基于人永生化表皮细胞膜色谱模型筛选康艾注射液中的组胺类似物

Screening histamine analogues from Kang’ai Injections based on HaCaT cells membrane chromatography

摘要

目的 筛选康艾注射液中的组胺类似物，为其致敏机制研究及质量控制提供理论依据。 方法 构建人永生化表皮细胞/细胞膜色谱（human immortalized epidermal cell/cell membrane chromatography， HaCaT/CMC）模型，将其与高效液相色谱/质谱（high-performance liquid chromatography/mass spectrometry， HPLC/MS）联合使用，建立HaCaT/CMC-online-HPLC/MS二维在线联用系统，靶向筛选康艾注射液中的H₁受体（H₁ receptor， H₁R）激活物。验证HaCaT细胞膜上H₁R的表达及二维联用系统的可靠性，通过噻唑蓝［3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2， 5-diphenyltetrazolium bromide， MTT］比色法、酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA）和Ca²⁺流实验，对潜在活性组分激活组胺受体的作用进行初步分析。 结果 利用HaCaT/CMC-online-HPLC/MS二维联用系统，成功鉴定出康艾注射液中的组胺类似物为氧化苦参碱；Ca²⁺流实验和ELISA结果显示，随着氧化苦参碱给药质量浓度的升高，细胞内Ca²⁺和三磷酸肌醇（inositol 1，4，5-trisphosphate， IP₃）浓度呈升高趋势。 结论 HaCaT/CMC-online-HPLC/MS二维联用系统为中药注射剂等复杂体系中目标组分的筛选提供了新模型与新方法。

Abstract

Objective To screen histamine analogues in Kang’ai Injection therefore to provide a theoretical basis for the research on their sensitization mechanism and quality control. Methods A human immortalized epidermal /cell membrane chromatography （HaCaT/CMC） model was established and integrated with high-performance liquid chromatography/mass spectrometry （HPLC/MS） to form a two-dimensional hyphenated system for targeted screening of H₁ receptor （H₁R） activators in Kang’ai Injections. H₁R expression on HaCaT cell membranes and the performance of the two-dimensional hyphenated system were validated. The effects of potential active components on histamine receptor activation were preliminarily analyzed using 3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide （MTT） assay， enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）， and intracellular Ca²⁺ flux measurements. Results Combined with the two-dimensional coupled system of HaCaT/CMC-online-HPLC/MS， histamine analogues in Kang’ai Injections were successfully identified as oxymatrine.The results of Ca²⁺ influx assay and ELISA assay showed that the intracellular Ca²⁺ and inositol 1，4，5-trisphosphate （IP₃） levels increased in a concentration-dependent manner with the rise of oxymatrine administration concentration. Conclusion The HaCaT/CMC-online-HPLC/MS system provides novel models and methodologies for screening target components in complex systems such as traditional Chinese medicine injections.

Graphical abstract

关键词

康艾注射液 / 组胺类似物 / 人永生化表皮细胞膜色谱在线联用高效液相色谱/质谱法 / H₁受体 / 氧化苦参碱

Key words

Kang’ai Injections / histamine analogs / human immortalized epidermal/cell membrane chromatography-online-high-performance liquid chromatography/mass spectrometry / H₁ receptor （H₁R） / oxymatrine

中药注射剂为我国特有剂型，临床应用广泛且疗效确切，其发展对推动中药现代化、完善我国社会医疗体系具有重要意义，是我国医药行业的重要组成部分。随着社会经济的发展，中药注射液不仅在国内市场占据重要地位，在国际市场开拓中亦具有巨大潜力和广阔前景^［1-2］。然而，中药注射剂不良反应事件频发，此类不良反应多由肥大细胞和/或嗜碱性粒细胞释放组胺引发，可导致患者出现皮肤红肿、瘙痒、湿疹、过敏性休克等症状甚至死亡^［3-5］。因此，筛选中药注射剂中可激活组胺受体的成分，对其安全性评价具有重要学术价值与应用意义^［6］。

