黄芩苷mPEG-PLGA纳米粒制备工艺的优化及体外评价

Optimization of the prescription process for baicalin-loaded mPEG-PLGA nanoparticles and their in vitro evaluation

摘要

目的 以聚乙二醇-聚乳酸羟基乙酸共聚物（polyethylene glycol-polylactic-co-glycolic acid copolymer， mPEG-PLGA）为载体材料制备负载黄芩苷（baicalin， BAI）的纳米粒（BAI mPEG-PLGA NPs），筛选最佳工艺条件并对纳米粒进行评价。 方法 采用超声自组装法制备BAI mPEG-PLGA NPs。通过单因素考察初步探索影响因素后，选取药物浓度（X₁），载药比（X₂）和去离子水体积（X₃）作为考察因素，以包封率（Y₁）和粒径（Y₂）作为评价指标，采用Box-Behnken响应面实验对制备工艺进行进一步优化，对优化后的纳米粒进行外貌形态、稳定性、体外释放、细胞毒性等考察。 结果 BAI mPEG-PLGA NPs的最优制备工艺为：黄芩苷质量浓度为1.49 mg·mL^-1，mPEG-PLGA与黄芩苷投料比为10.5∶1，DMSO滴加时间为5 min，去离子水体积为20 mL，超声时间为10 min。制备的纳米粒包封率为（91.62%\pm1.24%）；粒径为（120.1\pm6.2） nm；Zeta电位为（-11.1±1.84） mV；多分散系数（polydispersity index， PDI）为（0.093±0.014）；透射电镜下呈现球形或类球形结构；具有良好的稳定性、缓释效果和细胞相容性。 结论 以mPEG-PLGA为载体制备出了包封率高，尺寸适当、分布均一的载黄芩苷纳米粒。该纳米粒有望改善黄芩苷在体内的作用特征，为其在口腔疾病中的临床实际应用提供参考。

Abstract

Objective To prepare baicalin （BAI）-loaded nanoparticles （NPs） by using methoxy poly（ethylene glycol）-poly（lactic-co-glycolic acid） （mPEG-PLGA） as the carrier material， and to optimize the formulation process and evaluate the resulting nanoparticles. Methods BAI-mPEG-PLGA NPs were prepared via an ultrasonic self-assembly method. After preliminary exploration of influencing factors through single-factor experiments， a Box-Behnken response surface design was employed to further optimize the formulation， with drug concentration （X₁）， drug-to-carrier ratio （X₂）， and deionized water volume （X₃） as independent variables， and encapsulation efficiency （Y₁） and particle size （Y₂） as response variables. The nanoparticles were subsequently characterized in terms of morphology，stability，in vitro release behavior，and cytotoxicity. Results The optimized preparation conditions for BAI-mPEG-PLGA NPs were as follows： BAI concentration of 1.49 mg·mL^-1，mPEG-PLGA-to-BAI feeding ratio of 10.5∶1， dimethyl sulfoxide （DMSO） titration time of 5 minutes， deionized water volume of 20 mL， and sonication time of 10 minutes. Under these conditions， the nanoparticles exhibited an encapsulation efficiency of （91.62%±1.24%）， a particle size of （120.1±6.2） nm， a Zeta potential of （-11.1±1.84） mV， and a polydispersity index （PDI） of （0.093±0.014）. The nanoparticles displayed a spherical or spheroidal morphology， favorable stability， sustained-release characteristics， and good cell compatibility. Conclusion BAI-loaded nanoparticles with high encapsulation efficiency， appropriate particle size， and uniform distribution were successfully prepared by using mPEG-PLGA as the carrier， with the formulation optimized through single-factor and Box-Behnken response surface experiments. These nanoparticles are expected to improve the performance of BAI and provide valuable insights for its practical clinical application， particularly in the treatment of oral diseases.

