酸枣仁有效成分斯皮诺素经不同途径给药后体内分布及体外吸收的研究

Study on in vivo distribution and in vitro absorption of the active component spinosin from Ziziphi spinosae Semen via different administration routes

摘要

目的 考察酸枣仁有效成分斯皮诺素经不同途径给药后在血浆和脑组织中的分布特征，并结合细胞模型分析其体外吸收的差异性。 方法 以葛根素为内标，建立高效液相色谱法用于测定生物样品中斯皮诺素的含量；分别采用经口灌胃、经鼻给药方式给予实验大鼠斯皮诺素，考察其在血浆、脑及嗅球组织中的药代动力学特征；分别采用人结肠腺癌细胞（human colorectal adenocarcinoma cel，Caco-2）和脑微血管内皮细胞（rat brain microvascular endothelial cells，BMEC）、人肺腺癌细胞（human lung adenocarcinoma cells，Calu-3）和BMEC共培养细胞模型，考察斯皮诺素经口、经鼻的体外吸收过程。 结果 所建立的生物样品中斯皮诺素含量测定方法具有良好的选择性，血浆、脑及嗅球组织中斯皮诺素和葛根素的峰面积比与浓度比的线性相关系数均\ge0.991 2，精密度范围为0.12%~9.22%，准确度范围为83.49%~113.12%；灌胃给药后，仅在血浆中检测到斯皮诺素；经鼻给药后，血浆、脑和嗅球组织中均检测到较高浓度的斯皮诺素，其血浆药时曲线下面积和达峰浓度均显著高于灌胃给药组；体外吸收实验中，斯皮诺素在Calu-3/BMEC细胞模型中的累积转运率和表观渗透系数均低于Caco-2/BMEC细胞模型。 结论 经鼻给药可通过嗅球直接转运通路和鼻黏膜吸收入血间接通路，显著增加酸枣仁有效成分斯皮诺素的入脑吸收量。

Abstract

Objective To investigate the plasma and brain distribution of spinosin， the active ingredient of Ziziphi spinosae Semen， administered by different routes and to analyze the absorption difference in co-culture cell models. Methods The content of spinosin in biological samples was determined by high-performance liquid chromatography （HPLC） method with puerarin as an internal standard. The pharmacokinetic characteristics of plasma， brain and olfactory bulb tissues in rats were investigated after intragastric and intranasal administration of spinosin. The in vitro absorption processes of spinosin were investigated using co-culture cell models of human colorectal adenocarcinoma cells （Caco-2） and rat brain microvascular endothelial cells （BMEC）， as well as human lung adenocarcinoma cells （Calu-3） and BMEC. Results The HPLC method established for the determination of spinosin content in biological samples had good selectivity. The linear correlation coefficients between the peak-area ratio of spinosin and puerarin and their concentration ratio were greater than 0.991 2 in plasma， brain and olfactory bulb tissue. The precision ranged from 0.12% to 9.22% and the accuracy ranged from 83.49% to 113.12%. Spinosin was only detected in plasma after intragastric administration. But for intranasal administration， higher content of spinosin were detected in the plasma， brain tissue， and olfactory bulb tissue. Moreover， the area under the plasma concentration-time curve and the peak concentration in the intranasal administration group were significantly higher than those in the intragastric administration group. In vitro absorption assay， the cumulative transport rate and apparent permeability coefficient of spinosin in Calu-3/BMEC cell model were both lower than those in Caco-2/BMEC cell model. Conclusion The absorption of spinosin in the brain tissue can be increased by intranasal administration， which may be through direct transport along the olfactory bulb and indirect absorption through the intranasal mucosa.

Graphical abstract

关键词

斯皮诺素 / 给药途径 / 体内分布 / 体外吸收 / 药代动力学

Key words

spinosin / administration route / in vivo absorption / in vitro absorption / pharmacokinetics