截至目前，在组胺的4种受体中，H₁R发现最早、研究最为深入，且是引发不良反应较多的受体类型^［7-8］。为利用细胞膜色谱（cell membrane chromatography，CMC）技术筛选H₁R受体激动剂，Guo Y等^［9-10］已构建H₁R高表达细胞，并用该细胞制备H₁R/CMC柱，应用该细胞膜色谱柱成功筛选并鉴定高三尖杉酯碱注射液、鱼金注射液中的致敏组分分别为高三尖杉酯碱、鱼腥草素钠，且对其致敏机制进行了研究。人永生化表皮（human immortalized epidermal，HaCaT）细胞是H₁R高表达的人体细胞，不仅是表皮主要细胞群，还可合成多种参与皮肤免疫应答的细胞因子和趋化因子。当HaCaT细胞表面H₁R被抑制后，IP₃浓度降低，进而导致胞内Ca²⁺浓度降低，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF），白细胞介素-8（interleukin-8，IL-8）和白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）的浓度均显著降低，从而抑制炎症反应的发生^［11］。

CMC由贺浪冲教授团队于1996年提出，是一种生物亲和色谱技术，适用于中药复杂体系中活性成分的筛选和分离，具有快速、高效的特点。近年来，基于不同高表达细胞模型和活体细胞构建的细胞膜色谱系统，已广泛应用于中药及中药复方活性成分的筛选、中药注射剂的安全性评价等方面^［12-18］。康艾注射液主要用于肺癌、原发性肝癌、直肠癌、恶性淋巴瘤、妇科恶性肿瘤的治疗，也可用于由各种原因引起的白细胞减少症及慢性乙型肝炎的治疗，近年来其过敏案例逐年增多^［19-20］。为提升研究的实际价值和临床针对性，本研究选用HaCaT细胞作为H₁R高表达细胞模型，构建CMC系统，靶向筛选康艾注射液中的组胺类似物。

1 仪器与材料

1.1 仪器

TDL80-2b型台式电动离心机（上海安亭科学仪器厂）；RPL-ZD10型装柱机（大连日普利科技有限公司）；HC-3018R型高速冷冻离心机（科大创新股份有限公司中佳分公司）；高效液相色谱-质谱联用仪（日本岛津制作所），配置LC-20AD型色谱泵、SIL-20A型自动进样器、DGU-20A₃型脱气机、SPD-M20A型二极管阵列检测器、CTO-20A型柱温箱、SPD-20A型紫外检测器、LC solution型工作站、LCMS 2010EV型质谱仪。

1.2 试药

二辛可宁酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量试剂盒（批号2018E0DP1511，北京普利莱基因技术有限公司）；H₁R标记山羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）（H+L）（批号D111018-0001）、Cy3标记亲和纯化山羊抗兔IgG（H+L）（批号F111016-0015），均购自美国Jackson Immuno Research Laboratories公司；人IP₃ ELISA试剂盒（批号SAB4600389，武汉华美生物工程有限公司）；康艾注射液（批号02240707，洛阳恩济医院旗舰店）；氧化苦参碱对照品（批号110780-201911，质量分数≥99.50%）、尼群地平（批号100585-201705，质量分数≥99.5%）、盐酸坦索罗辛（批号130441-201905，质量分数≥98%），均购自中国药品生物制品检定所；盐酸茶苯海明（批号B27979，质量分数≥98%，成都曼斯特生物科技有限公司）；吉非替尼（批号140401，质量分数≥99.2%，南京安格制药有限公司）。

1.3 细胞

HaCaT细胞购自上海复祥生物科技有限公司。

2 方法

2.1 Western blotting检测HaCaT细胞上H₁R的表达水平

提取HaCaT细胞及人胚肾细胞293（human embryonic kidney 293，HEK293）总蛋白，采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定总蛋白浓度。通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分离蛋白样品，随后转移至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride membrane，PVDF）。用质量分数5%脱脂奶粉封闭PVDF，封闭时间不少于2 h。向封闭后的PVDF膜中加入2 mL一抗，排除溶液气泡后，用封口机封口，置于4 ℃冰箱中孵育过夜。用含吐温-20的磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline with Tween-20，PBST）洗涤膜后，进行二抗孵育，孵育方法同一抗，需注意加入二抗并排除气泡后，将封闭好的膜夹于两层报纸间避光，置于摇床上慢速振荡孵育2 h。在暗室内采用化学发光法进行发光、显影、定影，收集胶片后用扫描仪录入胶片信息，并完成蛋白定量分析。

