FOXA1通过Hedgehog信号通路调控子宫内膜癌细胞的增殖与迁移

FOXA1 regulates proliferation and migration of endometrial cancer cells through the hedgehog signaling pathway

摘要

目的 探讨FOXA1通过Hedgehog信号通路对子宫内膜癌细胞增殖和迁移能力的影响。 方法 以人子宫内膜癌细胞RL-95-2作为研究对象，分为shRNA-NC组（转染shRNA-NC），shRNA-FOXA1组（转染shRNA-FOXA1），SAG组（200 nmol·L^-1 Hedgehog通路激活剂SAG处理）和联合组（转染shRNA-FOXA1并用200 nmol·L^-1 SAG处理）。运用RT-qPCR法检测FOXA1 mRNA的表达水平；用3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT）法和Tunel法检测RL-95-2细胞的增殖和凋亡情况；用Transwell实验检测细胞迁移能力；用Western blotting检测FOXA1、Hedgehog通路、迁移和凋亡相关蛋白的表达水平。 结果 实验结果显示，与shRNA-NC组和SAG组比较，shRNA-FOXA1组和联合组的FOXA1 mRNA和蛋白表达水平均显著下调（P<0.05）。shRNA-FOXA1组和联合组相较于shRNA-NC组和SAG组，细胞增殖活力明显下降，凋亡率明显上升，而SAG组的变化趋势相反（P<0.05）。Transwell实验结果显示，相较于shRNA-NC组，shRNA-FOXA1组的细胞迁移能力明显减弱，而SAG组则增强，联合组介于shRNA-FOXA1组和SAG组之间（P<0.05）。与shRNA-NC组比较，shRNA-FOXA1组细胞中Hedgehog通路蛋白SHh、Smo、Gli1、迁移相关蛋白MMP2、MMP9及抑凋亡蛋白Bcl-2的表达水平均显著降低，而促凋亡蛋白Bax的表达水平则显著升高（P<0.05）。SAG组各蛋白的变化趋势与shRNA-FOXA1组相反，其中Smo、Gli1、MMP2、MMP9、Bcl-2表达水平均显著升高，Bax表达水平显著降低（P<0.05），但SHh蛋白表达水平与shRNA-NC组比较差异无统计学意义（P>0.05）。联合组中，除SHh蛋白表达水平与shRNA-FOXA1组比较差异无统计学意义（P>0.05）外，其余蛋白表达水平均介于shRNA-FOXA1组和SAG组之间，差异具有统计学意义（P<0.05）。 结论 FOXA1可能通过调控Hedgehog信号通路影响子宫内膜癌细胞的增殖和迁移，为子宫内膜癌的治疗提供新的分子靶点。

Abstract

Objective To investigate the effect of FOXA1 on the proliferation and migration of endometrial cancer cells through the Hedgehog signaling pathway. Methods Human endometrial cancer cell line RL-95-2 was used as the research object. The cells were divided into 4 groups： the shRNA-NC group （transfected with shRNA-NC）， the shRNA-FOXA1 group （transfected with shRNA-FOXA1）， the SAG group （treated with 200 nmol·L^-1 Hedgehog pathway activator SAG）， and the combination group （transfected with shRNA-FOXA1 and treated with 200 nmol·L^-1 SAG）. The mRNA expression level of FOXA1 was detected by reverse transcription quantitative polymerase chain reaction （RT-qPCR）. Cell proliferation and apoptosis were assessed by 3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide （MTT） assay and TUNEL assay， respectively. Cell migration ability was evaluated by Transwell assay. The protein expression levels of FOXA1， Hedgehog pathway-related proteins， migration-related proteins， and apoptosis-related proteins were detected by Western blotting. Results Compared with the shRNA-NC and SAG groups， the mRNA and protein expression levels of FOXA1 in the shRNA-FOXA1 and combination groups were significantly downregulated （P<0.05）. Compared with the shRNA-NC and SAG groups， the proliferation viability of cells in the shRNA-FOXA1 and combination groups was significantly decreased， while the apoptosis rate was significantly increased； conversely， the SAG group showed the opposite trend （P<0.05）. Transwell assay results showed that compared with the shRNA-NC group， the migration ability of cells in the shRNA-FOXA1 group was significantly weakened， whereas that in the SAG group was enhanced， and the combination group was intermediate between the shRNA-FOXA1 and SAG groups （P<0.05）. Compared with the shRNA-NC group， the expression levels of Hedgehog pathway proteins SHh， Smo， and Gli1， migration-related proteins MMP2 and MMP9， and the anti-apoptotic protein Bcl-2 were significantly decreased in the shRNA-FOXA1 group， while the pro-apoptotic protein Bax was significantly increased （P<0.05）. The SAG group showed the opposite trend to the shRNA-FOXA1 group： the expression levels of Smo， Gli1， MMP2， MMP9， and Bcl-2 were significantly increased， while Bax was significantly decreased （P<0.05）；however， SHh protein expression showed no significant difference compared with the shRNA-NC group （P>0.05）. Except for SHh protein expression， which showed no significant difference compared with the shRNA-FOXA1 group （P>0.05）， the expression levels of other proteins in the combination group were intermediate between those in the shRNA-FOXA1 and SAG groups， with significant differences（P<0.05）. Conclusion FOXA1 may regulate the proliferation and migration of endometrial cancer cells through the Hedgehog signaling pathway， providing a novel molecular target for the treatment of endometrial cancer.