酸枣仁，味甘、酸，性平，归肝、胆、心经，具有滋补心肝、安神定志、敛汗生津的功效，是古今临床常用的养心安神类中药^［1］。酸枣仁的化学成分主要包括三萜皂苷类、黄酮类、生物碱类、脂肪酸类和多糖类等，其中皂苷类与黄酮类成分是其发挥镇静催眠作用的主要有效组分，斯皮诺素、酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B分别是酸枣仁总黄酮和总皂苷的主要有效成分^［2］。斯皮诺素可通过调节脑组织中5-羟色胺、γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）水平发挥镇静催眠作用^［3-5］，Qiao L等^［6］研究发现，静脉注射斯皮诺素（5 mg·kg^－1）能显著上调大鼠海马神经元GABA_Aα1和GABA_Aα5的表达水平，抑制神经元兴奋，从而改善睡眠状态；Zhang J P等^［7］研究证实，斯皮诺素可显著降低睡眠-觉醒相关脑区（下丘脑外侧区和蓝斑）中原癌蛋白c-Fos的表达，诱导催眠效应。由此可见，斯皮诺素的治疗区域在脑组织，需入脑后才能发挥其改善睡眠障碍的药理作用。

目前已有研究报道了斯皮诺素经口服给药后的生物利用度特征，例如Li Y等^［8］研究发现，大鼠灌胃给予斯皮诺素（20 mg·kg^-1）后的绝对生物利用度仅为2.2%；Song P等^［9］通过在体单向肠灌流实验证实，斯皮诺素的吸收速率常数（0.02 h^-1）和吸收百分比（10%）均较低，肠道吸收效果不佳。斯皮诺素口服给药后生物利用度低，且其入脑分布特征尚未明确。仅有Zhang Y等^［10］报道，静脉给予大鼠斯皮诺素（5 mg·kg^-1）后，其在脑组织不同部位的含量由高至低依次为：纹状体（222.68 ng·g^-1）、海马（213.98 ng·g^-1）、大脑（176.91 ng·g^-1）和小脑（151.90 ng·g^-1）。分析其原因可能为：一方面，斯皮诺素属于黄酮类碳苷化合物，相对分子质量为608.5，具有水溶性与脂溶性均较差的特点，属于低溶解度、低渗透性物质；另一方面，口服给药需先后经过胃肠道屏障和血脑屏障，显著限制了其入脑分布。因此，明确斯皮诺素口服给药后的脑组织分布特征，探寻可减少其入脑屏障的给药方式，对提升或阐明以斯皮诺素为有效成分的酸枣仁安神功效具有重要意义。

在可实现药物入脑的给药方式中，口服与静脉给药为临床常用手段，但因胃肠道屏障和血脑屏障的存在，极大地限制了药物在脑组织中的蓄积量。脑局部给药方式（如脑室内注射^［11］、微泵颅内输送^［12］等）虽可使药物直接进入脑组织，但存在操作复杂、对中枢神经系统不良作用大等弊端。相比之下，鼻腔给药作为一种非侵入性给药途径，在脑部疾病治疗领域受到广泛关注。自1982年以来，美国食品药品监督管理局已批准多款用于治疗中枢神经系统疾病的鼻用制剂，例如用于治疗12岁以上癫痫患者集群性癫痫发作的咪达唑仑鼻喷雾剂、用于治疗成人有或无先兆急性偏头痛的舒马曲坦鼻喷雾剂^［13］。关于通过鼻腔给药增加脑神经相关疾病治疗药物入脑量的研究也不断被报道，如通过鼻腔给予治疗帕金森病的盐酸司来吉兰纳米乳，有效改善了药物的脑吸收效果^［14］；通过鼻内给予长春西汀纳米乳，显著增加了药物在阿尔茨海默病病灶区的分布^［15］。鼻腔给药具有避开胃肠屏障、起效迅速、患者依从性好等优势，在中枢神经系统疾病的治疗中具有显著潜力，但鼻黏液纤毛清除、酶促降解、药物鼻腔滞留时间短和鼻黏膜毒性等问题，仍需在其临床应用中进一步解决^［15-16］。

为探究斯皮诺素灌胃给药后能否进入实验动物的脑组织，以及鼻腔给药后能否增加其脑组织分布，本研究首先建立了生物样品中斯皮诺素的含量测定方法，比较在灌胃和经鼻给药两种方式下斯皮诺素在大鼠血浆和脑组织中的分布差异；进一步结合体外吸收模型，分析两种给药方式下药物跨吸收屏障的差异性，以期探寻提高斯皮诺素和酸枣仁安神作用的可行给药方式，为改善睡眠类酸枣仁产品的研发提供实验依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

LC-2030-3D型高效液相色谱仪（日本Shimadzu公司）；ZLS-2型真空离心浓缩仪（湖南赫西仪器装备有限公司）；HC-2518型高速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；THZ-100B型恒温培养摇床（上海一恒科学仪器有限公司）；24、12孔Transwell培养板（聚酯膜，孔径为0.4 μm，美国Millipore公司）；Millcell^® ERS-2型电阻仪（美国Millipore公司）。