2.2 免疫荧光法定位H₁R在HaCaT细胞上的表达

将HaCaT细胞和HEK293细胞接种在盖玻片上，置于6孔板中培养至细胞融合度达60%~70%，用PBST缓冲液清洗后，加入1 mL体积分数4%多聚甲醛固定，再加入1 mL体积分数0.1% Triton X-100进行细胞膜打孔处理。加入1 mL体积分数3%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA），室温封闭1 h。将封口膜铺展在96孔板上，滴加一抗（一抗用含体积分数3% BSA的PBST溶液稀释，anti-H₁R稀释比例为1∶200），将盖玻片细胞面朝下贴于抗体上；孵育结束后，将盖玻片放回6孔板对应孔中，用PBST缓冲液清洗。在另一块铺有封口膜的96孔板上滴加Cy3标记二抗（用体积分数3% BSA稀释，稀释比例为1∶200），孵育方法同一抗。室温避光孵育1 h。PBST缓冲液清洗后，加入1 mL 1∶1 000稀释的4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染液（储液质量浓度为0.1 mg·mL^-1），孵育10 min后用PBST缓冲液清洗。在载玻片正中滴加一滴抗淬灭剂，将盖玻片细胞面朝下盖于抗淬灭剂上，尽量避免产生气泡，晾干后进行封边处理，避光条件下置于荧光显微镜下拍照，观察荧光定位情况。

2.3 HaCaT/CMC细胞膜色谱柱的制备

制备HaCaT细胞膜混悬液，用5 mL注射器将细胞膜混悬液加入预先用1.0 mol·L^-1盐酸溶液处理过的精制硅胶中。取出所得细胞膜固定相混悬液，弃去上清液；再加入生理盐水，在4 ℃条件下以1 500 r·min^-1离心5 min，离心3次，弃去未与硅胶结合的细胞膜碎片。采用湿法装柱法制备HaCaT/CMC细胞膜色谱柱。

2.4 色谱条件

一维色谱条件：色谱柱为HaCaT/CMC柱；流动相为超纯水；流速为0.2 mL·min^-1；检测波长为254 nm；进样量为5 μL；柱温为37 ℃。二维色谱条件：色谱柱为Shim-pack VP-ODS反相柱（150 mm×2.0 mm，5 μm）；流动相为甲醇-5 mmol·L^-1醋酸铵（体积比55∶45）；流速为0.2 mL·min^-1；检测器为SPD M20A二极管阵列检测器及LCMS2010EV型质谱仪。连接装置为Valco十通阀和Shim-pack VP-ODS预柱（10.0 mm×1.0 mm，5 μm）。

2.5 二维联用系统筛选并鉴定康艾注射液中的组胺类似物

采用HaCaT/CMC-online-HPLC/MS二维联用系统分析康艾注射液，一维柱上的保留成分经富集柱和十通切换阀进入二维系统进行分析鉴定，得到HaCaT/CMC柱识别的目标组分。采用保留组分对照品对HaCaT/CMC-online-HPLC/MS在线联用系统的筛选、分析和鉴定结果可靠性进行验证。

2.6 MTT实验测定活细胞的数量

将终密度为5×10⁴个·mL^-1的细胞悬液接种于96孔板中，每孔100 μL，使每孔细胞数量约为5 000个，进行常规培养。加入含已知质量浓度组胺类似物的新鲜含血清培养基，培养24 h后，吸弃孔内培养基，每孔加入100 μL MTT溶液（质量浓度为0.5 mg·mL^-1，用无血清培养基稀释），37 ℃继续培养4~6 h后，吸弃MTT溶液，每孔加入150 μL二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），室温摇床上振荡10~15 min，采用酶标仪在490 nm波长处测定各孔的吸光度值（A），计算细胞抑制率。

抑制率（%）=［1-（A_样品-A_空白）/（A_对照组-A_空白）］×100%

2.7 钙离子/乙酰甲酯荧光探针（fluo-3 acetoxymethyl este，Fluo-3/AM）测定胞质内游离Ca²⁺的浓度

将HaCaT细胞接种到6孔板中，培养至细胞融合度达80%~90%后，用汉克斯平衡盐溶液（Hank’s balanced salt solution，HBSS）清洗并换液，每孔加入4 μmol·L^-1 Fluo-3/AM荧光探针（浓度为200 μmol·L^-1），37 ℃孵育20 min后，加入5倍体积含体积分数1%胎牛血清的HBSS缓冲液，继续培养40 min，随后用羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液（N-2-hydroxyethylpiperazine-N’-2-ethanesulfonic acid，HEPES）洗涤3次。胰酶消化细胞后，以5 000个·孔^-1的细胞密度接种于96孔板中，给药后立即用酶标仪测定荧光强度，连续测定40 min，记录各时间点的荧光强度，绘制荧光强度-时间曲线。

