山荷叶素通过调控Wnt/ β -连环蛋白通路对胃癌AGS细胞及移植瘤的影响

Effects of diphyllin on gastric cancer AGS cells and xenograft tumors via regulation of the Wnt/ β -catenin pathway

摘要

目的 探究山荷叶素（diphyllin，DP）通过调控Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）通路，对胃癌AGS细胞增殖、侵袭、上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）及移植瘤生长的影响。 方法 将胃癌AGS细胞分为对照组、山荷叶素低浓度（low concentration diphyllin， DP-L）组、山荷叶素高浓度（high concentration diphyllin，DP-H）组、山荷叶素高浓度+Wnt/β-catenin通路激活剂氯化锂（DP-H+LiCl）组。采用细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）检测各组AGS细胞的活性，克隆形成实验检测细胞增殖能力，划痕愈合实验检测细胞迁移能力、Transwell小室法检测细胞侵袭能力；实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）检测EMT相关基因的mRNA表达水平；蛋白免疫印迹法（Western blotting）检测Wnt/β-catenin通路相关蛋白及凋亡相关蛋白的表达量。构建胃癌裸鼠移植瘤模型，将裸鼠随机分为对照组、DP组、DP+LiCl组，连续给药4周后，检测裸鼠移植瘤的体积和质量。 结果 与对照组比较，DP-L组、DP-H组AGS细胞光密度（optical density，OD）值、克隆形成数、划痕愈合率、侵袭细胞数量均显著降低，N-钙黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（vimentin）和基质金属蛋白酶（matrix metallopeptidase 2，MMP2）mRNA的表达水平，以及Wnt1、β-catenin、B细胞淋巴瘤/白血病-2（B-cell lymphoma/leukemia 2，Bcl-2）蛋白的表达量均显著下调；Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）表达量及E-钙黏蛋白（E-cadherin）mRNA的表达水平均显著上调（P<0.05）；与DP-H组比较，DP-H+LiCl组AGS细胞的OD值、克隆形成数、划痕愈合率、侵袭细胞数量均显著升高；N-cadherin、vimentin及MMP2 mRNA的表达水平，以及Wnt1、β-catenin、Bcl-2蛋白的表达量均显著上调；Bax蛋白表达量及E-cadherin mRNA的表达水平均显著下调（P<0.05）。裸鼠移植瘤实验结果显示，与对照组比较，DP组裸鼠的移植瘤体积、质量及Wnt1、β-catenin蛋白表达量均显著降低（P<0.05）；而DP+LiCl组裸鼠的移植瘤体积、质量及Wnt1、β-catenin蛋白表达量均显著升高（P<0.05）。 结论 山荷叶素可通过调控Wnt/β-catenin通路，抑制胃癌AGS细胞的增殖、迁移、侵袭及EMT过程。

Abstract

Objective To investigate the effects of diphyllin （DP） on the proliferation， invasion， epithelial-mesenchymal transition （EMT）， and xenograft tumor growth of gastric cancer AGS cells through regulating the Wnt/β-catenin signaling pathway. Methods Gastric cancer AGS cells were divided into control group， low concentration diphyllin group （DP-L）， high concentration diphyllin group （DP-H）， and high concentration diphyllin + Wnt/β-catenin pathway activator lithium chloride group （DP-H+LiCl）. Cell viability was assessed using cell counting kit-8 （CCK-8） assay. Colony formation assay was performed to evaluate cell proliferation ability. Wound healing assay was used to detect cell migration ability， and Transwell assay was employed to measure cell invasion ability. The mRNA expression levels of EMT-related genes were detected by real-time quantitative polymerase chain reaction （RT-qPCR）. The expression levels of Wnt/β-catenin pathway-related proteins and apoptosis-related proteins were determined by Western blotting. A gastric cancer nude mouse xenograft model was established. The nude mice were randomly divided into control group， DP group， and DP+LiCl group. After continuous administration for 4 weeks， the volume and weight of the transplanted tumors were measured. Results Compared with the control group， the optical density （OD） value， number of colony formations， wound healing rate， and number of invading AGS cells in the DP-L group and DP-H group were significantly reduced. The mRNA expression levels of N-cadherin， vimentin， and matrix metallopeptidase 2 （MMP2）， as well as the protein expression levels of Wnt1， β-catenin， and B-cell lymphoma/leukemia 2 （Bcl-2）， were significantly downregulated. In contrast， the expression level of Bcl-2 associated X protein （Bax） and the mRNA expression level of E-cadherin were significantly upregulated （P<0.05）. Compared with the DP-H group， the DP-H+LiCl group exhibited significantly increased OD value， number of colony formations， wound healing rate， and number of invading AGS cells. The mRNA expression levels of N-cadherin， vimentin， and MMP2， as well as the protein expression levels of Wnt1， β-catenin， and Bcl-2， were significantly upregulated. In contrast， the protein expression level of Bax and the mRNA expression level of E-cadherin were significantly downregulated （P<0.05）. The results of the nude mouse xenograft experiment showed that compared with the control group， the tumor volume， tumor weight， and protein expression levels of Wnt1 and β-catenin in the DP group were significantly reduced （P < 0.05）. In contrast， the tumor volume， tumor weight， and protein expression levels of Wnt1 and β-catenin in the DP+LiCl group were significantly increased （P<0.05）. Conclusion Diphyllin inhibits the proliferation， migration， invasion， and EMT of gastric cancer AGS cells by regulating the Wnt/β-catenin signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