Graphical abstract

关键词

聚乙二醇-聚乳酸羟基乙酸共聚物 / 黄芩苷 / 纳米粒 / Box-Behnken响应面法 / 自组装 / 包封率 / 口腔疾病

Key words

mPEG-PLGA / baicalin：nanoparticles / Box-Behnken response surface methodology / self-assembly / encapsulation efficiency / oral diseases

黄芩苷（baicalin）作为中药黄芩中的黄酮类化合物成分^［1］，来源于黄芩根部，其药理作用包括抗菌、消炎、抗癌、抗过敏、抗氧化等^［2-4］，临床上用于急性活动性肺炎、肾炎、肾盂及变态反应性疾病的治疗。近年来大量文献报道黄芩苷在口腔溃疡、牙周炎、龋齿、牙本质过敏症等一系列口腔疾病的治疗与防治中具有一定的效果^［5］。黄芩苷通过减缓胶原降解、促进创面愈合、减弱凋亡信号^［6］来达到对口腔溃疡的治疗作用。在治疗牙周炎方面，其可以抑制牙周致病菌的生长，降低炎症因子释放^［7］，诱导牙周膜干细胞增殖，促进成骨^［8-9］。另外，黄芩苷可以诱导口腔癌细胞的凋亡^［10］，抑制癌细胞的增殖和迁移^［11-13］，在口腔癌的药物治疗过程中也有望成为新的辅助药物。目前，在治疗口腔疾病的多种药物剂型中就含有黄芩苷，如双黄补制剂、双黄连牙膏、复方黄芩含漱液^［14］等。但黄芩苷存在的一系列问题限制了其临床应用，如亲水性、亲油性较差，口服不易吸收，体内降解过快等^［15-16］。纳米给药系统是一种将药物包裹或分散于纳米级别载体中的新型药物递送系统。与传统的口腔药物剂型相比，纳米制剂具有较小的粒径和较大的比表面积，能够改善药物的溶出与释放，赋予药物更大的缓释性能^［17］，以实现更高效、更安全的药物治疗。随着纳米制剂的不断开发，其在口腔疾病的治疗中表现出良好的应用前景^［18］。鉴于黄芩苷在口腔疾病等方面的多重作用，对黄芩苷进行纳米制剂的开发^［19］，构建一种载药量高、水溶性好及缓释效果好的新型纳米给药系统，有望使黄芩苷有效透过口腔黏膜，延长作用时间，提高生物利用度。聚乙二醇-聚乳酸羟基乙酸共聚物（polyethylene glycol-polylactic acid glycolic acid， mPEG-PLGA）是由亲水性的PEG和亲脂性的PLGA聚合而成的具有良好生物相容性的两亲性嵌段化合物，主要被用于药物传递系统的制备，可以降低药物毒性，提高血管通透性，避免药物过早降解，解决药物生物利用度低、半衰期短的问题^［20］，其应用方式主要有纳米粒、微球和水凝胶等^［21-23］。本研究采用超声自组装法构建黄芩苷-mPEG-PLGA纳米给药系统，用响应面法筛选最优处方，对制得的纳米粒进行评价，期望为黄芩苷口腔临床应用提供一种新途径。

1 仪器与试药

1.1 仪器

ME204型十万分之一天平（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）；UV-2600型紫外分光光度计（日本岛津仪器株式会所）；Nano-ZS90型马尔文激光粒度仪（英国马尔文公司）；B11-3型磁力搅拌器（郑州生化仪器有限公司）；JY90-2D型超声波粉碎机（宁波新芝生物技术股份有限公司）；PGJ-10-AS型制纯水机（武汉品冠仪器设备有限公司）；HQ45Z型恒温摇床（武汉中科科仪技术发展有限公司）；DGJ-10C型冷冻干燥机（上海博登生物科技有限公司）；Allegrea 64R型冷冻离心机（BECKMAN COULTER公司）；JEM-1400Plus型高分辨透射电子显微镜（芬兰赛默飞世尔有限公司）；SW-CJ-2FD型超净工作台（苏州安泰净化集团）：MCO175型细胞培养箱（日本SANYO）；酶标仪（Thermo Fisher公司）