Graphical abstract

关键词

FOXA1 / Hedgehog信号通路 / 子宫内膜癌 / 细胞增殖 / 细胞迁移

Key words

FOXA1 / Hedgehog signaling pathway / endometrial cancer / cell proliferation / cell migration

子宫内膜癌（endometrial cancer，EC）是一种起源于子宫内膜的上皮性恶性肿瘤，对女性健康构成严重威胁。在全球范围内，其是女性中第六大常见癌症，并且其发病率和死亡率呈上升趋势^［1］。据2022年全球癌症统计数据显示，全球新增EC病例42万例，死亡9.7万例^［2］。此外，Bray F等^［3］研究证实FOXA1在子宫内膜癌中通过转录激活MFAP2促进肿瘤生长、转移及顺铂耐药，进一步表明FOXA1在EC的发生和发展中发挥重要作用。EC的首选治疗方法是手术，尤其适用于早期患者。但晚期或希望保留生育能力的患者可能无法从手术中获益。对于无法手术的患者，放疗和化疗是延长生命的主要手段，但不良反应的问题较突出^［1］。因此，寻找更安全、更高效的治疗策略，对于提高患者的生活质量和生存率具有重要意义。

叉头框蛋白家族（Forkhead box proteins，FOXs）是一类转录因子家族，它们在进化过程中高度保守。FOXA1是其中的成员之一，广泛表达于乳腺、肝脏、肺、胰腺、肾脏、前列腺和肠道等多种器官组织中，对细胞增殖、分化和器官发育至关重要^［4］。此外，有研究结果表明，FOXA1在多种肿瘤的发生和发展中扮演关键角色，尤其是在乳腺癌、肺癌和前列腺癌中^［5-7］。研究发现，靶向抑制FOXA1表达可抑制前列腺癌细胞的增殖，这与AR通路和p27通路的活化有关^［5］。Hedgehog（Hh）信号通路在哺乳动物的生长发育中扮演重要角色，其异常激活与多种癌症的发生和发展有关，如肺癌、肝癌等^［8-9］。Hh家族包括Sonic Hedgehog（SHh）、Indian Hedgehog（IHh）和Desert Hedgehog（DHh）3个信号通路，其中SHh在人体组织中的表达最为广泛，研究也最为深入，其抑制剂已获得FDA批准用于基底细胞癌的治疗^［10-11］。GLI1是SHh信号通路的关键组成部分，与前列腺癌的侵袭、转移和去势抵抗有关，针对SHh途径的抗癌治疗是当前研究的热点^［12］。

近年来，有研究结果显示，FOXC2在绒毛膜癌细胞中呈高表达，当其在滋养层细胞中过表达时能显著增强滋养层细胞的黏附和侵袭能力，还可促进SHh、Gli1和Snail的表达，而使用FOXC2 siRNA则显示出相反的变化趋势^［13］。FoxR2在卵巢癌细胞中处于高表达状态，并与细胞生长、迁移和上皮-间质转化相关，还可促进SHh通路的信号转导，表明FoxR2通过激活Hedgehog信号通路促进肿瘤细胞的恶性行为^［14］。然而，FoxA1表达和SHh通路在EC中的共同作用机制尚不完全清楚。基于此，本研究探究FOXA1在EC中调节SHh通路的分子机制及对EC的生物学效应，以期为寻找治疗EC的新靶点提供理论基础和实验依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