2.8 ELISA法测定IP₃的质量浓度

根据人IP₃ ELISA试剂盒说明书进行实验操作，测定各样本的吸光度值，采用Log it-Log直线回归模式绘制标准曲线，根据标准曲线反算出待测样本的IP₃质量浓度。

3 结果

3.1 Western blotting检测HaCaT细胞上H₁R的表达水平

采用BCA法测得标准蛋白溶液吸光度值，以吸光度值为纵坐标（y）、对应标准蛋白质量浓度为横坐标（x）绘制标准曲线，所得线性方程为y=1.920 9x-0.252 1（R²=0.996 9）。按照每个样品蛋白上样量30 μg，计算样品吸光度值、蛋白质量浓度和上样量。与阴性对照HEK293细胞比较，HaCaT细胞的H₁R蛋白表达量显著升高（约为20.74倍）。见表1、图1。

3.2 H₁R在HaCaT细胞上的表达定位

与阴性对照HEK293细胞比较，H₁R主要表达在HaCaT细胞的细胞膜上。见图2。

3.3 HaCaT细胞膜色谱模型的验证

HaCaT/CMC柱具有良好的柱内及柱间重复性。48 h内盐酸茶苯海明在HaCaT/CMC柱上的保留时间衰减约11.95%（从8.621 min衰减至6.615 min），保留峰面积的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为0.64%。因此，为确保实验过程中HaCaT/CMC柱的生物活性，相关实验需在48 h内完成。通过考察HaCaT/CMC柱对盐酸茶苯海明、尼群地平、吉非替尼、盐酸坦索罗辛4种不同作用靶点对照品的色谱保留行为，评价该柱的选择性，结果显示HaCaT/CMC柱能够选择性识别作用于H₁R的组胺类似物。见表2、图3。

3.4 HaCaT/CMC-online-HPLC/MS系统的验证

细胞膜色谱图上的组分可分为不保留组分R₀和保留组分R，其中R₀组分最先流出系统，R组分出现细胞膜色谱特异峰形。结果显示，R₀组分中分离出尼群地平、吉非替尼和盐酸坦索罗辛，盐酸茶苯海明从R组分中分离出。HaCaT/CMC柱可从4种混合对照品中分离出1种可与其相互作用的物质（盐酸茶苯海明），实现了有效成分的分离和识别，证实该二维系统具有良好的可靠性，可满足实验要求。见图4。

3.5 康艾注射液中组胺类似物的筛选和鉴定

利用HaCaT/CMC-online-HPLC/MS二维系统分析康艾注射液，经二维系统分析鉴定保留组分为氧化苦参碱。为进一步验证HaCaT/CMC-online-HPLC/MS二维联用系统“识别-分离-鉴定”结果的准确性，利用该系统分析氧化苦参碱对照品溶液，结果显示，康艾注射液在二维联用系统中保留组分的色谱行为和氧化苦参碱在二维联用系统中的色谱行为一致。表明康艾注射液在细胞膜色谱上的保留组分为氧化苦参碱。见图5、图6。

3.6 氧化苦参碱致敏作用的初步研究

3.6.1 MTT实验的结果

通过MTT实验考察氧化苦参碱对HaCaT细胞的增殖抑制作用。为保证实验顺利进行，要求给药24 h内氧化苦参碱对HaCaT细胞的抑制率低于20%（即细胞存活率≥80%）。结果表明，当氧化苦参碱给药浓度为0.01、0.10、1.00、10.00、100.00 μmol·L^-1时，对HaCaT细胞的生长几乎无影响；当浓度为500 μmol·L^-1时，对HaCaT细胞的生长有显著抑制作用。因此，后续选择氧化苦参碱给药浓度为0.01、0.10、1.00、10.00、100.00 μmol·L^-1进行后续实验。见图7。

3.6.2 Ca²⁺流实验的结果

随着氧化苦参碱浓度的升高，胞质内Ca²⁺浓度逐渐升高；同时，Ca²⁺浓度随时间延长逐渐升高，达到一定水平后趋于稳定。表明氧化苦参碱可激活H₁R，导致细胞内Ca²⁺浓度升高，且Ca²⁺的释放具有时间依赖性。见图8。