1.2 试药

杜氏改良Eagle培养基（dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM，批号10013105）、Hanks平衡盐溶液溶液（Hanks’ balanced salt solution，HBSS，批号29924002CJ）、胎牛血清（批号7E881C4）、体积分数0.25%胰酶（批号20230128）、青霉素-链霉素溶液（批号WH0125E151），均购自西安赫特生物科技有限公司；磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline，PBS，批号WHB826N031，武汉赛维尔生物科技有限公司）；斯皮诺素（色谱级，质量分数为99.9%，批号23021601）、葛根素（色谱级，质量分数为98.0%，批号HP148456），均购自成都普菲德生物技术有限公司；肝素钠（质量分数>99%，批号H6060，北京博远泰隆生物科技有限公司）；二甲基亚砜（批号G1125001931A）、乙腈（色谱级，批号133472），均购自美国天地有限公司；甲醇（批号20230502）、乙酸乙酯（批号20230102），均为分析级，均购自天津市科密欧化学试剂有限公司。

1.3 实验动物和细胞

清洁级雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，体质量为（200±10） g，购自西安交通大学实验动物中心。本研究中动物实验方案获西安交通大学医学部生物医学伦理委员会审核、批准。

人结肠腺癌细胞Caco-2购自齐氏生物科技有限公司；人肺腺癌细胞Calu-3购自武汉普诺赛生命科技有限公司。

2 方法与结果

2.1 色谱分析的条件

采用Inert Sustain SwiftTM C₁₈柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；以乙腈（A）-体积分数0.02%甲酸水溶液（B）为流动相，梯度洗脱，洗脱程序为：0~8 min，10% A→13% A；8~13 min，13% A；13~16 min，13% A→20% A；16~21 min，20% A；21~31 min，20% A→80% A；31~41 min，80% A→10% A；流速为1 mL·min^-1；柱温为30 ℃；进样量为10 μL；检测波长分别为250、335 nm。

2.2 储备液和系列对照品溶液的制备

取斯皮诺素、葛根素（内标物）各适量，精密称定，分别加入甲醇配制成质量浓度为1.0 mg·mL^-1的储备液；精密量取斯皮诺素、葛根素储备液适量，用甲醇稀释，制备成斯皮诺素质量浓度分别为0.25、0.50、0.75、1.00、1.50、2.00、3.00、4.00、5.00、10.00、15.00 µg·mL^-1，内标葛根素质量浓度均为2.00 µg·mL^-1的系列对照品溶液。

2.3 血浆及组织样品的制备

2.3.1 血浆样品

精密吸取血浆200 μL，加入内标溶液20 μL（质量浓度为2.00 µg·mL^-1），涡旋振荡30 s，加入600 µL甲醇进行蛋白沉淀，涡旋振荡1 min，以12 000 r·min^-1离心10 min，吸取上清液，经真空浓缩仪在40 ℃浓缩至干，加入150 µL甲醇溶解残渣，以12 000 r·min^-1离心10 min，取上清进行高效液相色谱（high performance liquid chromatography， HPLC）分析。

2.3.2 脑组织样品

取脑组织适量，精密称定，加入生理盐水（料液比1∶5，m/v）制备匀浆，精密吸取200 μL脑组织匀浆液，加入内标溶液20 μL（质量浓度为2.00 µg·mL^-1），涡旋振荡30 s，加入1 mL甲醇-乙酸乙酯混合溶剂（8∶2，v/v），涡旋振荡1 min，以12 000 r·min^-1离心10 min，取上清液；向沉淀中加入600 μL上述混合溶剂，重复离心过程，合并两次上清液，后续浓缩、除溶剂等操作同血浆样品处理。

2.3.3 嗅球组织样品

取嗅球组织适量，精密称定，加入生理盐水（料液比1∶5，m/v）制备匀浆，精密吸取100 μL组织匀浆液，加入内标溶液20 μL（质量浓度为2.00 µg·mL^-1），涡旋振荡30 s，加入500 μL甲醇，涡旋振荡1 min，以12 000 r·min^-1离心10 min，取上清液，后续浓缩、除溶剂等操作同血浆样品处理。