山荷叶素 / 胃癌 / Wnt/β-连环蛋白通路 / 细胞增殖 / 上皮间质转化 / 移植瘤

Key words

diphyllin / gastric cancer / Wnt/β-catenin pathway / cell proliferation / epithelial mesenchymal transition / xenograft

胃癌是临床常见的原发性恶性肿瘤之一，目前手术治疗、化疗、分子靶向治疗和辅助放疗是其主要的治疗手段，但患者整体预后仍不理想，5年生存率处于较低水平^［1］。临床研究发现，胃癌细胞的迁移和侵袭是导致患者病情进展、难以控制的主要原因，恶性肿瘤一旦发生转移，将显著缩短患者的生存时间^［2］。因此，深入研究癌细胞迁移和侵袭的分子机制，对胃癌的预防、诊断和治疗具有重要意义。相关研究证实，癌细胞的转移和侵袭常伴随多种细胞因子和信号通路的异常改变^［3］，其中上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）在癌细胞转移、侵袭过程中发挥重要调控作用^［4-5］。研究结果显示，EMT是胃癌转移的重要驱动因素，部分EMT相关因子［包括E-钙黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（vimentin）和N-钙黏蛋白（N-cadherin）］在胃癌患者中存在异常表达，此类蛋白表达失调可使癌细胞丧失上皮细胞特征、获得间充质细胞特征，进而增强其侵袭能力^［6］。Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）信号通路通过调节EMT过程，在癌细胞迁移和侵袭中发挥关键作用^［7］。体内外研究发现，抑制Wnt/β-catenin通路可有效抑制结直肠癌的侵袭、转移和EMT过程^［8］，因此，靶向调控该通路可能成为抑制胃癌细胞转移和侵袭的有效方式。目前，关于Wnt/β-catenin通路调控胃癌发生和发展的具体机制尚未明确。

研究发现，中药及其活性成分可通过靶向机体相关信号通路，发挥抗瘤、抑瘤的作用^［9］。山荷叶素（diphyllin，DP）是从传统药用植物中分离得到的芳基萘木聚糖内酯类化合物，具有广泛的药理活性。已有研究结果显示，DP具有显著的抗病毒、抗炎作用，其抗肿瘤活性尤其在胰腺癌的治疗中表现出巨大潜力^［10-11］。此外，研究证实DP可通过靶向调控Wnt/β-catenin信号通路，抑制卵巢癌细胞的迁移和侵袭^［12］，但目前关于DP调控该通路在胃癌细胞中的分子机制研究较为匮乏。本研究以胃癌AGS细胞为研究对象，探究DP通过调控Wnt/β-catenin通路对胃癌AGS细胞增殖、迁移、侵袭及EMT的影响，为胃癌的临床治疗提供理论基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器

DHP-9052-DT型二氧化碳培养箱（上海捷呈实验仪器有限公司）；Multiskan FC型酶标仪（美国赛默飞世尔公司）；Microfuge 20/20R型台式高速离心机［贝克曼库尔特国际贸易（上海）有限公司］；HM-P16型荧光定量PCR仪（山东恒美电子科技有限公司）；XDS-440C型倒置显微镜（上海蔡康光学仪器有限公司）；JP-2880型全自动凝胶成像分析系统（上海金鹏分析仪器有限公司）。