恒温培养箱（天津市泰斯特仪器有限公司）；细胞孔板（上海碧云天生物技术股份有限公司）；CFX384^TM Touch型实时荧光定量PCR仪［伯乐生命医学产品（上海）有限公司］；TS100型倒置显微镜［奥林巴斯（中国）有限公司］。

1.2 试药

DMEM/F12完全培养基（武汉尚恩生物技术有限公司）；shRNA及阴性对照质粒，均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；胰蛋白酶、总RNA提取试剂（Trizol）及AMV反转录试剂盒，均购自生工生物工程（上海）股份有限公司；Lipofectamine^TM 2000转染试剂（上海远慕生物科技有限公司）；多聚甲醛、BCA蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，均购自上海碧云天生物技术股份有限公司；抗荧光淬灭剂（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司）；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司）；FOXA1抗体、Bax抗体、Bcl-2抗体、MMP2抗体、MMP9抗体、SHh抗体、Smo抗体及Gli1抗体，均购自爱博抗（上海）贸易有限公司；IgG二抗（武汉三鹰生物技术有限公司）。

1.3 细胞

人子宫内膜癌细胞RL-95-2（SNL-432）购自武汉尚恩生物技术有限公司。

2 方法

2.1 细胞培养

使用含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素双抗的DMEM/F12完全培养基培养人EC细胞RL-95-2，将细胞置于37 ℃且含有5% CO₂的恒温培养箱中用标准培养程序进行培养。

2.2 质粒转染与分组

将RL-95-2细胞的密度调整至5×10⁵个·mL^-1，接种于24孔培养板中，在37 ℃、5% CO₂的条件下培养12 h，为后续的转染步骤做准备。转染实验包括多个组别：shRNA-NC组（接受shRNA-NC的转染），shRNA-FOXA1组（接受shRNA-FOXA1的转染），SAG组（接受200 nmol·L^-1 Hedgehog通路激活剂SAG处理）和联合组（接受shRNA-FOXA1转染及200 nmol·L^-1 SAG处理）。所有转染操作均按照Lipofectamine^TM2000转染试剂的说明书进行。转染6 h后，更换新鲜培养基，继续培养48 h，以确保转染效率。

2.3 RT-qPCT法检测细胞FOXA1 mRNA的表达

取适量细胞样本，并依据RNA提取试剂盒说明书提取RNA。逆转录成cDNA。根据RT-qPCR试剂盒的操作说明书，以GAPDH作为内参基因，对FOXA1进行定量分析。引物序列：FOXA1上游引物5'-ATGTTCGAGTCACAGAGGATCG-3'，下游引物5'-TGGTGCTGGTGAGCTGAAT-3'；GAPDH上游引物5'-TGATCTAAAGCCACGCCTCC-3'，下游引物5'-GGGACCATTAGTGGGTGAGC-3'。反应条件：95 ℃预变性4 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s，共40个循环。重复进行3次，以2^-ΔΔCt方法计算目标基因的相对表达量。

2.4 Tunel法检测细胞凋亡

将细胞爬片置于24孔培养板中，按1×10⁵个·孔^-1的密度接种各组细胞，置于37 ℃、5% CO₂培养箱中培养24 h，并将培养板置于37 ℃、5% CO₂的环境中培养24 h。使用PBS清洗细胞爬片，将其浸泡在体积分数4%的多聚甲醛固定液中固定15 min，再次使用PBS清洗细胞爬片，置于2 μL 的Triton X-100溶液中通透处理10 min。用PBS清洗细胞爬片，滴加100 μL TdT平衡缓冲液，置于湿润环境中平衡30 min。加入50 μL TdT标记工作液，在湿润且避光的条件下反应60 min。反应结束后，向样本中滴加DAPI工作液对细胞核进行染色，并在室温下避光孵育5 min。加入抗荧光淬灭剂并封片，使用荧光显微镜观察并记录细胞的荧光图像。