3.6.3 ELISA的结果

ELISA结果显示，随着氧化苦参碱浓度的升高，IP₃质量浓度逐渐升高。见图9。

4 讨论

本研究采用Western blotting和免疫荧光法，验证H₁R在HaCaT细胞中的表达水平和亚细胞定位，证实H₁R在HaCaT细胞膜上呈高表达，符合细胞膜色谱技术的实验应用条件。本研究成功构建HaCaT/CMC-online-HPLC/MS二维在线联用分析系统，以H₁R特异性拮抗剂盐酸茶苯海明为阳性对照，完善HaCaT/CMC色谱柱的系统适应性考察；选取盐酸茶苯海明、尼群地平、吉非替尼、盐酸坦索罗辛4种不同作用靶点的对照品，分析其在该色谱柱上的色谱保留特征，综合评价色谱柱的靶向识别选择性。

4种对照品保留行为考察结果显示，H₁R拮抗剂盐酸茶苯海明在HaCaT/CMC柱上具有显著色谱保留行为，而与H₁R无特异性结合作用的尼群地平、吉非替尼、盐酸坦索罗辛均无明显保留行为，表明HaCaT/CMC柱能够特异性识别H₁R靶向组胺类似物，适用于H₁R介导过敏相关活性组分的筛选研究。基于HaCaT/CMC柱的生物活性特征，通过连续进样盐酸茶苯海明对照品进行稳定性验证，明确该色谱柱的有效使用时间为48 h。

依托所构建的二维联用系统，从康艾注射液中筛选、分离并鉴定得到H₁R靶向组胺类似物为氧化苦参碱，并结合生物学实验初步探讨其致敏活性。实验结果显示，氧化苦参碱可显著诱导Ca²⁺浓度升高；为进一步明确细胞内Ca²⁺升高的调控机制，区分外钙内流与内质网钙释放两种作用途径，设置不同浓度氧化苦参碱干预HaCaT细胞，以30 μmol·L^-1组胺作为阳性对照，ELISA结果证实，氧化苦参碱可激活HaCaT细胞膜表面H₁R，且激活效应随着氧化苦参碱浓度的升高而增强，呈现浓度依赖性，表明氧化苦参碱具备与组胺相似的致敏活性。

本研究成功构建了HaCaT/CMC-online-HPLC/MS二维在线联用系统，并将其应用于中药注射液复杂样品体系分析，有效提升了中药复杂体系中组胺类似物筛选与精准鉴定的效率。同时，本研究完成目标活性组分致敏作用的初步验证，可为后续深入阐释氧化苦参碱致敏分子机制、完善中药注射剂安全性评价与质量控制体系提供实验依据与理论支撑。

参考文献

[1] Zou F， Du Q， Zhang Y，et al.Pseudo-allergic reactions induced by Chinese medicine injections：A review［J］. Chin Med，2023，18（1）：149．

[2] 邓浩伦，曹敏燕，杨丽娥，等.某院2021年脑病科活血化瘀类中药注射剂使用情况分析［J］.西北药学杂志，2024，39（2）：237-240．

[3] Deng Haolun， Cao Minyan， Yang Li’e，et al.Analysis of the use of traditional Chinese medicine injections for promoting blood circulation and removing blood stasis in the encephalopathy department of a hospital in 2021［J］.Northwest Pharmaceutical Journal，2024，39（2）：237-240．

[4] 钟文，王梅，吴晶，等.中药注射剂儿童临床应用的安全性研究［J］.西北药学杂志，2021，36（4）：678-681．

[5] Zhong Wen， Wang Mei， Wu Jing，et al.Study on the safety of traditional Chinese medicine injections in children［J］. Northwest Pharmaceutical Journal，2021，36（4）：678-681．

[6] 沈玉亭.中药注射液的不良反应与临床合理应用研究［J］.中国处方药，2018，16（1）：48-49．

[7] Shen Yuting.Study on adverse reactions of traditional Chinese medicine injection and its rational clinical application［J］. Journal of China Prescription Drug，2018，16（1）：48-49．

[8] 孙悦，范巾杰，闫佩娟，等.中药注射剂的非临床安全性再评价研究进展［J］.药物评价研究，2024，47（6）：1400-1412．

[9] Sun Yue， Fan Jinjie， Yan Peijuan，et al.Progress of non-clinic safety re-evaluation for traditional Chinese medicine injection［J］.Drug Evaluation Research，2024，47（6）：1400-1412．

[10] 朱应成，余静，江玲丽，等.基于多成分定量测定的3种芍药属中药同源异用的内涵阐释［J］.西北药学杂志，2025，40（2）：30-34．

[11] Zhu Yingcheng， Yu Jing， Jiang Lingli，et al. Interpretation of the connotation of homologous dissimilarity among 3 Chinese medicines derived from Paeonia based on multi-component determination［J］.Northwest Pharmaceutical Journal，2025，40（2）：30-34．

