淫羊藿苷通过抑制丝裂原活化蛋白激酶1/细胞髓细胞瘤病毒癌基因通路改善 β 淀粉样蛋白诱导的PC12细胞凋亡

Icariin ameliorates β -amyloid protein-induced apoptosis in PC12 cells by inhibiting the mitogen-activated protein kinase 1/cellular myelocytomatosis viral oncogene pathway

摘要

目的 探讨淫羊藿苷（icariin，ICA）改善由β淀粉样蛋白（β-amyloid protein，Aβ）诱导的神经元细胞凋亡的作用机制。 方法 将PC12细胞分为对照组、Aβ_25-35组（20 μmol·L^-1 Aβ_25-35处理PC12细胞）、ICA低剂量（ICA low dose，ICA-L）组（5 μmol·L^-1 ICA处理PC12细胞）、ICA中剂量（ICA middle dose，ICA-M）组（10 μmol·L^-1 ICA处理PC12细胞）、ICA高剂量（ICA high dose，ICA-H）组（20 μmol·L^-1 ICA处理PC12细胞）。ICA干预组分别给予相应浓度药物预保护2 h后，再给予20 μmol·L^-1 Aβ_25-35损伤处理24 h，建立阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）细胞模型。采用细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）法检测各组细胞活力，末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling，TUNEL）法检测各组细胞凋亡，JC-1法检测各组细胞线粒体膜电位，活性氧（reactive oxygen species，ROS）试剂盒检测各组细胞ROS水平。通过生物信息学和网络药理学分析，筛选ICA在AD治疗中可能调控的分子靶点。采用蛋白印迹法、实时定量聚合酶链式反应（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）法检测各组细胞中丝裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）、细胞髓细胞瘤病毒癌基因（cellular myelocytomatosis viral oncogene，c-Myc）蛋白和信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）的表达水平。 结果 与对照组比较，Aβ_25-35组的细胞活力、线粒体膜电位水平均显著降低，细胞凋亡率、ROS水平均显著升高（P<0.05）；与Aβ_25-35组比较，ICA以剂量依赖性方式使PC12细胞活力、线粒体膜电位水平均显著升高，细胞凋亡率、ROS水平均显著降低（P<0.05）。生物信息学和网络药理学分析结果显示，MAPK1是ICA、AD以及线粒体损伤相关基因的交集靶点，且和ICA的结合作用较强。与对照组比较，Aβ_25-35组PC12细胞中MAPK1、c-Myc的总蛋白、磷酸化蛋白以及mRNA表达均显著增加（P<0.05）；与Aβ_25-35组比较，ICA以剂量依赖性方式使PC12细胞中MAPK1、c-Myc的总蛋白、磷酸化蛋白及mRNA水平均显著下降（P<0.05）。 结论 ICA干预可显著改善Aβ_25-35诱导的神经元细胞线粒体损伤和凋亡，其保护作用与抑制MAPK1/c-Myc通路有关。

Abstract

Objective To investigate the mechanism by which icariin （ICA） ameliorates amyloid-β （Aβ）-induced neuronal apoptosis. Methods PC12 cells were divided into 5 groups： control group， Aβ_25-35 group （PC12 cells treated with 20 μmol·L^-1 Aβ_25-35）， ICA low-dose （ICA-L） group （5 μmol·L^-1 ICA）， ICA medium-dose （ICA-M） group （10 μmol·L^-1 ICA）， and ICA high-dose （ICA-H） group （20 μmol·L^-1 ICA）. In the ICA intervention groups， cells were pre-treated with the corresponding concentration of ICA for 2 hours， followed by exposure to 20 μmol·L^-1 Aβ_25-35 for 24 hours to establish an Alzheimer's disease （AD） cell model. Cell viability was detected by cell counting kit-8 （CCK-8） assay， apoptosis was assessed by terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling （TUNEL） assay， mitochondrial membrane potential was measured by JC-1 staining， and reactive oxygen species （ROS） levels were determined using a ROS detection kit. Bioinformatics and network pharmacology analyses were performed to screen potential molecular targets of ICA in AD therapy. The protein and messenger RNA （mRNA） expression levels of mitogen-activated protein kinase 1 （MAPK1） and cellular myelocytomatosis viral oncogene （c-Myc） were detected by Western blotting and quantitative polymerase chain reaction （qPCR）， respectively. Results Compared with the control group， the Aβ_25-35 group exhibited significantly decreased cell viability and mitochondrial membrane potential， and significantly increased apoptosis rate and ROS levels （P<0.05）. Compared with the Aβ_25-35 group， ICA treatment dose-dependently increased PC12 cell viability and mitochondrial membrane potential， and decreased apoptosis rate and ROS levels （P<0.05）. Bioinformatics and network pharmacology analyses revealed that MAPK1 was an intersection target among ICA， AD， and mitochondrial injury-related genes， with a strong binding affinity to ICA. Compared with the control group， the Aβ_25-35 group showed significantly increased total protein， phosphorylated protein， and mRNA expression of MAPK1 and c-Myc in PC12 cells （P<0.05）. Compared with the Aβ_25-35 group， ICA treatment dose-dependently decreased the total protein， phosphorylated protein， and mRNA levels of MAPK1 and c-Myc in PC12 cells （P<0.05）. Conclusion ICA intervention significantly ameliorates Aβ_25-35-induced mitochondrial injury and neuronal apoptosis， and its protective effect is associated with the inhibition of the MAPK1/c-Myc pathway.