2.5 MTT法检测细胞增殖活力

将各组细胞以每孔4×10³个的密度接种于96孔板中，置于37 ℃、5% CO₂细胞培养箱中培养24 h，向每孔加入20 μL质量浓度为5 mg·mL^-1的MTT溶液，继续培养4 h。随后弃去上清，向每孔加入150 μL二甲基亚砜，用多功能酶标仪测定各孔470 nm处的吸光度值。计算各组细胞活力。细胞活力（%）=[\left(A_{\mathrm{处理}\mathrm{组}}-A_{\mathrm{空白}\mathrm{对照}\mathrm{组}}\right)/\left(A_{\mathrm{s}\mathrm{h}\mathrm{R}\mathrm{N}\mathrm{A}-\mathrm{N}\mathrm{C}\mathrm{组}}-A_{\mathrm{空白}\mathrm{对照}\mathrm{组}}\right)]\times \mathrm{100}\mathrm{\%}。其中处理组指shRNA-FOXA1组、SAG组和联合组，空白对照组指未加入细胞组。

2.6 Transwell实验检测细胞迁移情况

收集各组细胞，用2.5 g·L^-¹胰蛋白酶作消化处理，在无血清培养基中重悬，调整细胞浓度为5×10⁵个·mL^-1。各组均取200 μL细胞悬液分别加入Transwell小室的上室，下室加入600 μL含血清的完全培养基，将细胞置于37 ℃、5% CO₂的恒温培养箱中培养24 h。培养结束后，取出上室，使用棉签轻轻拭去上室膜上未迁移的细胞残留。用PBS缓冲液洗涤2次，用多聚甲醛固定10 min，自然晾干。用 1.0 g·L^-¹结晶紫染液染色10 min。去除染液，并用双蒸水洗涤2次。每组均选取5个视野，使用倒置显微镜观察、拍照以及计数细胞。

2.7 Western blotting检测FOXA1、SHh通路及相关蛋白的表达

收集各组细胞，用RIPA裂解液进行裂解，离心收集上清液，用BCA法测定总蛋白。SDS-PAGE电泳分离蛋白并转移到PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h。加入FOXA1（1∶1 000稀释）、SHh（1∶1 000稀释）、Smo（1∶1 000稀释）、Gli1（1∶500稀释）、Bax（1∶2 000稀释）、Bcl-2（1∶2 000稀释）、MMP2（1∶1 000稀释）和MMP9（1∶1 000稀释）一抗，于4 ℃条件下孵育过夜，以确保抗体与目标蛋白充分结合。洗去一抗，加入二抗，室温孵育2 h，洗去二抗。使用ECL试剂进行显色反应，并利用蛋白凝胶成像仪扫描胶片，Image J分析目的条带灰度值，以目的条带灰度值与GAPDH灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达量。

2.8 统计学方法

使用Graphpad prism 9软件对数据进行处理。计量数据采用（\overline{x}±s）表示。多组间多重比较采用One-way ANOVA单因素方差分析，两两比较采用Bonferroni校正的t检验，独立实验至少重复3次。P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 FOXA1 mRNA及蛋白质表达水平的比较

在RL-95-2细胞中，shRNA-NC组和SAG组FOXA1 mRNA和蛋白质表达水平比较差异均无统计学意义（P>0.05）。与shRNA-NC组和SAG组比较，shRNA-FOXA1组和联合组的FOXA1 mRNA和蛋白质表达均明显下调（P<0.05）。见图1、图2。

3.2 细胞增殖能力的比较

与shRNA-NC组比较，shRNA-FOXA1组和联合组的细胞增殖活力均明显下降，而SAG组则明显上升，差异有统计学意义（P<0.05）。shRNA-FOXA1组、SAG组和联合组细胞的增殖活力比较，差异有统计学意义，shRNA-FOXA1组的细胞增殖活力低于SAG组和联合组，SAG组的细胞增殖活力高于联合组（P<0.05）。见图3。

3.3 细胞凋亡情况的比较

通过Tunel法检测各组的细胞凋亡情况，实验结果显示，与shRNA-NC组细胞比较，shRNA-FOXA1组和联合组的细胞凋亡率明显上升，而SAG组则明显下降，差异具有统计学意义（P<0.05）。见图4、图5。

3.4 细胞迁移能力的比较

与shRNA-NC组比较，shRNA-FOXA1组的迁移细胞数量明显减少，而SAG组则明显增多，差异具有统计学意义（P<0.05）。联合组的迁移细胞数量介于shRNA-FOXA1组和SAG组之间，差异具有统计学意义（P<0.05）。见图6、图7。