1.2 试药

山荷叶素（质量分数≥98%，天萃生物科技有限公司）；Wnt/β-catenin通路激动剂氯化锂（LiCl，质量分数≥99%，德国Sigma公司）；细胞计数试剂盒-8［cell counting kit-8，CCK-8，批号240330，汉恒生物工程（上海）有限公司］；杜氏改良伊格尔培养基（Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM）培养基（批号OMDCM-031，上海晶抗生物工程有限公司）；Transwell小室［批号3422，本生（天津）健康科技有限公司］；反转录试剂盒（批号MT0006，北京百奥莱博科技有限公司）；Wnt1（批号ab63934）、β-catenin（批号ab224803）、B细胞淋巴瘤/白血病-2（B-cell lymphoma/leukemia 2，Bcl-2，批号ab117115）、Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax，批号ab243140）、β-actin（批号ab8224），均购自美国Abcam公司。

1.3 细胞与实验动物

人胃癌细胞AGS（批号800278，北京伊塔生物科技有限公司）。

6周龄BALB/c雄性裸鼠，体质量为20~22 g，由武汉贝赛模式生物科技有限公司提供，饲养于无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级动物房，环境温度为22~24 ℃，相对湿度为50%~60%，12 h光暗循环，自由进食、饮水。

2 方法

2.1 细胞培养与分组

将冻存的AGS细胞复苏后，接种于DMEM培养基中常规培养，选取处于对数生长期的AGS细胞分为对照组、山荷叶素低浓度（low concentration diphyllin，DP-L）组、山荷叶素高浓度（high concentration diphyllin，DP-H）组、山荷叶素高浓度+Wnt/β-catenin通路激活剂氯化锂（DP-H+LiCl）组。参考相关文献^［13］及预实验确定的DP干预浓度，DP-L组、DP-H组分别采用含5、10 μmol·L^-1 DP的培养基培养，DP-H+LiCl组采用含10 μmol·L^-1 DP和20 mmol·L^-1 LiCl的培养基培养^［14］，各组细胞均培养24 h后收集，用于后续指标的检测。

2.2 CCK-8检测细胞活力

取各组AGS细胞接种于96孔板中，置于标准培养条件的细胞培养箱中培养24 h后，每孔加入CCK-8试剂，孵育结束后，在450 nm波长处测定各孔的光密度值（即OD_450nm值），以此反映细胞活力。

2.3 克隆形成实验检测细胞增殖能力

收集各组细胞，以1×10³·孔^-1的密度接种于6孔板中，置于细胞培养箱中培养14 d，待细胞集落形成后终止培养。弃去培养基，经固定、结晶紫染色处理后，在光学显微镜下观察并计数细胞集落数。

2.4 划痕实验检测细胞迁移能力

取各组AGS细胞接种在24孔板中，培养至细胞铺满孔底后，用200 µL无菌移液器吸头在孔底轻轻划制划痕。分别在划痕后0、24 h，置于倒置显微镜下观察细胞迁移情况，并计算划痕愈合率。

2.5 Transwell小室实验检测细胞侵袭能力

将预冷的Matrigel基质胶均匀铺于Transwell小室上室，置于4 ℃冰箱中孵育过夜。将各组AGS细胞用无血清培养基重悬至密度为5×10²个·µL^-1，接种于Transwell上室，下室加入含体积分数20%胎牛血清的培养基，培养48 h后，经固定、结晶紫染色处理后，在显微镜下观察并计数侵袭至下室的细胞数量。

2.6 实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）检测EMT相关基因mRNA的表达水平

收集各组处理后的AGS细胞，采用TRIzol法提取细胞总RNA，测定RNA浓度后，按照反转录试剂盒说明书进行操作，将RNA反转录成cDNA，采用实时荧光定量PCR法进行扩增反应，通过熔解曲线验证引物特异性，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase， GAPDH）为内参基因，计算各目标基因的相对表达量。引物序列见表1。

2.7 蛋白免疫印迹法（Western blotting）检测Wnt/β-catenin通路及凋亡相关蛋白的表达水平

收集各组AGS细胞，加入放射免疫沉淀分析缓冲液（radio immuno precipitation assay buffer，RIPA）裂解液裂解细胞，提取细胞总蛋白并定量。将蛋白进行变性处理后，采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分离总蛋白，随后将蛋白转移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。用质量分数5%脱脂奶粉室温封闭膜2 h，含吐温20的三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水（tris-buffered saline with tween 20，TBST）洗涤后，将膜与Wnt1、β-catenin、Bcl-2、Bax、β-actin一抗（1∶1 000）4 ℃孵育过夜；次日用TBST洗涤膜后，加入二抗IgG（1∶1 000）室温孵育1 h，再次洗涤膜后，进行化学发光可视化处理，采用成像系统检测蛋白条带灰度值，以β-actin为内参，计算各蛋白相对表达量。

