紫草素通过腺苷酸活化蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白/UNC-51样自噬激活激酶1通路调控食管癌细胞自噬和凋亡的机制

Impacts of shikonin on autophagy and apoptosis of esophageal cancer cells by regulating the AMPK/mTOR/ULK1 pathway

摘要

目的 探讨紫草素（shikonin，SHI）经腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase，AMPK）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）/UNC-51样自噬激活激酶1（UNC-51-like kinase 1，ULK1）通路调控食管癌细胞自噬和凋亡的作用机制。 方法 体外培养人食管癌TE-1细胞，随机分为对照组（常规培养）、SHI低浓度（SHI-L，0.5 μmol·L^-1）组、SHI中浓度（SHI-M，1.0 μmol·L^-1）组、SHI高浓度（SHI-H，2.0 μmol·L^-1）组、SHI-H+Compound C组（2.0 μmol·L^-1 SHI+10 μmol·L^-1 AMPK抑制剂Compound C）。采用噻唑蓝比色法（methylthiazolyl tetrazolium assay，MTT）、克隆形成实验评价细胞增殖能力；Transwell实验检测细胞迁移、侵袭能力；流式细胞术检测细胞凋亡率；酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测炎性细胞因子白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的表达水平；免疫印迹（Western blotting）检测AMPK、mTOR、ULK1、B细胞淋巴瘤-2蛋白（B-cell lymphoma-2 protein，Bcl-2）、微管相关蛋白1轻链3（light chain 3 of microtubule-associated protein 1，LC3）、p62自噬相关蛋白的表达水平。 结果 与对照组比较，SHI-L组、SHI-M组、SHI-H组的490 nm波长处吸光度值（A₄₉₀），克隆形成数量，迁移及侵袭细胞数量，IL-6与TNF-α含量，p-mTOR/mTOR、p-ULK1/ULK1、Bcl-2、p62蛋白表达水平均显著降低（P<0.05），自噬小体数量、凋亡率及AMPK、LC3蛋白表达水平均显著升高（P<0.05）；与SHI-H组比较，SHI-H+Compound C组A₄₉₀、克隆形成数量，迁移及侵袭细胞数量，IL-6与TNF-α含量，p-mTOR/mTOR、p-ULK1/ULK1、Bcl-2、p62蛋白表达水平均显著升高（P<0.05），自噬小体数量、凋亡率及AMPK、LC3蛋白表达水平均显著降低（P<0.05）。 结论 SHI可通过激活AMPK/mTOR/ULK1信号通路，诱导食管癌细胞自噬与凋亡，进而抑制食管癌恶性进展。

Abstract

Objective To investigate the effects of shikonin （SHI） on autophagy and apoptosis in esophageal cancer cells through regulation of the AMP-activated protein kinase （AMPK）/mammalian target of rapamycin （mTOR）/UNC-51 like autophagy activating kinase 1 （ULK1） pathway. Methods Human esophageal cancer TE-1 cells were divided into 5 groups： control （conventional culture） group， SHI-L （0.5 μmol·L^-¹ SHI） group， SHI-M （1.0 μmol·L^-¹ SHI） group， SHI-H （2.0 μmol·L^-¹ SHI） group， and SHI-H + Compound C （2.0 μmol·L^-¹ SHI + 10 μmol·L^-¹ AMPK inhibitor compound C） group. Cell proliferation was assessed by methylthiazolyl tetrazolium assay（MTT） and colony formation assays. Cell migration and invasion were evaluated by Transwell assay. Apoptosis was analyzed by flow cytometry. The expression levels of interleukin-6 （IL-6） and tumor necrosis factor-α （TNF-α） were quantified by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. The expression of AMPK， mTOR， ULK1， microtubule-associated protein 1 light chain 3 （LC3）， and p62 proteins was detected by Western blotting. Results Compared with the control group， the SHI-L， SHI-M， and SHI-H groups exhibited decreased absorbance at 490 nm （A₄₉₀）， reduced colony numbers， diminished migration and invasion capacities， downregulated IL-6 and TNF-α expression， decreased p-mTOR/mTOR and p-ULK1/ULK1 ratios， reduced B-cell lymphoma-2 （Bcl-2） and p62 protein expression （all P<0.05）， and increased autophagosome numbers， elevated apoptosis rates， and upregulated AMPK and LC3 protein expression （all P<0.05）. Compared with the SHI-H group， the SHI-H+compound C group showed increased A₄₉₀， elevated colony numbers， enhanced migration and invasion， upregulated IL-6 and TNF-α expression， increased p-mTOR/mTOR and p-ULK1/ULK1 ratios， elevated Bcl-2 and p62 protein expression （all P<0.05）， and decreased autophagosome numbers， reduced apoptosis rates， and downregulated AMPK and LC3 protein expression （all P<0.05）. Conclusion SHI may promote autophagy and apoptosis while inhibiting the progression of esophageal cancer by activating the AMPK/mTOR/ULK1 signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