[12] Tripathi T， Khan A A， Shahid M，et al. Immunological，biochemical and histopathological evaluation of histamine receptors （H₁R，H₂R，H₃R and H₄R）-antagonist in rabbit experimental model：A short term study［J］. Exp Toxicol Pathol，2012，64（3）：259-266．

[13] Jie Q， Kodithuwakku N D， Yuan X，et al. Anti-allergic and anti-inflammatory properties of a potent histamine H₁ receptor antagonist，desloratadine citrate disodium injection，and its anti-inflammatory mechanism on EA．hy926 endothelial cells［J］. Eur J Pharmacol，2015，754：1-10．

[14] Guo Y， Han S， Cao J，et al.Histamine H1 receptor cell membrane chromatography online high-performance liquid chromatography with mass spectrometry method reveals houttuyfonate as an activator of the histamine H₁ receptor［J］. J Sep Sci，2014，37（21）：3188-3194．

[15] Guo Y， Han S， Cao J，et al.Screening of allergic components mediated by H₁R in homoharringtonine injection through H₁R/CMC-HPLC/MS［J］. Biomed Chromatogr，2014，28（12）：1607-1614．

[16] Yu S C， Chiu W C， Loe P Y，et al.Effects of hydroxysafflor yellow A （HSYA） on UVA-induced damage in HaCaT keratinocytes［J］. Int J Mol Sci，2024，25（14）：7573．

[17] 徐硕，姜文清，邝咏梅，等.细胞膜色谱技术应用于中药活性成分筛选的研究进展［J］.西北药学杂志，2018，33（2）：274-277．

[18] Xu Shuo， Jiang Wenqing， Kuang Yongmei，et al ．Research advances of cell membrane chromatography in screening bioactive components from traditional Chinese medicines［J］.Northwest Pharmaceutical Journal，2018，33（2）：274-277．

[19] 胡琪，解笑瑜，王嗣岑.细胞膜仿生亲和识别技术在中药活性成分筛选中的应用研究进展［J］.药学进展，2023，47（11）：864-874．

[20] Hu Qi， Xie Xiaoyu， Wang Sicen. Advances in research on the application of cell membrane-based bionic affinity recognition technology in screening of bioactive components in traditional Chinese medicines［J］. Progress in Pharmaceutical Sciences，2023，47（11）：864-874．

[21] Shan Y， Lu J， Qian H，et al. Immobilized protein strategies based on cell membrane chromatography and its application in discovering active and toxic substances in traditional Chinese medicine［J］.Pharmacol Res，2024，210：107492．

[22] Fu J， Lü Y， Jia Q，et al.Purification and determination of antibody drugs in bio-samples by EGFR/cell membrane chromatography method［J］. J Pharm Biomed Anal，2022，217：114808．

[23] 付佳，贾倩倩，韩省力，等.基于SNAP-tag-EGFR细胞膜色谱的北豆根中潜在抗肿瘤活性组分筛选及验证［J］.西北药学杂志，2023，38（1）：1-6．

[24] Fu Jia， Jia Qianqian， Han Shengli，et al. Screening and validation of anti-tumor active components from Rhizoma Menispermi based on SNAP-tag-EGFR cell membrane chromatography［J］. Northwest Pharmaceutical Journal，2023，38（1）：1-6．

[25] Ma W， Wang C， Liu R，et al. Advances in cell membrane chromatography［J］. J Chromatogr A，2021，1639：461916．

[26] Lü Y， Wang S， Liang P，et al.Screening and evaluation of anti-SARS-CoV-2 components from Ephedra sinica by ACE2/CMC-HPLC-IT-TOF-MS approach［J］.Anal Bioanal Chem，2021，413（11）：2995-3004．

[27] 张红燕，毕红玉.康艾注射液研究进展［J］.药品评价，2022，19（3）：189-192．

[28] Zhang Hongyan， Bi Hongyu.Research progress of Kang’ai Injection［J］. Drug Evaluation，2022，19（3）：189-192．

[29] Li Q， Chen Q， Zhang Z，et al.Comparative efficacy of Chinese herbal injections for treating endometrial carcinoma：A Bayesian network Meta-analysis［J］.Medicine，2023，102（41）：e34676．

基金资助

国家自然科学基金项目(82273891)