Graphical abstract

关键词

阿尔茨海默病 / 淫羊藿苷 / β淀粉样蛋白 / PC12细胞 / 线粒体损伤 / 神经元凋亡 / 丝裂原活化蛋白激酶1/细胞髓细胞瘤病毒癌基因通路

Key words

Alzheimer’s disease / icariin / β-amyloid protein / PC12 cells / mitochondrial injury / neuronal apoptosis / mitogen-activated protein kinase 1/cellular myelocytomatosis viral oncogene pathway

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一种常见的中枢神经系统退行性疾病，临床表现为记忆衰退、语言障碍、执行力减弱、睡眠障碍、生活能力下降等症状，起病隐匿，常发生于老年人群^［1］。尽管AD的确切发病机制尚待进一步阐明，但普遍认为其与大量β淀粉样蛋白（β-amyloid protein，Aβ）的聚集以及tau蛋白的过度磷酸化有关^［2］。此外，随着AD病程的进展，神经元线粒体结构逐渐退化并引发功能障碍，加剧记忆功能恶化^［3］。淫羊藿苷（icariin，ICA）是淫羊藿的关键活性成分，具有促进性腺发育、增强骨骼健康、抗炎、调节脂代谢、抑制肿瘤生长、神经保护等多种药理活性^［4］。研究表明，ICA通过下调淀粉样前体蛋白和β-分泌酶1水平，有效减少Aβ蛋白沉积，进而减缓AD的疾病进展，为AD治疗开辟新的研究视角和潜在的治疗策略^［5］。

丝裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1），也被称为细胞外信号调节激酶2（extracellular signal-regulated kinase 2，ERK2），作为MAPK家族的关键成员，在信号转导、细胞增殖、分化等过程中发挥重要作用。有研究显示，miR-132通过抑制MAPK1的表达，可有效抑制海马区诱导型一氧化氮合酶的活性和氧化应激，改善AD模型大鼠的认知功能^［6］。细胞髓细胞瘤病毒癌基因（cellular myelocytomatosis viral oncogene，c-Myc）作为原癌基因，参与调控细胞增殖、周期进程、凋亡及转录活动^［7］。近年来其在AD中的作用也被逐渐发现，有研究发现AD大鼠大脑皮层、海马神经元中c-Myc的表达上调，为AD的治疗提供了新的方向^［8］。此外，研究发现，MAPK1与c-Myc之间存在紧密联系，如在肺癌治疗中通过MAPK1/c-Myc信号轴增强儿茶酚的疗效，且抑制MAPK1活性可减少c-Myc的磷酸化^［9］。同时，Ratan R R等^［10］研究证实，MAPK1作为MAPK信号通路的关键节点，抑制其核易位或阻断其对c-Myc的磷酸化，可进而抑制神经元的铁死亡。基于上述发现，本研究聚焦于MAPK1/c-Myc信号通路在AD神经细胞损伤中的调控机制，采用Aβ_25-35诱导神经元细胞损伤模型，深入探究ICA对神经细胞的保护作用，并探讨其对MAPK1/c-Myc相关信号通路的调控及具体作用机制。