3.5 细胞SHh通路、迁移与凋亡相关蛋白表达的比较

与shRNA-NC组比较，shRNA-FOXA1组和联合组的SHh、Smo、Gli1、Bcl-2、MMP2、MMP9蛋白表达水平均显著降低，而Bax蛋白表达水平则显著上升（P<0.05）；SAG组的Smo、Gli1、Bcl-2、MMP2和MMP9蛋白表达水平均明显升高，Bax蛋白表达水平则明显下降（P<0.05），SHh蛋白表达水平与shRNA-NC组比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图8、图9、图10。

4 讨论

EC作为女性生殖系统中常见的恶性肿瘤，对女性健康构成了重大威胁。近年来，EC的发病率持续上升，且发病有趋于年轻化的趋势^［15］。有研究发现，EC患者与肥胖症具有很强的相关性^［16］。除此之外，EC发病率还与人口老龄化、种族间差异、雌激素暴露、糖尿病、多囊卵巢综合征等多种因素相关^［17］。在临床上，EC的首选治疗方法是手术，更适合早期患者的治疗。对于不适宜手术的患者，放疗和化疗是重要的治疗方式，但存在不良反应，且疗效欠佳^［1］。因此，迫切需要探索新的治疗方法，以提高患者的生存率和生存质量，延长生存期。

FOXA1作为转录因子，由3个关键功能区组成：N端的转录激活域负责激活下游基因的转录，中间的DNA结合域可与特定DNA结合，以及C端的与组蛋白H3/H4相互作用的转录结合域，在胚胎发育和上皮细胞分化中发挥重要作用^［18］。研究发现，FOXA1参与调控肿瘤发展的多个阶段，包括细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移等生物学过程^［19］。FOXA1在ERα阳性乳腺癌中呈高表达状态，并且与患者不良预后相关，其机制可能与FOXA1调控X盒结合蛋白1等癌基因的表达从而促进乳腺癌细胞的增殖有关^［20］。结直肠癌细胞中FOXA1被敲低后，能观察到肿瘤细胞的侵袭和迁移能力减弱，并诱导了细胞凋亡和细胞周期停滞。FOXA1敲低可促进半胱天冬酶-3（caspase-3）活化及聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）裂解，上调p53表达，从而促进肿瘤细胞凋亡，同时增加信号转导和转录激活因子3（STAT3）的磷酸化水平^［21-22］。MMP9和MMP2是基质金属蛋白酶家族的成员，在肿瘤细胞的侵袭和迁移过程中发挥促进作用^［22］。升高人绒毛膜滋养层细胞HTR-8/SVneo中MMP2 mRNA及蛋白表达水平后，观察到细胞侵袭和迁移能力显著增加^［23］。MMP9在人肾癌细胞中过表达也能观察到相似结果^［24］。本研究结果发现，sh-FOXA1转染RL-95-2细胞后，shRNA-FOXA1组的细胞增殖活力、迁移细胞数量、MMP9和MMP2蛋白表达水平均降低（P<0.05），细胞凋亡率则明显升高（P<0.05）。这与上述研究结果一致，表明FOXA1可能参与EC的发生和发展过程，沉默其表达可抑制癌细胞增殖、迁移，促进癌细胞凋亡。

