高效分子排阻色谱法测定注射用头孢尼西钠中聚合物的含量及其聚合物结构的推测

Determination of the content of polymers in Cefonicid Sodium for Injection by high-performance size exclusion chromatography method and its polymer structure prediction

摘要

目的 建立高效分子排阻色谱（high performance size exclusion chromatography，HPSEC）法测定注射用头孢尼西钠中聚合物的含量，并采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱（ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS）表征、推测聚合物的化学结构。 方法 采用TSKgel G2000SW_XL色谱柱（300 mm×7.8 mm，5 μm）；以甲醇-体积分数0.005%乙酸铵水溶液（稀氨水调节pH值至7.0）（5∶95）为流动相；流速为0.8 mL·min^-1；柱温为25 ℃；检测波长为214 nm；进样量为20 μL。 结果 头孢尼西主峰与聚合物色谱峰实现基线分离；头孢尼西单体在0.5~1 000.0 µg·mL^-1范围内线性关系良好，相关系数r=0.999 6；检出限为0.002 5 µg·mL^-1，定量限为0.005 µg·mL^-1；样品质量浓度在0.1~2.0 mg·mL^-1范围内与聚合物峰总面积呈良好线性关系。 结论 建立的HPSEC法灵敏度、专属性与耐用性优异，可用于注射用头孢尼西钠中聚合物的含量测定。

Abstract

Objective To establish a high-performance molecular exclusion chromatography （HPSEC） method for the determination of the content of polymers in Cefonicid Sodium for Injection， and characterize and predict the chemical structure of polymers by using ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry （UPLC-Q-TOF-MS）. Methods A TSKgel G2000SW_XL column （300 mm×7.8 mm， 5 μm） was used； the mobile phase consisted of methanol and a water solution containing 0.005% ammonium acetate （pH adjusted to 7.0 with dilute ammonia） in a ratio of 5∶95； flow rate was 0.8 mL·min^-1； column temperature was 25 ℃； detection wavelength was 214 nm； and injection volume was 20 μL. Results The main peak of cefenamicin was baseline separated from the polymer chromatographic peak； the cefenamicin monomer exhibited a good linear relationship within the concentration range of 0.5~1 000.0 µg·mL^-1， with a correlation coefficient r=0.999 6； the limit of detection was 0.002 5 µg·mL^-1 and the limit of quantification was 0.005 µg·mL^-1； within the sample concentration range of 0.1~2.0 mg·mL^-1， there was a strong linear relationship between sample concentration and the total area of the polymer peak. Conclusion The HPSEC method showed excellent sensitivity， specificity and durability， which is suitable for the determination of the content of polymers in Cefonicid Sodium for Injection.

Graphical abstract

关键词

注射用头孢尼西钠 / 聚合物 / 高效分子排阻色谱 / 超高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱

Key words

Cefonicid Sodium for Injection / polymer / high-performance molecular exclusion chromatography / ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry

头孢尼西钠分子式为C₁₈H₁₆N₆Na₂O₈S₃，属于β-内酰胺类头孢菌素抗生素^［1］。头孢尼西钠通过抑制细菌细胞壁的合成发挥抗菌活性，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌以及部分厌氧菌均具有抗菌作用^［2］，临床用于敏感菌引起的感染的治疗与外科手术围手术期感染的预防^［3］。β-内酰胺类抗生素最突出的安全风险为药物过敏性不良反应，现有研究证实致敏原并非药物单体，而是药物中高分子聚合物杂质^［4］。头孢尼西钠结构式见图1。

目前，头孢类抗菌药聚合物常用的检测手段有葡聚糖凝胶G-10分子排阻色谱法（Sephadex G-10 size exclusion chromatography，Sephadex G-10 SEC）、高效分子排阻色谱法（high performance size exclusion chromatography，HPSEC）及反相高效液相色谱法（reversed phase-high performance liquid chromatography，RP-HPLC）。《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）（2020版）二部收载注射用头孢尼西钠的聚合物检查采用Sephadex G-10 SEC法，但该方法灵敏度偏低、分析时间长、主成分易过载，导致色谱柱效能逐渐下降^［5］。RP-HPLC法仅可针对性测定二聚体等特定聚合物，无法检出高聚合物杂质，方法通用性较差^［6］。HPSEC法具有柱效高、无样品过载、可同步检出二聚体及多聚体杂质等优势，适用范围更广，已有研究将其应用于头孢克肟颗粒、头孢克洛分散片、头孢丙烯干混悬剂的聚合物检查^［7-9］。

本研究建立HPSEC法定量测定注射用头孢尼西钠中的聚合物杂质，并依托超高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱（ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS）技术对主要聚合物杂质峰进行结构推导。