紫草素 / 食管癌 / 腺苷酸活化蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白/UNC-51样自噬激活激酶1通路 / 自噬 / 凋亡

Key words

shikonin / esophageal cancer / AMP-activated protein kinase/mammalian target of rapamycin/unc-51 like autophagy activating kinase 1 pathway / autophagy / apoptosis

食管癌是临床常见的消化系统恶性肿瘤，侵袭性较强，近年来发病率呈上升趋势。因早期缺乏典型临床表现，多数患者确诊时已至晚期，错失最佳治疗时机，不仅影响整体疗效，还会增加患者远期死亡风险^［1-2］。目前，早期食管癌主要采用外科根治术、放化疗联合免疫治疗等综合方案，可有效抑制癌细胞的转移与扩散，改善患者预后；晚期患者多以化疗为主，整体疗效有限，严重威胁患者的生命健康^［3-4］。因此，探究食管癌细胞自噬、凋亡相关分子调控机制具有重要研究价值。

近年来，中医药抗肿瘤作用受到广泛关注，多种中药活性成分逐步应用于肿瘤基础与临床研究。紫草素（shikonin，SHI）是中药紫草的重要活性成分，已被证实具有显著的抗肿瘤活性^［5］。SHI属于天然萘醌类化合物，具有抗肿瘤、抗炎、抗病毒等药理作用，其单体及衍生物在多种疾病治疗中均有应用，现有研究表明，该成分对食管癌具有良好的干预效果^［6］。腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase，AMPK）是调控细胞能量代谢的关键分子，可通过调控下游信号通路诱导细胞自噬，参与肿瘤进展过程^［7］。研究表明，AMPK/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）/UNC-51样自噬激活激酶1（UNC-51-like kinase 1，ULK1）信号通路在肿瘤发生、发展过程中发挥重要作用，可精准调控肿瘤细胞自噬与凋亡进程^［8］。但目前SHI是否通过调控AMPK/mTOR/ULK1信号通路影响食管癌细胞自噬与凋亡尚不明确。本研究以人食管癌TE-1细胞为体外模型，探讨SHI通过调控AMPK/mTOR/ULK1通路对食管癌细胞自噬、凋亡的影响，以期为食管癌临床治疗提供实验参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

MI40型倒置显微镜（上海普阳生物科技有限公司）；Feyond-A400型多功能酶标仪（杭州奥盛仪器有限公司）；Attune型流式细胞仪（美国Thermo公司）；OSE-470P型凝胶成像系统（杭州开泰生物技术有限公司）。

1.2 试药

RPMI-1640培养基（批号BMC1011）、胎牛血清（批号BMC1021），均购自武汉亚科因生物技术有限公司；SHI（CAS号517-88-4，质量分数≥98%，上海甄准生物科技有限公司）；AMPK抑制剂Compound C（CAS号168828-90-8，质量分数≥98%，江西江蓝纯生物试剂有限公司）；细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）试剂盒（批号BES-20212CR）、放射免疫沉淀测定（radio-immunoprecipitation assay，RIPA）裂解液（批号BES202263CA）、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量试剂盒（批号BES202267CA）、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝胶配制试剂盒（批号BES202090CA），均购自上海博尔森生物科技有限公司；FITC-Annexin V /PI细胞凋亡检测试剂盒（批号CSP061，上海中乔新舟生物科技有限公司）；增强型化学发光液（enhanced chemiluminescence，ECL）化学发光试剂盒（批号P10010，苏州新赛美生物科技有限公司）；白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6） ELISA试剂盒（批号JK-00421）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α） ELISA试剂盒［批号JK-（a）-1446］，均购自上海晶抗生物工程有限公司；抗体AMPK、mTOR、p-mTOR、ULK1、p-ULK1、B细胞淋巴瘤-2蛋白（B-cell lymphoma-2 protein，Bcl-2）、微管相关蛋白1轻链3（light chain 3 of microtubule-associated protein 1，LC3）、p62及羊抗兔二抗、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH），批号分别为ab110036、ab109268、ab137133、ab179458、ab133747、ab182858、ab51520、ab207305、ab97051、ab181603，均购自英国Abcam公司。