2.8 裸鼠胃癌移植瘤模型的构建及干预

裸鼠经腹腔注射戊巴比妥钠麻醉后，于前腋皮下接种1×10⁷个·只^-1AGS细胞悬液。接种7 d后，待移植瘤大小明显时，将裸鼠随机分为对照组、DP组、DP+LiCl组，每组6只。DP组裸鼠腹腔注射50 mg·kg^-1 DP^［12］、DP+LiCl组裸鼠腹腔注射50 mg·kg^-1 DP和21.5 mg·kg^-1 LiCl^［15］，对照组裸鼠注射等体积的生理盐水，连续用药4周。第29天处死所有裸鼠，分离皮下移植瘤，测量肿瘤的体积和质量，Western blotting检测Wnt1、 β-catenin蛋白的表达。

2.9 统计学方法

使用SPSS 24.0统计学软件对数据进行分析。计量资料以（\overline{x}\pm s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（analysis of variance，ANOVA），组间两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组细胞活性的比较

与对照组比较，DP-L组、DP-H组AGS细胞的OD值均显著降低（P<0.05）；与DP-H组比较，DP-H+LiCl组AGS细胞的OD值显著升高（P<0.05）。见表2。

3.2 各组细胞克隆数量的比较

与对照组比较，DP-L组、DP-H组AGS细胞的克隆数量均显著减少（P<0.05）；与DP-H组比较，DP-H+LiCl组AGS细胞的克隆数量显著增多（P<0.05）。见图1、表3。

3.3 各组细胞迁移能力的比较

与对照组比较，DP-L组、DP-H组AGS细胞的划痕愈合率均显著降低（P<0.05）；与DP-H组比较，DP-H+LiCl组AGS细胞的划痕愈合率显著升高（P<0.05）。见图2、表4。

3.4 各组细胞侵袭能力的比较

与对照组比较，DP-L组、DP-H组的侵袭细胞数量均显著减少（P<0.05）；与DP-H组比较，DP-H+LiCl组的侵袭细胞数量显著增加（P<0.05）。见图3、表5。

3.5 各组细胞EMT相关基因mRNA表达水平的比较

与对照组比较，DP-L组、DP-H组AGS细胞的E-cadherin mRNA表达水平均显著升高，N-cadherin、vimentin和MMP2 mRNA表达水平均显著降低（P<0.05）；与DP-H组比较，DP-H+LiCl组AGS细胞的E-cadherin mRNA表达水平显著降低，N-cadherin、vimentin和MMP2 mRNA表达水平均显著升高（P<0.05）。见表6。

3.6 各组细胞中Wnt1/β-catenin通路蛋白表达水平的比较

与对照组比较，DP-L组、DP-H组AGS细胞的Wnt1、β-catenin、Bcl-2蛋白表达量均显著降低，Bax蛋白表达量显著升高（P<0.05）；与DP-H组比较，DP-H+LiCl组AGS细胞的Wnt1、β-catenin、Bcl-2蛋白表达量均显著升高，Bax蛋白表达量显著下降（P<0.05）。见图4、表7。

3.7 各组裸鼠移植瘤体积和质量的比较

与对照组比较，DP组的移植瘤体积和质量均显著减小（P<0.05）；与DP组比较，DP+LiCl组的移植瘤体积和质量均显著增大（P<0.05）。见表8。

3.8 各组裸鼠移植瘤中Wnt1和β-catenin蛋白表达量的比较

与对照组比较，DP组裸鼠移植瘤中Wnt1和β-catenin蛋白表达量均显著降低（P<0.05），与DP组比较，DP+LiCl组裸鼠肿瘤中Wnt1和β-catenin蛋白表达量均显著升高（P<0.05）。见表9、图5。

4 讨论

近年来，随着内镜检查的普及和早期胃癌诊断和治疗技术的快速发展，早期胃癌患者的预后得到显著改善。但晚期胃癌患者的死亡率居高不下，主要原因在于肿瘤的复发和转移，该过程是涉及多基因修饰、多步骤的病理过程^［16］，其中基因表达异常是导致胃癌发生、发展的重要因素。目前，临床用于胃癌治疗的靶向药物较为匮乏，改善胃癌患者预后、提高总体生存率仍是亟待解决的临床难题。DP是从药用植物山荷叶根茎中分离得到的天然芳基萘木脂素内酯类化合物，具有抗肿瘤、抗病毒、抗炎和抗氧化等广泛的药理活性。既往研究^［17］表明，DP可显著抑制结直肠腺癌细胞活性。本研究结果显示，在一定浓度范围内，随着DP干预浓度的升高，AGS细胞的活性降低、克隆形成数量减少，迁移及侵袭能力减弱，表明DP可抑制AGS细胞的恶性生物学行为，有望作为胃癌治疗的潜在药物。

