［26］。依赖GSH的GPX4可在细胞膜内将有毒的脂质氢过氧化物转化为无毒的脂质醇，从而阻止脂质过氧化过程^［27-29］。近年来，大量研究证实铁死亡与多种心血管疾病相关，其特征为铁离子相关代谢紊乱。同时，异常细胞死亡相关研究表明，铁代谢动态平衡对维持正常心功能至关重要。细胞质内铁沉积过多可直接导致血管舒张功能障碍、动脉粥样硬化斑块恶化、心律失常，最终引发心力衰竭^［30］。铁死亡及其后续反应的发生可导致机体抗氧化能力下降、脂质ROS过度累积，最终引发氧化性细胞死亡^［31-32］，MDA是氧自由基诱导脂质氧化的产物，可产生细胞毒性并加剧细胞膜损伤，常被用作反映氧化应激程度的指标^［33］。综上所述，观察黄芪甲苷对心肌组织中Fe²⁺、MDA、GSH和GPX4水平的影响，可在一定程度上反映其对铁死亡的调控作用。本研究结果显示，黄芪甲苷可显著降低心肌组织中MDA和Fe²⁺水平，增强心肌细胞抗氧化能力，减轻氧化应激对心肌细胞的损伤。同时，黄芪甲苷可升高GSH水平和GPX4表达，在一定程度上抑制铁死亡，从而保护心肌细胞、改善CHF大鼠心功能。以上表明黄芪甲苷可通过调控铁死亡相关通路中GSH、GPX4的表达与活性，抑制铁死亡途径激活，从而保护心肌细胞免受损伤。

本研究首次揭示了黄芪甲苷通过抑制铁死亡途径治疗CHF的潜在机制，不仅阐明了黄芪甲苷在CHF治疗中的心肌保护作用，也为中药活性成分应用于心血管疾病的治疗提供了新的理论依据。未来，将进一步深入探究黄芪甲苷治疗CHF的具体作用机制，以GPX4为切入点，深入研究其上下游信号通路，并探索其与其他治疗药物的联合应用效果，从而为CHF患者提供更有效、更安全的治疗方案。

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基金资助

新疆少数民族科技人才特殊培养计划科研项目(2022D03044)