2.4 质控样品的制备

取空白血浆，加入斯皮诺素质量浓度分别为0.25、0.75、5.00、10.00 µg·mL^-1的系列含内标对照品溶液，制备成质量浓度分别为25、75、500、1 000 ng·mL^-1的定量限、低、中、高质量浓度的血浆质控样品；分别取空白脑组织、空白嗅球组织匀浆液，加入斯皮诺素质量浓度分别为0.25、0.75、1.50、3.00 µg·mL^-1的系列含内标对照品溶液，制备成含量分别为125、375、750、1 500 ng·g^-1的定量限、低、中、高浓度的脑组织质控样品、含量分别为250、750、1 500、3 000 ng·g^-1的定量限、低、中、高浓度的嗅球组织质控样品。

2.5 生物样品中斯皮诺素含量测定的方法学考察

2.5.1 选择性

分别取大鼠空白血浆、空白脑组织、空白嗅球组织样品，血浆、脑组织、嗅球组织质控样品，以及不同途径给药后的大鼠血浆、脑组织、嗅球组织样品，按照2.3项下方法处理，按照2.1项下色谱条件进样分析。结果显示，血浆、脑组织、嗅球组织中斯皮诺素的测定不受内源性物质干扰，葛根素与斯皮诺素分别在10.60、19.43 min出峰，分离度良好，表明该方法的选择性良好。见图1。

2.5.2 标准曲线和线性范围

取空白血浆、空白脑组织和空白嗅球组织匀浆液，分别加入不同质量浓度的系列混合对照品溶液，按照2.3项下方法处理，制备成斯皮诺素质量浓度分别为25、50、100、200、300、400、500、1 500 ng·mL^-1的血浆校正标样，含量分别为125、250、500、1 000、1 500、2 000 ng·g^-1的脑组织校正标样，含量分别为250、500、1 000、2 000、4 000、5 000 ng·g^-1的嗅球组织校正标样，按照2.1项下色谱条件进样分析，以对照品峰面积和内标物峰面积的比值作为纵坐标（y），对照品浓度和内标物质量浓度的比值作为横坐标（x），采用1/x²加权最小二乘法进行线性回归，所得回归方程见表1。结果显示，不同生物样品中斯皮诺素在各自质量浓度/含量范围内线性关系良好，相关系数（r）均≥0.991 2。

2.5.3 精密度和准确度

将定量限、低、中、高浓度/含量的血浆、脑组织、嗅球组织质控样品按照2.1项下色谱条件分别进样分析，每各浓度平行测定6份，计算批内精密度；连续3 d进样，计算批间精密度。精密度用测得浓度值的相对标准偏差（relative standard deviation， RSD）表示，准确度以（测得值/真实值）×100%表示。见表2。结果显示，血浆、脑组织、嗅球组织的定量限、低、中、高4个质量浓度/含量质控样品，批内精密度RSD为0.12%~3.65%，准确度为85.85%~113.12%；批间精密度RSD为0.34%~9.22%，准确度为83.49%~109.20%，批内、批间定量限质控样品的RSD均小于20%，表明该方法的精密度和准确度均符合生物样品测定要求。

2.5.4 提取回收率

将定量限、低、中、高质量浓度/含量的血浆、脑组织、嗅球组织质控样品按照2.1项下色谱条件分别进样分析，记录峰面积A；分别取空白血浆、空白脑组织匀浆液、空白嗅球组织匀浆液，经甲醇或混合溶剂处理后吸取上清液，加入不同质量浓度的混合对照品溶液，挥干溶剂后，后续操作参同血浆/组织样品处理，进样得峰面积B，以（A/B）×100%计算提取回收率，结果用（\overline{x}\pm s）表示。结果显示，血浆、脑组织、嗅球组织的定量限、低、中、高质量浓度/含量质控样品的提取回收率为83.60%~95.01%，RSD值均小于5%（见表2），表明待测成分提取回收率良好，可满足生物样品中斯皮诺素的含量测定要求。

2.5.5 稳定性

选取低、高质量浓度质控样品各6份进行稳定性考察，分别考察样品处理前（-20 ℃保存30 d、3次冻融循环）与样品处理后（自动进样器中放置24 h、室温放置4 h）的稳定性，计算相对偏差（relative error，RE）。RE=［（测得质量浓度/含量-标示质量浓度/含量）/标示质量浓度/含量］×100%，见表3。各试样在上述4种条件下的RE为-3.68%~9.86%，RSD为0.11%~6.11%，表明本实验设置的储存和测定条件可保障斯皮诺素生物样品的稳定性。