1 仪器与材料

1.1 仪器

CX23型荧光显微镜（日本奥林巴斯公司）；DMI8型倒置荧光显微镜（德国Leica公司）；7500型荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪（美国ABI公司）；HC-3618R型高速冷冻离心机（安徽中科中佳科技有限公司）；PowerPac HC型电泳仪（美国Bio-Rad公司）；NanoDrop-2000c分光光度计（赛默飞世尔科技公司）；Multiskan FC型酶标仪（美国Thermo Fisher公司）。

1.2 试药

淫羊藿苷［质量分数≥98%，批号56779ES60，翌圣生物科技（上海）股份有限公司］；细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）试剂盒（批号CA1210-100，北京索莱宝科技有限公司）；末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling，TUNEL）试剂盒（批号MK1013-100，武汉博士德生化科技有限公司）；线粒体膜电位检测试剂盒（批号C2006）、Trizol试剂盒（批号R0016）、BeyoRT^TM Ⅱ cDNA合成试剂盒（含RNase H，批号D7168S），均购自上海碧云天生物技术有限公司；活性氧（reactive oxygen species，ROS）试剂盒（批号E004-1-1，南京建成生物工程研究所有限公司）；c-Myc抗体（批号PA5-85185）、p-c-Myc抗体（批号PA5-36673）、山羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG，批号31460），均购自赛默飞世尔公司；MAPK1抗体（批号PACO21762）、p-MAPK1抗体（批号MAB1463），均购自武汉艾美捷科技有限公司；Aβ_25-35（批号EY0861K，上海一研生物科技有限公司）；qPCR引物序列由上海吉玛制药技术有限公司合成。

1.3 细胞

经短串联重复序列（short tandem repeat，STR）鉴定后的PC12细胞（批号CX0062），购自武汉博士德生物工程有限公司。

2 方法

2.1 细胞培养与分组

将PC12细胞置于含有体积分数5%胎牛血清的RPMI1640培养基中，在37 ℃、含体积分数5% CO₂培养箱中培养，每2~3 d更换一次培养液，待细胞融合度达到70%~80%时进行消化传代。将PC12细胞分为5组：对照组、Aβ_25-35组、ICA低剂量（ICA low dose，ICA-L）组、ICA中剂量（ICA middle dose，ICA-M）组、ICA高剂量（ICA high dose，ICA-H）组。对照组不做任何处理；Aβ_25-35组加入20 μmol·L^-1 Aβ_25-35损伤细胞24 h；ICA-L、ICA-M、ICA-H组分别加入相应浓度的ICA（5、10、20 μmol·L^-1）处理2 h，再加入20 μmol·L^-1 Aβ_25-35损伤细胞24 h^［11］。

2.2 CCK-8法检测细胞活力

取处于对数生长期的各组细胞，以1×10⁴个·孔^-1的密度接种到96孔板中，每组设3个复孔，培养24 h，加入10 µL稀释后的CCK-8溶液，孵育4 h。采用酶标仪在450 nm波长处测定吸光度（A）值。细胞活力（%）=［（A_实验孔-A_空白孔）/（A_对照孔-A_空白孔）］×100%。其中，对照孔中为对照组细胞，空白孔中为不含细胞的培养基，实验孔为各处理组细胞。

2.3 TUNEL法检测细胞凋亡

细胞涂片用体积分数4%多聚甲醛在室温下固定30 min，依次用0.01 mol·L^-1 磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline，PBS）和蒸馏水分别洗涤2次，每次2 min。每片加入20 μL缓冲液，按每张切片取TdT和BIO-d-UTP各1 μL，加入18 μL标记缓冲液，混匀后去除缓冲液，每片加20 μL标记液，在37 ℃条件下孵育2 h。用0.01 mol·L^-1 Tris缓冲盐溶液（Tris-buffered saline，TBS）洗涤3次，每次2 min；每片加50 μL封闭液，室温孵育30 min后去除封闭液。取链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物（streptavidin-biotin complex，SABC）试剂适量，按试剂盒说明书稀释为工作液，混匀后每片加50 μL，室温孵育30 min。洗涤后用4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色液轻度复染，蒸馏水冲洗。封片后，采用荧光显微镜观察细胞凋亡情况。细胞凋亡率（%）=（绿色荧光标记细胞数量/细胞总数量）×100%。