SHh信号通路在脊椎动物胚胎发育中起着至关重要的作用，该通路涉及SHh配体、Ptch1/2受体、SMO蛋白、SUFU抑制分子和Gli1转录因子等多个信息分子。当SHh结合到Ptch上时可减少Ptch对SMO的抑制作用，从而激活SMO。SMO活化后抑制SUFU的隔离和PKA、CK1等蛋白的磷酸化，使Gli1免于被降解。稳定的Gli1转移到细胞核内，激活SHh通路靶基因的转录，从而调控细胞增殖和分化^{［10，25］}。近年来有研究发现，SHh信号通路异常激活对于胰腺癌、肺癌、前列腺癌和卵巢癌的发病进程至关重要，并与乳腺癌的发生和转移关系密切^［26］。肺腺癌及癌旁组织内的SHh通路被激活，SHh蛋白表达量显著增加，其差值与肺腺癌患者肿瘤大小及术后死亡风险呈现显著的负相关性^［27］。在胃癌中也观察到SHh的表达失调^［28］。研究发现，抑制SHh/Gli1通路可降低Ki67、神经性钙黏蛋白、波形蛋白及Bcl-2的表达，提高细胞凋亡率、Bax及上皮细胞钙黏蛋白表达，抑制上皮间质转化的发生^［29］。SHh通路可通过激活PI3K/Akt通路促进胃癌的上皮间质转化、提高MMP-9表达和淋巴管生成，增强肿瘤的侵袭性和转移能力。SHh通路可通过激活PI3K/Akt通路促进胃癌的上皮间质转化、提高MMP-9表达和淋巴管生成，增强肿瘤的侵袭性和转移能力^［30］。本研究发现，与shRNA-NC组比较，shRNA-FOXA1组的SHh、Smo、Gli1表达水平均显著降低（P<0.05）；与shRNA-FOXA1组比较，联合组的细胞增殖活力，迁移细胞数量，SHh、Smo、Gli1、Bcl-2、MMP2、MMP9蛋白表达水平均显著升高，Bax蛋白表达水平降低（P<0.05）。表明FOXA1表达沉默对EC细胞增殖、迁移的抑制作用及对凋亡的促进作用可能与其抑制SHh通路有关，而SHh激活可逆转FOXA1表达沉默对EC细胞生物学行为的抑制作用。

本研究揭示了FOXA1通过Hedgehog信号通路调控EC细胞的增殖和迁移，为临床治疗提供了新的分子靶点。但本研究存在一些不足之处。首先，本研究主要基于人子宫内膜癌细胞RL-95-2细胞系，虽然这一细胞系在子宫内膜癌研究中被广泛使用，但仅代表一种细胞类型，可能无法全面反映所有子宫内膜癌细胞的特性。其次，样本来源的单一性限制了对个体间遗传和表型差异的理解，这可能影响FOXA1和Hedgehog信号通路在不同患者中的表达和功能。此外，本研究基于体外实验探究FOXA1对SHh通路的调控，不涉及细胞微环境，结果具有片面性，且未评估临床应用潜力。针对这些局限性，未来的研究中将引入更多的子宫内膜癌细胞系，以增强结果的普适性和可靠性。另外，将扩展研究到体内模型以及分析临床样本，以验证体外实验结果的准确性，并探索FOXA1对Hedgehog信号通路的调控作用及其对子宫内膜癌发展的影响，同时分析该通路在实际患者中的表达模式与临床特征的相关性。

综上所述，本研究揭示了FOXA1通过Hedgehog信号通路影响EC细胞的增殖和迁移，为EC治疗提供了新的分子靶点。虽然体外实验结果支持FOXA1在调控癌细胞行为中的作用，但需要进行体内研究和临床评估进一步验证其作为治疗靶点的潜力和效果。

参考文献

[1] 黄苏日古嘎，黄笑，曹邦伟.子宫内膜癌的内分泌治疗研究进展［J］.中国医院用药评价与分析，2024，24（3）：379-384．

[2] HUANG Suriguga， Huang Xiao， Cao Bangwei.Progress of endocrine therapy for endometrial cancer［J］. Evaluation and Analysis of Drug-Use in Hospitals of China，2024，24（3）：379-384．

[3] Bray F， Ferlay J， Soerjomataram I，et al.Global cancer statistics 2018：GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries［J］.CA Cancer J Clin，2018，68（6）：394-424．

[4] Bray F， Laversanne M， Sung H，et al.Global cancer statistics 2022：GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries［J］．CA Cancer J Clin，2024，74（3）：229-263．

[5] 杜文艳，王干，李卓，等.FOXA1在恶性肿瘤中的作用及其机制研究进展［J］.临床医学进展，2024，14（5）：2434-2440．

[6] Du Wenyan， Wang Gan， Li Zhuo，et al.The role of FOXA1 in malignant tumors and the progress of its mechanism research［J］.Advances in Clinical Medicine，2024，14（5）：2434-2440．

[7] 瞿小祥，鲁小红.靶向抑制转录因子FOXA1对前列腺癌细胞增殖的影响及机制研究［J］.中国性科学，2020，29（5）：1-3．

[8] Qu Xiaoxiang， Lu Xiaohong.Effect of targeted inhibition of transcription factor FOXA1 on the proliferation of prostate cancer cells and its mechanism［J］.Chinese Journal of Human Sexuality，2020，29（5）：1-3．