2.6 斯皮诺素大鼠体内药动学的研究

选取健康雄性SD大鼠80只，实验前禁食12 h，自由饮水，随机分为灌胃给药组、鼻腔给药组，每组40只，给药剂量均为25 mg·kg^-1。鼻腔给药方法：大鼠经体积分数3%戊巴比妥钠麻醉后，仰卧位固定，给药体积为每侧鼻孔75 μL，左右鼻孔交替给药。分别于给药前、给药后0.083、0.250、0.500、1.000、2.000、4.000、8.000、12.000 h经颈静脉取血（给药后每个时间点从5只大鼠采样），全血置于肝素化离心管中，以3 500 r·min^-1离心10 min，吸取上层血浆，于-20 ℃保存备用。各时间点采血完成后，立即处死大鼠，迅速分离脑组织和嗅球组织，于-20 ℃保存备用。按照2.3项下方法处理，按照2.1项下色谱条件进样分析，记录峰面积，代入随行标准曲线方程计算浓度，血浆及组织中斯皮诺素含量用（\overline{x}\pm s）表示。采用DAS 2.0软件进行药代动力学拟合计算，将处理后的数据导入GraphPad Prism 8.0软件绘制药-时曲线，采用t检验分析两组给药方式的差异性。见图2。

结果显示，大鼠灌胃给药后，血浆中斯皮诺素在给药后0.63 h达到峰质量浓度（C_max），为（276.79±26.10） ng·mL^-1；鼻腔给药后，血浆中斯皮诺素在1.25 h达到C_max，为（1 143.69±112.30） ng·mL^-1。灌胃给药的血浆达峰时间早于鼻腔给药，但C_max显著低于后者；灌胃给药后，嗅球组织、脑组织中均未检测到斯皮诺素；而鼻腔给药后，脑组织和嗅球中药物含量分别于给药后0.31、0.25 h达到峰值，两者达峰时间接近，但嗅球组织峰浓度显著高于脑组织。

鼻腔给药后，斯皮诺素在血浆、脑组织和嗅球组织中均有较高的药时曲线下面积（area under curve， AUC）（见表4），其中以嗅球组织中AUC_0➝t 最大，分别为血浆、脑组织的1.13、1.92倍。灌胃给药仅能在血浆中检测到斯皮诺素，其血浆AUC_0➝t和AUC_0➝∞均较低，其中AUC_0➝t仅为鼻腔给药组的11.74%。与灌胃给药比较，鼻腔给药可显著增加斯皮诺素的入血吸收量，且嗅球组织中存在较高浓度的斯皮诺素分布，最终使进入脑组织的药物量显著增加。

2.7 基于Caco-2/BMEC细胞模型分析斯皮诺素转运行为

以人结肠腺癌细胞（human colorectal adenocarcinoma cells，Caco-2）模拟肠道屏障^［17］，大鼠脑微血管内皮细胞（rat brain microvascular endothelial cells， BMEC）模拟血脑屏障^［18］，将Caco-2细胞与BMEC细胞嵌套培养，构建接近体内经口入脑吸收过程的体外模型，初步分析药物先通过肠道屏障入血、再跨越血脑屏障入脑的转运行为。实验采用细胞计数（cell counting kit-8，CCK-8）法^［19］，考察斯皮诺素质量浓度对Caco-2细胞和BMEC细胞活力的影响，设置斯皮诺素质量浓度为5、25、50、100、200 µg·mL^-1，与细胞共培养24 h后测定吸光度值（A值），计算细胞存活率。细胞存活率（%）=［（实验组A值-空白组A值）/（对照组A值-空白组A值）］×100%。