1 仪器与试药

1.1 仪器

U3000型高效液相色谱仪（美国Thermo Fisher公司）；UPLC-Xevo G2-QTOF型超高效液相色谱-电喷雾四极杆飞行时间串联质谱仪（美国Waters公司）；XPR225型电子天平、S220-K多参数测试仪（pH计），均购自瑞士Mettler Toledo公司。

1.2 试药

头孢尼西对照品（批号130571-201902，质量分数为86.9%，中国食品药品检定研究院）；注射用头孢尼西钠（批号分别为23010831、23011031、23043031、23091531、23111031、23122031，A公司）；甲醇（色谱纯，国药集团化学试剂有限公司）；超纯水为实验室自制。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与质谱条件

2.1.1 色谱条件

采用TSKgel G2000 SW_XL（300 mm×7.8 mm，5 μm）色谱柱；以甲醇-体积分数0.005%乙酸铵溶液（用稀氨水调节溶液pH值至7.0）（5∶95）为流动相；流速为0.8 mL·min^-1；柱温为25 ℃；检测波长为214 nm；进样体积为20 μL。

2.1.2 质谱条件

采用电喷雾离子（electrospray ion，ESI）源；毛细管电压为3.0 kV；锥孔电压为15 V；离子源温度为150 ℃；脱溶剂气温度为500 ℃；脱溶剂气流速为800 L·h^-1；锥孔气流速为50 L·h^-1。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品储备液

取头孢尼西对照品适量，精密称定，置于50 mL量瓶中，用超纯水稀释，定容至刻度，配制成质量浓度为1 mg·mL^-1的头孢尼西对照品储备液。

2.2.2 对照品溶液

精密量取对照品储备液1 mL，置于100 mL量瓶中，用超纯水稀释，定容至刻度，配制成质量浓度为10 µg·mL^-1的头孢尼西对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液

取注射用头孢尼西钠样品适量，精密称定，置于100 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，制成含头孢尼西1 mg·mL^-1的溶液。

2.3 专属性实验

2.3.1 溶剂与辅料干扰实验

按照2.2.3项下方法制备辅料溶液，分别取辅料溶液、空白溶剂、供试品溶液，按照2.1.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图。见图2。依据分子排阻色谱分离原理，聚合物杂质色谱峰出峰位置位于药物单体主峰前。结果显示，药物单体主峰与各聚合物峰基线分离，辅料和空白溶剂在聚合物出峰区域无干扰峰，不影响聚合物定量分析。

2.3.2 破坏性实验

取供试品溶液分别开展酸、碱、高温、氧化、光照强制破坏实验。

2.3.2.1 酸破坏

取10 mL供试品溶液，加0.1 mol·L^-1盐酸溶液1 mL，室温放置30 min后碱液中和。

2.3.2.2 碱降解

取10 mL供试品溶液，加0.1 mol·L^-1氢氧化钠溶液1 mL，室温放置30 min后加酸液中和。

2.3.2.3 高温降解

取10 mL供试品溶液，于60 ℃水浴加热1 h。

2.3.2.4 氧化降解

取10 mL供试品溶液，加体积分数为5%双氧水溶液1 mL，室温静置30 min。

2.3.2.5 光照降解

取10 mL供试品溶液，置于紫外光灯（254 nm）下照射24 h。各破坏后样品溶液按照2.1.1项下色谱条件进样分析，记录色谱图。见图3。结果显示，各降解产物色谱峰与聚合物峰、主峰均实现基线分离，不干扰聚合物含量测定。

2.3.3 聚合物1质谱结构解析

采用UPLC-Q-TOF-MS，按照2.1项下色谱条件与质谱条件，对2.2.3项下供试品溶液中聚合物进行解析。为规避高浓度单体污染质谱，程序切换将主峰及后续组分切入废液，仅收集主峰前聚合物组分。因其他聚合物含量偏低，基质干扰严重，故选取含量最高的聚合物1开展结构推导。

正离子模式下测得m/z 906［M+NH₄］⁺、m/z 889 ［M+H］⁺；负离子模式测得m/z 887 ［M－H］^－，确定聚合物1的相对分子质量为888。结合相对分子质量及头孢菌素降解聚合规律^［10］，推测该杂质为两分子头孢尼西发生分子间聚合，脱去1分子水和1分子5-巯基-1-磺酸甲基四唑（5-mercapto-1-sulfomethyltetrazole，3-TSA），伴随一处含氮四元环开环并结合1分子水形成的二聚体。

对m/z 906进行二级碎片扫描，二级质谱图存在的碎片m/z 693为母核脱去1分子3-TSA，m/z 321为单分子头孢尼西脱去1分子3-TSA片段；对负离子母离子m/z 887进行二级碎片扫描，二级质谱图存在的m/z 843为母核脱去1分子羧基，m/z 195为3-TSA特征碎片，佐证上述结构推测。见图4。