1.2 试药

聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸二嵌段共聚物（mPEG-PLGA，mPEG-PLGA50/50，相对分子质量为10 000，济南岱罡生物科技有限公司）；黄芩苷（质量分数为95%，上海麦克林生物化工科技股份有限公司）；二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide， DMSO，分析纯，质量分数>99.5%，上海麦克林生物化工科技股份有限公司）；去离子水（自制）；透析袋（截留相对分子质量为3 500，北京兰杰柯科技有限公司）；人牙龈成纤维细胞（上海中乔新舟生物科技有限公司）；人工唾液（pH6.8，上海源叶生物科技有限公司）；CCK-8试剂盒（碧云天生物科技有限公司）。

2 方法与结果

2.1 BAI mPEG-PLGA NPs的制备

采用超声辅助自组装法制备BAI mPEG-PLGA NPs，将不同量的黄芩苷和mPEG-PLGA超声溶解于2 mL DMSO中，然后将混合溶液滴入一定体积去离子水中并不断搅拌，待滴入完成后，利用超声细胞破碎机的高频超声作用辅助自组装（间歇脉冲，脉冲时间为3 s，间歇时间为2 s，输出功率为90 W）。超声结束后透析冷冻干燥即得BAI mPEG-PLGA NPs。

2.2 BAI mPEG-PLGA NPs包封率的测定

称取适量的纳米粒置于离心管中，加入10倍体积的DMSO，以12 000 r·min^-1超声破乳离心15 min，重复3次，使黄芩苷完全释放，收集上清液，利用紫外分光光度计测定上清液在黄芩苷最大吸收波长（281 nm）处的吸光度值，计算黄芩苷的含量和包封率。包封率（%）=纳米粒中所含药物的质量/药物总质量。

2.3 BAI mPEG-PLGA NPs制备工艺的考察

mPEG-PLGA可在选择性介质（如溶剂或表面活性剂）中，通过高剪切力（如搅拌或超声）诱导自组装，实现药物的包载，生成载药纳米粒。在纳米粒的制备过程中，药物浓度、药载比、有机相和水相比等因素均会影响纳米粒的包封率以及粒径大小。以包封率和粒径为考察指标，设计单因素实验，考察黄芩苷质量浓度、黄芩苷与mPEG-PLGA质量比、去离子水的体积、超声时间、DMSO滴加时间对纳米粒的影响，为后续的Box-Behnken响应面优化实验筛选出因素条件。

2.3.1 黄芩苷质量浓度的考察

固定mPEG-PLGA和黄芩苷的质量比为10∶1，制备质量浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg·mL^-1的黄芩苷溶液，按照2.1项下方法操作，考察黄芩苷质量浓度对纳米粒包封率和粒径的影响。结果见表1。随着黄芩苷质量浓度的升高，纳米粒的包封率表现出先升后降的趋势，粒径则逐渐升高。黄芩苷质量浓度过低会使mPEG-PLGA自身发生自组装的概率增加从而导致药物的包封率过低，而质量浓度过高则容易导致制备过程中纳米粒发生聚沉，影响包封率。因此有必要进一步优化黄芩苷的质量浓度。

2.3.2 mPEG-PLGA与黄芩苷投料比的考察

固定黄芩苷质量浓度为1.5 mg·mL^-1，按照2.1项下方法操作，考察载体与药物不同投料比（4∶1、6∶1、8∶1、10∶1、12∶1）对载药纳米粒包封率和粒径大小的影响。结果见表2。随着载体比例上升包封率也呈现出先升后降的趋势，粒径则逐渐降低，只有合适的比例才有利于mPEG-PLGA包裹药物，因此需要对mPEG-PLGA与黄芩苷的投料比进行优化。

2.3.3 DMSO滴加时间的考察

DMSO中含有大量药物，若加入速度过快，则很容易发生聚沉，固定黄芩苷质量浓度为1.5 mg·mL^-1，mPEG-PLGA和黄芩苷的质量比为10∶1，按照2.1项下方法操作，考察DMSO直接倒入，1、5、10、15 min滴到去离子水中对载药纳米粒包封率和粒径大小的影响。结果见表3。随着滴加时间的增加，包封率逐渐上升，但滴加时间延长至5 min后纳米粒的包封率变化不大，考虑到制备效率，选择5 min作为DMSO的滴加时间。