将生长状态良好、密度为1×10⁵个·mL^-1的Caco-2细胞接种于24孔Transwell内插室膜上，按常规流程培养21 d后去除培养基，采用电阻仪测量跨膜电阻（transepithelial electrical resistance，TEER）值，TEER值大于300 Ω·cm²方可用于后续实验；参照实验室已建立的方法分离提取BMEC细胞^［18］，将密度为1×10⁵个·mL^-1的BMEC细胞接种于12孔Transwell内插室膜，培养至细胞TEER值达到150 Ω·cm²；将接种有Caco-2细胞的24孔内插室嵌套于接种有BMEC细胞的12孔内插室，继续培养3 h。同时设置仅接种Caco-2细胞、仅接种BMEC细胞的单层模型作为对照。培养3 h后，吸去上层培养基，加入0.3 mL斯皮诺素溶液（100 µg·mL^-1），中、下层中分别加入0.5、1.0 mL空白HBSS溶液；在37 ℃、50 r·min^-1条件下孵育，分别于15、30、60、90、120 min时吸取下层1.0 mL溶液，并补加1.0 mL空白HBSS溶液。Caco-2、BMEC单层细胞模型中，于内插室上层分别加入等量斯皮诺素药液，下层加入1.0 mL空白HBSS溶液，其余操作同嵌套培养模型。下层收集的样品经真空浓缩仪挥干溶剂，甲醇溶解后，采用HPLC法测定^［20］，以外标法计算斯皮诺素浓度（C_i），根据公式分别计算累积转运率（cumulative transport rate，R）和表观渗透系数（apparent permeability coefficient，P_app）。Q_i=C_i\times V+\sum C_{i-\mathrm{1}}\times V； R_i =Q_i /m₀；P_app=（dQ/dt）×［1/（A×C₀）］，其中，C_i为不同时间收集的药物质量浓度（µg·mL^-1）；V为BL侧HPSS缓冲溶液体积（mL）；m₀为初始质量（μg）；dQ/dt为单位时间内转运量（μg·s^-1）；A为Transwell内插室膜面积（cm²）；C₀为初始质量浓度（µg·mL^-1）。

结果显示，斯皮诺素质量浓度在5~200 µg·mL^-1范围内，对Caco-2细胞和BMEC细胞活力无显著影响。Caco-2、BMEC单层模型在孵育15 min即可检测到斯皮诺素，而Caco-2/BMEC嵌套模型需孵育30 min才可检测到斯皮诺素；在120 min孵育时间内，斯皮诺素的累积转运量均随孵育时间延长而增加，但累积转运率存在显著差异，Caco-2/BMEC嵌套模型的累积转运率显著低于Caco-2、BMEC单层模型，且30 min后BMEC单层模型的累积转运率显著低于Caco-2单层模型（P<0.01）。计算斯皮诺素经3种细胞模型的通透性，30 min后各检测时间点的P_app值以Caco-2单层模型最高，BMEC单层模型次之，Caco-2/BMEC嵌套模型最低。上述结果表明，斯皮诺素在体外可跨越胃肠道和血脑屏障，其中血脑屏障的阻滞作用强于胃肠道屏障，且药物经胃肠道屏障和血脑屏障双重转运后，其转运量显著降低。见图3。

2.8 斯皮诺素经Calu-3/BMEC细胞模型转运行为的分析

斯皮诺素对人肺腺癌细胞（human lung adenocarcinoma cells，Calu-3）活力的影响考察方法同Caco-2细胞实验方法。采用Calu-3细胞模拟鼻黏膜屏障^［21］，将Calu-3细胞与BMEC细胞嵌套培养，构建鼻腔给药后药物经鼻黏膜吸收进入血液循环、再跨血脑屏障入脑的体外模型，模拟药物经鼻入脑的间接通路。将Calu-3细胞以3×10⁵个·mL^-1的密度接种于24孔Transwell内插室膜^［22］，待细胞单层汇合后，吸出上室培养基，在气-液界面继续培养14 d，每日更换培养基，待TEER值达到300 Ω·cm²；BMEC细胞按照2.7项下方法接种培养，将接种有Calu-3细胞的Transwell内插室嵌套于接种有BMEC细胞的内插室孵育3 h后，加入0.3 mL质量浓度为100 µg·mL^-1的斯皮诺素溶液，其余操作参照2.7项下方法进行，同时设置Calu-3、BMEC单层细胞模型作为对照，分别模拟药物鼻腔给药后的鼻黏膜吸收行为及跨血脑屏障转运行为。

结果显示，当斯皮诺素质量浓度在5~200 µg·mL^-1范围内时，对Calu-3细胞的活力无显著影响。Calu-3、BMEC单层模型在孵育15 min时即可检测到斯皮诺素，而Calu-3/BMEC嵌套模型则需30 min可检测到斯皮诺素；随着孵育时间的延长，3种模型中斯皮诺素的累积转运量均呈逐渐上升趋势，在60~120 min时间段内，斯皮诺素在两种单层模型中的累积转运率无明显差异，而Calu-3/BMEC嵌套模型的累积转运率显著低于单层模型。与之相一致，该时间段内斯皮诺素在Calu-3和BMEC单层模型中的P_app值差异无统计学意义，而在Calu-3/BMEC嵌套模型中的P_app值显著低于两种单层模型（P<0.01）。