2.4 JC-1法检测线粒体膜电位

收集处于对数生长期的各组PC12细胞，用PBS洗涤后加入1 mL细胞培养液，再加入1 mL JC-1染色工作液，混匀后于37 ℃孵育20 min。之后用JC-1（1×）染色缓冲液洗涤，加入2 mL细胞培养液，在荧光显微镜下观察染色情况。检测JC-1单体时，设置激发光为490 nm、发射光为530 nm；检测JC-1聚合物时，设置激发光为525 nm，发射光为590 nm。

2.5 ROS试剂盒检测ROS水平

取处于对数生长期的各组PC12细胞，用PBS吹打至孔板底部透明，将细胞层收集至PBS中。用10 μmol·L^－1浓度的探针制备细胞悬液，加入荧光探针2’，7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯（2’，7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA），于37 ℃孵育1 h，以3 000 r·min^-1离心10 min获得细胞沉淀，用PBS洗涤后进行荧光检测。检测条件：最长激发波长为488 nm，最佳发射波长为525 nm。在荧光显微镜下观察染色结果，采用Image pro plus软件对各组ROS的总光密度值（integrated optical density，IOD）进行定量分析。

2.6 生物信息学分析

在Pubchem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）查找ICA的SMILES号，将其输入Swisstargetprediction（http：//www.swisstargetprediction.ch）和TargetNet网站（http：//targetnet.scbdd.com/calcnet/calc_text/）预测ICA的分子靶点。之后借助NCBI的GEO数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）获取AD相关芯片，选择GSE5281和GSE132903进行分析，差异基因筛选条件为logFC的绝对值大于1且校正后P<0.05。通过MitoCarta3.0（https：//www.broadinstitute.org/mitocarta/mitocarta30-inventory-mammalian-mitochondrial-proteins-and-pathways）数据库和Geemcards数据库（https：//www.genecards.org/）查找线粒体相关靶点，Geemcards数据库差异基因筛选条件为相关评分不低于7。借助Venn网站（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）将ICA靶点、AD相关靶点、线粒体相关靶点取交集。通过STRING网站（https：//string-db.org）进行蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）分析，采用Cytoscape软件对分析结果进行可视化呈现。

ICA结构文件从Pubchem数据库获取，MAPK1结构文件由PDB数据库（https：//www1.rcsb.org/）获取，采用AutoDock Tools 1.5.6软件对ICA和MAPK1结构文件进行处理并保存为pdbqt格式。借助AutoDock Vina 1.2.0软件完成大分子和小分子的对接，对接方式为半柔性对接，算法为拉马克遗传算法。

2.7 蛋白印迹法检测MAPK1、c-Myc蛋白的表达

取各组PC12细胞沉淀，加入放射免疫沉淀法裂解液（radioimmunoprecipitation assay lysis buffer，RIPA），冰浴30 min，以10 000 r·min^-1离心5 min，收集上清液，采用酶标仪测定蛋白浓度。进行电泳分离蛋白，封闭60 min后，加入一抗MAPK1（1∶1 000）、c-Myc（1∶500）、p-MAPK1（0.5 μg·mL^-1）、p-c-Myc（1∶500），封膜后置于4 ℃孵育过夜，加入二抗IgG（1∶10 000），室温孵育1 h后，使用增强型化学发光（enhanced chemiluminescence，ECL）染液显色、曝光，使用ImageJ软件进行灰度分析，计算目的蛋白相对表达水平。目的蛋白相对表达水平=目的蛋白条带灰度值/β-actin蛋白条带灰度值。

2.8 qPCR法检测细胞中MAPK1、c-Myc mRNA的表达

采用TRIzol试剂提取细胞总RNA，使用NanoDrop-2000 c分光光度计检测提取RNA的质量。按照BeyoRT™ Ⅱ cDNA合成试剂盒（含RNase H-）说明书操作，每个样本取1 μg RNA作为逆转录模板合成cDNA，再以此为模板进行PCR反应。反应条件：95 ℃预变性2 min，95 ℃变性15 s、60 ℃退火/延伸1 min（读板），40 个循环。引物序列见表1。将相对mRNA表达水平以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）为内参进行标准化，采用2^-ΔΔCT法分析数据。