2.3.4 去离子水体积的考察

去离子水体积的变化决定了有机相和水相比，固定黄芩苷的质量浓度为1.5 mg·mL^-1，mPEG-PLGA和黄芩苷的质量比为10∶1，按照2.1项下方法操作，考察不同体积（10、20、30、40 mL）去离子水对载药纳米粒包封率和粒径大小的影响。结果见表4。水相体积的增加会导致纳米粒的包封率和粒径均降低，其原因可能是随着水相体积的增加，会使各个物料的整体浓度降低，减弱了它们之间的相互作用力，影响纳米粒的自组装，导致包封率降低。粒径在去离子水体积超过30 mL后变化不大，但有必要进一步优化。

2.3.5 超声时间的考察

固定黄芩苷的质量浓度为1.5 mg·mL^-1，mPEG-PLGA和黄芩苷的质量比为10∶1，去离子水体积为20 mL。按照2.1项下方法操作，考察不同超声粉碎时间（5、8、10、12、15、20 min）对载药纳米粒包封率和粒径大小的影响。结果见表5。随着超声时间的延长，包封率呈先升后降的趋势，而粒径大小则呈先降后升的趋势。超声时间过长可能会促进药物进入水相，也可能会破坏纳米粒，最终导致包封率降低，同时还会引起纳米粒的融合和聚集^［24］，使纳米粒的粒径变大，综合考虑后选用10 min作为超声时间。

2.3.6 Box-Behnken响应面法优制备工艺

Box-Behnken响应面法适用于工艺优化，可以同时考虑多个因素的影响，可通过较少的实验确定最佳的工艺条件^［25］。以单因素考察结果为依据，选取黄芩苷质量浓度、mPEG-PLGA与黄芩苷投料比、去离子水体积作为考察因素，进行3因素3水平Box-Behnken实验设计。见表6、表7。

运用Design Expert 13软件进行二元回归模型的拟合和优化，经数据拟合后得到响应方程。Y₁=89.98+3.05X₁+0.407 5X₂-4.16X₃+0.332 5X₁X₂-

0.757 5X₁X₃-0.932 5X₂X₃-2.92X{}_{\mathrm{1}}^{\mathrm{2}}-3.02X{}_{\mathrm{2}}^{\mathrm{2}}-1.91X{}_{\mathrm{3}}^{\mathrm{2}}

（R²=0.950 9，R{}_{\mathrm{a}\mathrm{d}\mathrm{j}}^{\mathrm{2}}=0.887 0）；Y₂=121.22+26.63X₁-

12.81 X₂-27.46X₃+5.8X₁X₂+8.7X₁X₃-0.725X₂X₃+

33.08X{}_{\mathrm{1}}^{\mathrm{2}}+10.1X{}_{\mathrm{2}}^{\mathrm{2}}+16.35X{}_{\mathrm{3}}^{\mathrm{2}}（R²=0.987 7，R_adj²=0.971 8）。

软件模拟出的包封率和粒径方差分析结果见表8、表9，回归模型拟合图见图1。2种模型的方差均大于0.95，P小于0.05（显著），且失拟项的P值大于0.05（不显著），表明该2次多项回归模型较为准确，干扰小且可信度高，能够很好地反映Y₁、Y₂和X₁、X₂、X₃之间的关系。

基于两种回归模型对两个评价指标的三维效应面图和二维等高线图见图2、图3。预测的BAI mPEG-PLGA NPs最佳制备工艺为黄芩苷质量浓度为1.49 mg·mL^-1、mPEG-PLGA与黄芩苷投料比为10.5∶1、去离子水体积为19 mL。包封率为90.25%，粒径为121.1 nm。