3 讨论

生物样品处理方法对于待测物斯皮诺素及内标物葛根素的提取回收率具有显著影响，因此本研究对血浆、脑和嗅球组织的样品处理方法进行了系统考察。本研究比较了蛋白沉淀法和冷冻干燥样品法两种处理方法，发现采用甲醇沉淀蛋白后，生物样品中目标成分的提取回收率均显著高于冷冻干燥法。随后进一步考察了甲醇用量对提取效果的影响，结果显示，当甲醇与血浆的体积比由2∶1升高至3∶1时，葛根素与斯皮诺素的提取回收率均显著升高；当体积比继续增加至4∶1时，提取回收率无明显变化，表明血浆样品采用3倍体积甲醇进行蛋白沉淀可获得较优的提取效果［斯皮诺素提取回收率为（96.52%±2.68%）、葛根素提取回收率为（95.53%±0.33%）］。对于脑组织样品，采用生理盐水匀浆后，经甲醇沉淀蛋白，再以甲醇-乙酸乙酯混合溶剂（体积比8∶2）提取2次，可有效排除组织内源性物质对目标成分检测的干扰，且提取回收率较高［斯皮诺素提取回收率为（94.35%±1.74%）、葛根素提取回收率为（90.31%±1.63%）］。

斯皮诺素在脑组织中的有效分布是其发挥镇静催眠作用的前提条件，本研究比较了两种不同给药方式下斯皮诺素的入脑分布特征。首先参照酸枣仁临床常用口服给药方式，对实验大鼠进行灌胃给药，结果显示，血浆中可检测到斯皮诺素，而嗅球及脑组织在整个检测周期内均未检测到该成分；采用鼻腔给药后，血浆、嗅球及脑组织中均检测到较高质量浓度的斯皮诺素，这一现象可能与鼻腔给药存在多条入脑通路密切相关。已有研究报道，经鼻前庭到达嗅区的药物，可沿嗅觉神经转运至嗅球组织，进而直接进入脑组织；到达呼吸区的药物可通过三叉神经直接转运至大脑，也可通过该区域丰富的毛细血管被吸收入血，再跨越血脑屏障间接转运到大脑；而未在鼻腔内滞留、进入气道或食道的药物，也可通过体循环间接输送至大脑^［23-24］。因此，本研究在鼻腔给药后采集大鼠的嗅球组织进行检测，结果显示，嗅球组织中的斯皮诺斯在给药后0.25 h即达到峰值，AUC_0➝t 最大，表明经鼻腔给药后，部分斯皮诺素可通过嗅球通路直接进入脑组织。灌胃给药后12 h内，嗅球组织中未检测到斯皮诺素，推测经鼻给药后通过直接通路入脑，对斯皮诺素在脑组织中的分布增加具有主要贡献。

为考察斯皮诺素经鼻腔给药后通过间接通路入脑的可能性，本研究除检测动物血浆中斯皮诺素含量外，还采用Calu-3/BMEC细胞模型，考察了斯皮诺素跨鼻黏膜屏障和血脑屏障的转运特性，实验结果表明，斯皮诺素可成功跨越Calu-3、BMEC单层细胞模型。然而，与模拟灌胃给药经胃肠道屏障和血脑屏障转运的Caco-2/BMEC细胞模型比较，斯皮诺素在Calu-3/BMEC细胞模型中的累积转运率和P_app值均偏低。由此推测，尽管鼻腔给药后药物经间接通路入脑时受到的屏障阻滞作用可能大于灌胃给药，但由于直接入脑通路的存在，使得鼻腔给药仍能显著提高斯皮诺素在脑组织中的分布量。

斯皮诺素作为酸枣仁发挥镇静催眠作用的主要有效成分之一，提高其在作用靶器官（脑组织）中的浓度，对提高酸枣仁的临床治疗效果具有重要意义。本研究通过对斯皮诺素不同给药途径的体内、外吸收行为进行系统考察，证实灌胃给药由于受到多种生物屏障的限制，极大降低了斯皮诺素进入脑组织的效率；而鼻腔给药可借助嗅球通路将药物直接转运至脑组织，显著增加其入脑吸收量。

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