[9] 柴效科，程晓成，卫翀羿，等.FOXA1在乳腺癌中的研究进展［J］.临床肿瘤学杂志，2023，28（7）：642-647．

[10] Chai Xiaoke， Cheng Xiaocheng， Wei Chongyi，et al ．Research progress of FOXA1 on breast cancer［J］.Chinese Clinical Oncology，2023，28（7）：642-647．

[11] Zhu A， Zhou C， Dong J，et al.FOXA1-NAT10 positive feedback pathway promotes non-small cell lung cancer cell progression［J］.J Biochem Mol Toxicol，2025，39（11）：e70597．

[12] 赵迎杰，夏松长，聂书慧，等.苦参碱通过Hedgehog信号通路对肺癌A549细胞顺铂化疗敏感性的影响［J］.西北药学杂志，2024，39（5）：61-67．

[13] Zhao Yingjie， Xia Songchang， Nie Shuhui，et al.Effect of matrine on the chemosensitivity of cisplatin in lung cancer A549 cells through Hedgehog signaling pathway［J］．Northwest Pharmaceutical Journal，2024，39（5）：61-67．

[14] 邵香香，潘旭红，王永英，等.Hedgehog信号通路调控肝癌上皮间质转化的研究进展［J］.吉林医学，2023，44（1）：179-183．

[15] Shao Xiangxiang， Pan Xuhong， Wang Yongying，et al ．Research progress of Hedgehog signaling pathway regulating epithelial-mesenchymal transition of hepatocellular carcinoma［J］. Jilin Medical Journal，2023，44（1）：179-183．

[16] Cong G， Zhu X， Chen X R，et al.Mechanisms and therapeutic potential of the hedgehog signaling pathway in cancer［J］. Cell Death Discov，2025，11：40．

[17] Chmiel P， Kłosińska M， Forma A，et al. Novel approaches in non-melanoma skin cancers-a focus on hedgehog pathway in basal cell carcinoma （BCC）［J］.Cells，2022，11（20）：3210．

[18] Vecchiotti D， Verzella D， Di Vito Nolfi M，et al ．Elevated NF-κB/SHh/GLI1 signature denotes a worse prognosis and represent a novel potential therapeutic target in advanced prostate cancer［J］.Cells，2022，11（13）：2118．

[19] Zhang Y， Zhang Y.Forkhead box C2 promotes the invasion ability of human trophoblast cells through Hedgehog （Hh） signaling pathway［J］.Cell Biol Int，2018，42（7）：859-866．

[20] Li B， Huang W， Cao N，et al. Forkhead-box R2 promotes metastasis and growth by stimulating angiogenesis and activating hedgehog signaling pathway in ovarian cancer［J］. J Cell Biochem，2018，119（9）：7780-7789．

[21] 吕加金，靳双玲，李玉凡. 子宫内膜癌分子分型的研究进展［J］.健康研究，2023，43（5）：556-559．

[22] Jiajin Lü， Jin Shuangling， Li Yufan. Research progress on molecular classification of endometrial cancer［J］. Health Research，2023，43（5）：556-559．

[23] 陈姝宁，孔为民，罗丹. 肥胖和代谢异常与子宫内膜癌关系研究进展［J］. 中国临床医生杂志，2022，50（1）：40-43．

[24] Chen Shuning， Kong Weimin， Luo Dan.Research progress on the relationship between obesity，metabolic abnormality and endometrial cancer［J］.Chinese Journal for Clinicians，2022，50（1）：40-43．

[25] 邓茜，俞文英.子宫内膜癌分子分型研究进展［J］.现代实用医学，2024，36（5）：565-569．

[26] Deng Qian， Yu Wenying. Research progress on molecular typing of endometrial carcinoma［J］. Modern Practical Medicine，2024，36（5）：565-569．

[27] Li C， Geng D， Zhao W，et al.Regulation of gene expression by FOXA1［J］.Oncol Transl Med，2025，11（6）：282-291．

[28] 刘可峰，王伟，范永刚，等. FOXA1调控Notch通路对结肠癌细胞增殖及侵袭影响的研究［J］. 中国普外基础与临床杂志，2022，29（4）：444-449．