2.3.7 最佳处方工艺的验证

由上述实验得到的BAI mPEG-PLGA NPs的最佳制备工艺为黄芩苷质量浓度为1.49 mg·mL^-1，mPEG-PLGA与黄芩苷投料比为10.5∶1，DMSO滴加时间为5 min，去离子水体积为20 mL，超声时间为10 min。根据上述最佳工艺处方制备3组纳米粒，测定其包封率和粒径，计算包封率、粒径实际值和预测值之间的偏差，以验证模型是否准确。偏差＝（预测值-实际值）/预测值。结果见表10。BAI mPEG-PLGA NPs包封率和粒径的相对偏差均小于\pm5%，表明采用Box-Behnken响应面法优化BAI mPEG-PLGA NPs的工艺处方结果可靠，具有很高的重复性。

2.4 BAI mPEG-PLGA NPs粒径及外观形态的表征

使用马尔文激光散射粒度测定仪测定纳米粒的粒径分布、Zeta电位及多分散系数（polydispersity index，PDI）。使用高分辨率透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）观察BAI mPEG-PLGA NPs的外观形貌。粒径、电位结果见图4。粒径为50~290 nm，平均粒径为（120.1\pm6.2） nm，Zeta电位为（-11.10±1.84） mV，PDI为（0.093±0.014）。表明制备出的纳米粒形态均一，稳定性好。TEM结果见图5。外观呈圆球形或类圆球形，纳米粒之间没有相互粘连，粒径约为80 nm。TEM观察到的粒径较粒度仪测得的粒径要小一些，这是由于粒度仪测得的粒径为纳米粒的水合粒径，在水溶液中纳米粒会吸水膨胀而导致粒径变大，而TEM测试前要将纳米粒置于铜网上烘干，测得的是干燥纳米粒的粒径。

2.5 BAI mPEG-PLGA NPs稳定性的考察

将分散好的纳米粒溶液置于25 ℃条件下，于1~7 d内每日取样，观察BAI mPEG-PLGA NPs粒径的变化和PDI，以考察纳米粒的稳定性。见图6。由图6可见，纳米粒的粒径在110~150 nm范围内相对稳定，其PDI值变化也较小，基本保持在0.2以下，表明黄芩苷-mPEG-PLGA纳米粒在7 d内具有良好的稳定性。

2.6 BAI mPEG-PLGA NPs体外释放行为的考察

通过动态透析法来考察黄芩苷-mPEG-PLGA纳米粒中黄芩苷的体外释放行为。取10 mg冻干后的纳米粒，超声溶解分散后转移到透析袋（截留相对分子质量为3 500）中，以人工唾液作为释放介质，置于恒温摇床（37 ℃，150 r·min^-1）中，后续在提前设计好的时间点吸取释放介质3 mL，同时补加等体积新的释放介质。最后使用紫外分光光度计测定3 mL释放介质中黄芩苷的含量，计算药物累计释放率（Q），以黄芩苷原药作为空白对照，每组样品重复测定3次，取平均值。Q（%）=\frac{V_{\mathrm{0}}{C}_{\mathrm{n}}+V_{\mathrm{i}}{\sum }_{i=\mathrm{1}}^{n-\mathrm{1}}{C}_i}{m_{\mathrm{d}\mathrm{r}\mathrm{u}\mathrm{g}}}×100%。其中V₀代表离心管中溶液的总体积：V_i 代表在t_i 取样的释放介质的体积；C_n 和C_i 代表时间t_n 和t_i 的药物浓度；m_drug代表纳米粒中黄芩苷的总含量。见图8。由图8可见，黄芩苷空白溶液药物释放迅速，可在4 h内释放92%左右；而BAI mPEG-PLGA NPs在4 h内的累计释放率只有51.3%，最后在72 h的累计释率放达到75.4%。这是由于释放初期PEG-PLGA的大量降解以及少量吸附在纳米粒表面药物的解离导致前期释放较快，但随着时间推移逐渐趋于平稳，由此可见，与黄芩苷空白溶液比较，BAI mPEG-PLGA NPs具有一定的缓释效果。