2.4 线性关系考察

2.4.1 头孢尼西单体

精密量取2.2.1项下对照品储备液适量，逐级稀释，配制成质量浓度分别为0.5、1.0、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0、200.0、500.0、1 000.0 µg·mL^-1的系列对照品溶液，按照2.1.1项下色谱条件进样测定。以对照品溶液质量浓度为横坐标（x），峰面积为纵坐标（y），进行线性回归。得线性方程为y=37.998x+212.405，相关系数（r）=0.999 6，在0.5~1 000.0 µg·mL^-1范围内线性关系良好。

2.4.2 聚合物

取注射用头孢尼西钠（批号23043031）样品适量，精密称定，配制成质量浓度分别为0.1、0.2、0.4、0.8、1.2、1.5、2.0 mg·mL^-1的梯度样品溶液，按照2.1.1项下色谱条件进样分析。以头孢尼西的质量浓度为横坐标（x），所有聚合物的峰面积总和为纵坐标（y），进行线性回归。得线性方程为y=331.516x+5.724，相关系数（r）=0.999 8，样品质量浓度在0.1~2.0 mg·mL^-1范围内与聚合物峰面积总和的线性关系良好。

2.5 定量限与检出限

逐级稀释2.2.1项下对照品储备液，按照2.1.1项下色谱条件进样分析，以主峰信噪比约为10确定定量限，信噪比为3确定检出限。结果显示，头孢尼西定量限为0.005 µg·mL^-1，检出限为0.002 5 µg·mL^-1。

2.6 精密度实验

取2.2.2项下对照品溶液，按照2.1.1项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积。结果显示，头孢尼西峰面积相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）值为0.6%，表明仪器的精密度良好。

2.7 重复性实验

称取注射用头孢尼西钠（批号23043031）样品适量，按照2.2.3项下方法平行制备6份供试品溶液，以2.2.2项下对照品溶液为对照，分别按照2.1.1项下色谱条件进样分析，外标法计算聚合物的含量。结果显示，聚合物平均含量为0.9%，RSD为0.7%，表明该方法的重复性良好。

2.8 耐用性实验

2.8.1 柱温

分别在20、25、30 ℃柱温条件下进行实验，结果显示，柱温小幅变化不改变峰形和分离效果，因此选择柱温为25 ℃。

2.8.2 流速

分别考察流速为0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL·mL^-1，结果显示，低流速下出峰延后但分离度无明显变化；当流速升至0.9 mL·mL^-1时，主峰与聚合物峰的分离度显著降低，因此确定流速为0.8 mL·mL^-1。

2.8.3 溶液稳定性

按照2.2.3项下方法平行制备2份供试品溶液，1份在室温（25 ℃）放置，另1份冷藏（4 ℃）放置，分别于0、2、4、6、8、12、18、24 h，按照2.1.1项下色谱条件进样分析。结果显示，在室温（25 ℃）放置过程中，主峰峰面积逐渐下降，聚合物峰面积之和逐渐升高；冷藏（4 ℃）放置24 h，主峰峰面积和聚合物峰面积之和均无明显波动。表明供试品溶液在室温条件下放置易发生聚合降解，需现用现配。

2.9 样品含量的测定

6批次注射用头孢尼西钠各平行称取3份，按照2.2.3项下方法制备供试品溶液，取2.2.2项下对照品溶液作为对照，按照2.1.1项下色谱条件进样分析，记录峰面积。采用不加校正因子主成分自身对照外标法计算聚合物含量；同时根据《中国药典》（2020年版）二部标准，采用Sephadex G-10 SEC法测定聚合物的含量。见表1。

3 讨论

3.1 检测波长的筛选

供试品溶液全波长扫描结果显示，头孢尼西单体及其聚合物杂质在214 nm波长处紫外吸收强度最优，因此选择214 nm作为检测波长。

3.2 2种检测方法的对比分析

样品测定结果显示，HPSEC法测得聚合物含量显著高于《中国药典》（2020年版）中Sephadex G-10 SEC法。结合实验结果与文献^［11］分析，传统Sephadex G-10 SEC法无法检出二聚体杂质，仅能检出高聚合度大分子杂质，聚合物杂质检出覆盖面不全，导致结果偏低。

已有文献^［12］报道HPSEC法用于头孢尼西钠聚合物检测，但并未对聚合物结构进行分析，且色谱体系、出峰数量与本文实验条件存在明显区别；本文在建立定量方法的基础上依托UPLC-Q-TOF-MS完成主要聚合物二聚体的结构推定。受质谱技术局限，仅可初步推断单一杂质骨架，后续可联合核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）等手段完成结构确证。

本研究建立的HPSEC方法简单快速、灵敏度与准确度优异，可全面检出二聚体及多聚体杂质，更适用于注射用头孢尼西钠中高分子聚合物的质量控制，从源头降低高分子杂质诱发药物过敏的用药风险。

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基金资助

2024年泰州市科技支撑计划（社会发展）指令性项目(TS202434)