EMT是肿瘤侵袭和转移发生的重要机制之一。近年来研究证实，在胃癌等多种恶性肿瘤中，EMT的异常激活对肿瘤恶性生物学行为的调控发挥重要的作用。EMT的典型特征表现为上皮细胞标志物（E-cadherin）表达缺失，间充质细胞标志物（N-cadherin、vimentin）过度表达^［18］。其中，E-cadherin作为单通道Ⅰ型跨膜蛋白，参与上皮细胞间的黏附、迁移和增殖调控；N-cadherin为钙依赖性单链跨膜糖蛋白，其表达升高与癌细胞侵袭、转移进展密切相关；vimentin可作为癌细胞转移的潜在生物标志物，在EMT过程中其表达显著上调；MMP是一类含锌蛋白酶，可促进癌细胞侵袭过程的发生。既往研究^［19］发现，胃癌细胞中E-cadherin表达降低，而N-cadherin、vimentin和MMP2的表达显著上升。本研究结果显示，DP可显著下调AGS细胞N-cadherin、vimentin和MMP2的表达，上调E-cadherin表达，表明DP可有效抑制AGS细胞的EMT过程。

Wnt/β-catenin信号通路调控胚胎发育、器官发生、组织稳态等多种重要的生理过程，其活性异常与肿瘤的发生、进展及恶性转化密切相关^［20］。此外，Wnt/β-catenin通路在肿瘤EMT过程中也发挥重要的调控作用，其被激活可促进肿瘤转移^［21］。Shi J等^［22］研究发现，肝细胞癌中Wnt-1/β-catenin信号通路活性增强、EMT异常发生及肝组织炎症加剧，抑制该信号通路可逆转EMT过程、减轻肝内炎症并改善免疫耗竭状态。同时，激活Wnt/β-catenin信号通路可通过上调抗凋亡蛋白表达，抑制细胞凋亡^［23］。本研究结果显示，胃癌AGS细胞中Wnt/β-catenin通路活性异常升高，Wnt1、β-catenin和Bcl-2蛋白表达显著上调；而DP干预可抑制该通路的活性，显著下调Wnt1、β-catenin和Bcl-2蛋白的表达，上调Bax蛋白的表达，表明DP可通过靶向抑制Wnt/β-catenin通路，改善AGS细胞的恶性生物学行为。为验证Wnt/β-catenin通路活性变化与AGS细胞恶性生物学行为的关联性，本研究在DP干预的同时，采用Wnt/β-catenin通路激活剂LiCl处理AGS细胞，结果显示，与DP-H组比较，DP-H+LiCl组细胞的增殖、迁移、侵袭能力和EMT水平均显著增强，表明LiCl可通过激活Wnt/β-catenin通路，逆转DP对AGS细胞恶性生物学行为的抑制作用。

除细胞层面的研究外，本研究进一步通过裸鼠胃癌移植瘤模型验证DP的抗肿瘤作用，将AGS细胞接种于裸鼠前腋皮下后，分别予以DP和DP+LiCl干预，结果显示，DP可显著抑制裸鼠移植瘤的生长，同时下调肿瘤组织中Wnt/β-catenin通路相关蛋白的表达，其抗肿瘤效应与张丽等^［12］的研究报道一致。此外，LiCl干预小鼠后，DP对裸鼠移植瘤生长的抑制作用显著减弱，且肿瘤组织中Wnt1、β-catenin蛋白的表达上调，进一步证实DP对AGS细胞增殖、迁移、侵袭和EMT的抑制作用，可能是通过抑制Wnt/β-catenin通路实现的。除本研究发现的DP通过调控Wnt/β-catenin通路抑制胃癌AGS细胞恶性生物学行为之外，另有研究^［13］发现，DP可通过靶向调节miRNAs表达，抑制甲状腺癌细胞增殖，提示DP在抗肿瘤领域具有广阔的应用潜力，未来有望成为临床癌症治疗的候选药物之一。

综上所述，DP对AGS细胞增殖、迁移、侵袭和EMT的抑制作用，与调控Wnt/β-catenin通路活性密切相关。本研究通过体内外实验，初步阐明了DP抗胃癌AGS细胞恶性生物学行为的具体分子作用机制，为DP在胃癌临床干预治疗中的应用奠定了理论基础。但本研究仍存在不足之处，仅以AGS细胞为研究对象，且样本量较小；未来可在胃癌MGC803、HSC-38等不同细胞系中进行重复验证，进一步明确DP的抑癌作用及作用机制。

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基金资助

武汉市卫生计生委科研计划资助项目(WZ24A34)