2.7 BAI mPEG-PLGA NPs的细胞毒性实验

将密度为5×10⁴个·mL^-1的人牙龈成纤维细胞悬液（HGnF）以每孔100 μL接种到96孔板中（即每孔5 000个细胞），留6个孔不接种细胞作为空白组，放入细胞培养箱中孵育24 h使其完全贴壁。孵育完成后，将每孔中的培养基吸出，分别加入100 μL完全培养基作为对照组，分别取100 μL质量浓度为100、200 μg·mL⁻¹的黄芩苷溶液，以及等当量的黄芩苷-mPEG-PLGA纳米粒溶液，作为样品组。每组设置6个复孔。将各96孔板放入培养箱中分别避光孵育24、48、72 h。用PBS清洗2~3次，向各组孔中加入100 μL体积分数10%的CCK-8溶液，避光孵育2 h，采用酶标仪测定各组在450 nm处的吸光度值，计算细胞存活率。细胞存活率=［（A_样品组-A_空白组）/（A_对照组-A_空白组）］×100%。采用SPSS软件进行T检验分析各组间的差异性。见图8。

由图8可见，随着时间的增加，经黄芩苷原料药和黄芩苷纳米粒处理细胞的存活率均有不同程度的下降，但经黄芩苷原料药处理细胞存活率下降的程度更大，在3 d后细胞存活率分别降低到了41.4%、31.7%，而经黄芩苷纳米粒处理细胞的存活率则只降到82.3%、70.2%，细胞仍具有良好的活性，这是由于黄芩苷纳米粒具备缓释作用以及mPEG-PLGA的高生物相容性，这与体外释放的结果具有一致性。该结果表明本研究所制备的BAI mPEG-PLGA NPs可在一定程度上降低黄芩苷的毒性。

3 讨论

自组装技术是利用了分子间相互作用力，如静电力、范德华力、氢键等，通过自组装纳米结构单元，使分子成为一种多级有序的结构^［26］。黄芩苷属于小分子，具有很强的疏水性，而mPEG-PLGA中的PLGA内核具有良好的亲脂性，恰好可以借助自组装技术将黄芩苷高效包裹在疏水性内核PLGA中。PEG外核具有良好的水溶性和生物相容性，可以减少免疫系统对其特异性的识别，加之其为大分子材料，不易被肾小球所滤过，故而可以实现体内长循环，从而延长黄芩苷的作用时间^［27］，提高黄芩苷的溶解度及生物利用率。

本实验采用超声辅助自组装的方法制备了BAI mPEG-PLGA NPs，并通过单因素考察，采用Box-Behnken响应面法对黄芩苷质量浓度、mPEG-PLGA与黄芩苷投料比、去离子水体积这三个重要影响因素进行了优化，用粒度检测仪以及TEM对其形貌进行表征，最终确定了高效的黄芩苷纳米粒制备工艺，能够制备出包封率更高、粒径更小、分布更均匀且稳定性和生物相容性良好的黄芩苷纳米粒。较高的包封率可以减少药物损耗，降低成本；较小的粒径可以增加纳米粒与口腔组织的接触面积，促进药物的吸收和分布；均匀的粒径分布则保证了药物制剂的质量稳定性。该工艺操作简单，制备条件温和，具有很好的重复性，简便、快速、绿色的优势适合大规模生产，这对于提高黄芩苷的生物利用度、增强其疗效具有重要的意义。尽管本次研究在黄芩苷纳米粒制备工艺优化方面取得了一定成果，但是由于口腔内的环境较为复杂，对于纳米粒的体内行为和药效药动学机制还需要更深入的研究。

综上所述，本研究成功构建了绿色、方便的纳米递药系统以及制备工艺，经过进一步优化和表征，制备出的纳米粒具有高包封率、低粒径、缓释、低毒等优势，后续需开展动物实验和临床研究，进一步验证BAI mPEG-PLGA NPs在口腔疾病治疗中的安全性和有效性。

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