2.9 统计学方法

采用SPSS 26.0软件对数据进行处理。采用Shapiro-Wilk法进行正态性检验，符合正态分布的数据以（\overline{x}±s）表示，2组数据比较采用t检验，多组间数据比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-Q检验；非正态分布数据采用非参数检验。P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 ICA对Aβ_25-35诱导的PC12细胞活力的影响

使用不同浓度Aβ_25-35（0、5、10、20、30、40 μmol·L^-1）诱导PC12细胞24 h， CCK-8试剂盒检测结果显示，与0 μmol·L^-1对照组比较，不同浓度Aβ_25-35均能抑制PC12细胞的活力（P<0.05），且随着浓度升高，细胞活力受抑制程度加重，呈剂量依赖性。因此，本研究最终采用20 μmol·L^-1 Aβ_25-35处理PC12细胞24 h构建体外AD细胞模型。

分别采用0、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0 μmol·L^-1 ICA处理PC12细胞2 h，CCK-8试剂盒检测结果显示，浓度小于20 μmol·L^-1的ICA单独干预对PC12细胞活力比较差异无统计学意义（P>0.05）；用上述浓度ICA处理PC12细胞后，再用20 μmol·L^-1 Aβ_25-35处理24 h，细胞活力检测结果显示，当ICA浓度≥5 μmol·L^-1时，ICA可改善Aβ_25-35诱导的PC12细胞毒性作用，以剂量依赖性方式提高Aβ_25-35诱导的PC12细胞活力（P<0.05），因此选择5、10、20 μmol·L^-1浓度的ICA用于后续研究。见图1。

3.2 ICA对Aβ_25-35诱导的PC12细胞凋亡的影响

与对照组比较，Aβ_25-35组PC12细胞凋亡率显著升高（P<0.05）；与Aβ_25-35组比较，ICA处理可显著降低PC12细胞的凋亡率，且随着ICA浓度升高，抑制凋亡的效果更显著（P<0.05）。见图2。

3.3 ICA对Aβ_25-35诱导的PC12细胞线粒体膜电位的影响

与对照组比较，Aβ_25-35组PC12细胞线粒体膜电位降低（P<0.05）；与Aβ_25-35组比较，中浓度和高浓度ICA处理可显著升高PC12细胞线粒体膜电位（P<0.05）。表明ICA可改善Aβ_25-35诱导的PC12细胞线粒体损伤。见图3。

3.4 ICA对Aβ_25-35诱导的PC12细胞ROS水平的影响

与对照组比较，Aβ_25-35组PC12细胞中ROS水平显著升高（P<0.05）；与Aβ_25-35组比较，ICA处理可降低PC12细胞中ROS水平，且随着ICA浓度升高，降低程度更显著（P<0.05）。表明ICA可改善Aβ_25-35诱导的PC12细胞线粒体损伤。见图4。

3.5 ICA对Aβ_25-35诱导的PC12细胞MAPK1、c-Myc表达水平的影响

生物信息学分析取ICA、AD与线粒体相关靶点的交集，结果共获得9个相交靶点。PPI分析结果显示，MAPK1和其他分子间的相互作用更强；分子对接实验结果显示，MAPK1与ICA的结合分数较高（结合能为-8.8 kcal·mol^-1）。借助蛋白印迹法和qPCR法检测MAPK1与c-Myc蛋白及mRNA表达情况，结果显示，与对照组比较，Aβ_25-35组PC12细胞中MAPK1、c-Myc的总蛋白、磷酸化蛋白及mRNA表达均显著升高（P<0.05）；与Aβ_25-35组比较，ICA处理以剂量依赖性方式降低PC12细胞中MAPK1、c-Myc的总蛋白、磷酸化蛋白及mRNA水平（P<0.05）。结果表明Aβ_25-35处理可促进PC12细胞中MAPK1、c-Myc水平升高，而ICA处理可抑制MAPK1、c-Myc的表达。见图5。