[29] Liu Kefeng， Wang Wei， Fan Yonggang，et al. Study of influences of FOXA1 regulating Notch pathway on proliferation and invasion of colon cancer cells［J］. Chinese Journal of Bases and Clinics in General Surgery，2022，29（4）：444-449．

[30] 姚欣逸，徐宝红，张孟婷，等.FOXA1通过调控XBP1的转录促进乳腺癌增殖的功能及机制研究［J］.岭南现代临床外科，2023，23（1）：10-18．

[31] Yao Xinyi， Xu Baohong， Zhang Mengting，et al ．Functional and mechanistic study of FOXA1 in promoting the proliferation of breast cancer by regulating the transcription of XBP1［J］.Lingnan Modern Clinics in Surgery，2023，23（1）：10-18．

[32] Park Y L， Kim S H， Park S Y，et al. Forkhead-box A1 regulates tumor cell growth and predicts prognosis in colorectal cancer［J］.Int J Oncol，2019，54（6）：2169-2178．

[33] Pan J， Xu Z， Xu M，et al. Knockdown of Forkhead box A1 suppresses the tumorigenesis and progression of human colon cancer cells through regulating the phosphatase and tensin homolog/Akt pathway［J］.J Int Med Res，2020，48（12）：300060520971453．

[34] 吴凯，刘圆，张辉，等.DNA损伤诱导的长链非编码RNA（DINO）下调MMP2表达抑制人绒毛膜滋养层细胞侵袭与迁移［J］.细胞与分子免疫学杂志，2022，38（8）：736-742．

[35] Wu Kai， Liu Yuan， Zhang Hui，et al.DNA damage induced long non-coding RNA（DINO）down-regulates the expression of MMP2 and inhibits the invasion and migration of human chorionic trophoblast cells［J］. Chinese Journal of Cellular and Molecular Immunology，2022，38（8）：736-742．

[36] 张晓文，张婵，张迪，等.川楝素通过MMP9抑制肾癌细胞的增殖、迁移和侵袭［J］.中国免疫学杂志，2023，39（4）：793-797，803．

[37] Zhang Xiaowen， Zhang Chan， Zhang Di，et al ．Toosendanin inhibits proliferation，migration and invasion of renal carcinoma cells by MMP9［J］. Chinese Journal of Immunology，2023，39（4）：793-797，803．

[38] Zhuang T.Hedgehog pathway，cell cycle，and primary Cilium ［J］. Cell Death Discov，2025，11（1）：302．

[39] 张鑫，王飞，崔冰洁，等.Hedgehog信号通路磷酸化修饰在肿瘤发生发展中作用的研究进展［J］.吉林大学学报：医学版，2025，51（2）：526-533．

[40] Zhang Xin， Wang Fei， Cui Bingjie，et al.Research progress in effect of phosphorylation modification of Hedgehog signaling pathway on occurrence and development of tumor［J］.Journal of Jilin University：Medicine Edition，2025，51（2）：526-533．

[41] 张国薇，周婷，李连凤，等. Shh蛋白水平与肺腺癌临床特征及预后的关系［J］.华中科技大学学报：医学版，2024，53（2）：220-228．

[42] Zhang Guowei， Zhou Ting， Li Lianfeng，et al ．Correlation between shh protein expression and clinical features and prognosis of lung adenocarcinoma［J］.Acta Medicinae Universitatis Scientiae et Technologiae Huazhong，2024，53（2）：220-228．

[43] Akhtar K， Maqbool I， Ahmad Bhat G，et al. Role of sonic hedgehog ligand in gastric cancer therapeutics［J］. J Cancer Res Ther，2022，18（）：S267-S272．

[44] 安琪，齐光照，韩超. 麦冬皂苷B调节Shh/Gli1通路对肝细胞癌上皮间质转化及耐药性的影响［J］. 世界临床药物，2024，45（3）：285-293．

[45] An Qi， Qi Guangzhao， Han Chao. Effects of ophiopogonin B on regulation of sonic hedgehog/glioma associated oncogene homolog 1 pathway on epithelial mesenchymal transformation and drug resistance in hepatocellular carcinoma［J］.World Clinical Drugs，2024，45（3）：285-293．

[46] Yoo Y A， Kang M H， Lee H J，et al. Sonic hedgehog pathway promotes metastasis and lymphangiogenesis via activation of Akt，EMT，and MMP-9 pathway in gastric cancer［J］. Cancer Res，2011，71（22）：7061-7070．