4 讨论

AD作为一种隐匿性、不可逆的神经退行性病变，其发病率随年龄增长而升高，是导致痴呆症的常见原因，主要特征为记忆和思维能力衰退^［12］。在AD的病理进程中，神经元损伤是关键特征。Aβ蛋白假说指出，Aβ蛋白作为AD病理进展的核心，其异常积聚可激活小胶质细胞，触发神经炎症，最终导致神经元凋亡^［13-14］。本研究通过比较正常PC12细胞与经Aβ_25-35处理后的PC12细胞的存活率，证实Aβ_25-35具有诱导神经细胞凋亡的作用。ICA作为淫羊藿的有效活性成分，不仅可促进受Aβ损伤的神经元存活和分化，还可通过调节甘油磷脂和鞘脂代谢，改善由AD引起的代谢失衡，进而提升AD模型小鼠的认知功能，这一发现提示ICA作为AD治疗新策略的巨大潜力^［15-16］。本研究中，Aβ_25-35刺激显著降低PC12细胞活力并促进其凋亡，而ICA处理可显著提升PC12细胞活力、减少凋亡，表明ICA对Aβ_25-35诱导的神经元损伤具有抑制作用。

线粒体是真核细胞中的重要细胞器，不仅是能量转换的枢纽，还参与三羧酸循环、钙离子储存及细胞增殖等多种生理过程。有研究证实，Aβ在神经元细胞中的积聚可破坏AD中溶酶体-线粒体信号通路，导致线粒体功能障碍^［17］。AD患者的神经元中存在线粒体功能紊乱，维持线粒体稳态有助于减轻Aβ蛋白毒性，改善AD模型小鼠的情景记忆能力^［18］。本研究发现，ICA可显著升高Aβ_25-35诱导的PC12细胞线粒体膜电位，并有效减少ROS生成。这一结果表明，ICA在抑制神经元线粒体损伤方面具有显著的效果，从而可能减缓AD的进展。线粒体作为细胞的“能量工厂”，其功能障碍与多种神经退行性疾病密切相关，ICA通过调节线粒体稳态表现出对抗神经退行性疾病的潜力，这不仅为ICA作为潜在AD治疗药物的开发提供了实验基础，也开辟了通过调节线粒体稳态对抗神经退行性疾病的新途径。

MAPK1是AD的一种上调基因，其异常激活对疾病进程具有重要影响，有研究证实，加兰他敏通过抑制MAPK1的活化，表现出治疗AD的潜力^［19-20］。此外，miR-20a通过调控MAPK/ERK信号通路，下调MAPK1及其下游c-Myc的表达，揭示MAPK1、c-Myc共同参与调节乳腺癌的生长和化疗耐药性^［21］。Ferrer I等^［22］研究证实，在AD和其他tau蛋白疾病中，MAPK1能够使c-Myc发生磷酸化，诱发神经元细胞周期紊乱，提示存在MAPK1/c-Myc通路。另有研究证实，c-Myc在AD病灶中呈高表达，同时是驱动神经元重新进入细胞周期，介导神经退行性变的关键调控分子^［8，23］。MAPK1的病理作用还表现在其对线粒体稳态的破坏，可诱导线粒体相关内质网膜（mitochondria-associated membranes，MAM）损伤，导致线粒体断裂和功能受损^［24］。与此同时，c-Myc也被证实可增强糖酵解和线粒体氧化磷酸化过程，造成线粒体损伤^［25］。因此，MAPK1/c-Myc通路也可作为线粒体损伤的关键调节途径。本研究通过检测各组细胞中MAPK1/c-Myc通路的表达发现，Aβ_25-35损伤后的PC12细胞中MAPK1/c-Myc的表达显著上调，而ICA干预各组PC12细胞中p-MAPK1、MAPK1、p-c-Myc、c-Myc的表达呈剂量依赖性下调，表明ICA可通过调节MAPK1/c-Myc通路改善线粒体损伤，发挥神经保护作用。

本研究也存在一定局限性：如本研究主要采用PC12细胞作为神经元模型，尽管PC12细胞在神经科学研究中应用广泛，但无法完全模拟体内复杂的神经元环境；此外，本研究主要在细胞层面开展，仍缺乏动物实验进一步明确ICA在体内的效果和安全性。

综上所述，本研究首次阐明了ICA通过下调MAPK1/c-Myc信号通路，改善Aβ_25-35诱导的神经元凋亡，保护线粒体功能，为抗AD药物的研究提供了新的理论依据。

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基金资助

安徽省高校自然科学研究重点项目(KJ2021A1279)