1.3 细胞

人食管癌TE-1细胞（批号YCL-0311），购自亿泽丰生物科技（上海）有限公司。

2 方法

2.1 SHI浓度的筛选

将TE-1细胞置于添加体积分数1%青链霉素与体积分数10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，于37 ℃、含体积分数5% CO₂条件下常规培养。采用浓度依次为0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μmol·L^-1的SHI处理细胞24 h，加入CCK-8工作液继续孵育1 h，采用酶标仪检测450 nm波长处的吸光度值（absorbance at 450 nm，A₄₅₀），计算细胞存活率。

2.2 细胞分组

将实验细胞随机分为对照组、SHI低浓度（SHI-L）组、SHI中浓度（SHI-M）组、SHI高浓度（SHI-H）组及SHI-H+Compound C组。对照组常规培养；SHI-L组、SHI-M组、SHI-H组分别采用0.5、1.0、2.0 μmol·L^-1SHI干预细胞24 h^［9］；SHI-H+Compound C组采用2.0 μmol·L^-1 SHI联合10 μmol·L^-1 Compound C共同处理24 h^［10］。

2.3 噻唑蓝比色法实验（methylthiazolyl tetrazolium assay，MTT）和克隆形成实验检测TE-1细胞的增殖

2.3.1 MTT实验

采用体积分数0.25%胰蛋白酶消化各组TE-1细胞，制备单细胞悬液并接种于96孔板中，于37 ℃、含体积分数5% CO₂环境下培养24 h。每孔加入10 μL 5 mg·mL^-1 MTT溶液，继续培养4 h后弃去孔内培养液，每孔加入150 µL的二甲基亚砜，充分振荡溶解并避光静置10 min，利用酶标仪测定各孔的A₄₉₀值，实验重复3次。

2.3.2 克隆形成实验

将TE-1细胞接种在6孔板中，于37 ℃、含体积分数5% CO₂环境下常规培养。待肉眼可见细胞克隆形成后，采用磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered saline，PBS）洗涤细胞，固定液固定、结晶紫染色，于显微镜下观察并拍照，统计细胞克隆数量。

2.4 Transwell实验检测TE-1细胞的迁移和侵袭

采用体积分数0.25%胰蛋白酶消化各组TE-1细胞，缓冲液洗涤后制备单细胞悬液，迁移实验将细胞悬液加至不含Matrigel基质胶的Transwell上室，侵袭实验则在Transwell上室预先铺置Matrigel基质胶；下室加入500 μL含体积分数10%胎牛血清的杜氏改良Eagle培养基（Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM），持续培养24 h。经体积分数4%多聚甲醛固定、质量分数0.5%结晶紫染色后，于显微镜下观察细胞穿膜情况，分别统计迁移及侵袭细胞数量。

2.5 GFP-LC3质粒转染法观察自噬小体

取250 μL培养基，加入4 μg GFP-LC3质粒与10 μL转染试剂充分混匀。将处理后的细胞接种于6孔板中并更换新鲜培养液（2 mL），每孔加入500 μL质粒转染混合液，避光孵育5 h后更换常规培养基继续培养48 h，采用荧光显微镜观察细胞自噬小体的形态与数量。

2.6 流式细胞仪检测TE-1细胞的凋亡

收集各组TE-1细胞并进行重悬处理，加入1.25 μL Annexin V-FITC，使用0.5 mL预冷结合缓冲液重悬细胞，再加入10 μL PI染液，通过流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

2.7 ELISA检测细胞中IL-6、TNF-α的表达水平

收集各组细胞样本，严格按照ELISA试剂盒说明书的步骤进行操作，检测细胞IL-6、TNF-α表达水平，使用酶标仪检测450 nm处的吸光度值（A₄₅₀），将样本吸光度值代入标准曲线方程，计算对应浓度，设置3个复孔，重复3次取平均值。

2.8 免疫印迹（Western blotting）检测蛋白表达

采用RIPA裂解液提取各组TE-1细胞总蛋白，利用BCA蛋白定量试剂盒完成蛋白定量。通过SDS-PAGE电泳分离蛋白后进行转膜操作，室温下采用体积分数5%脱脂奶粉封闭1 h；随后加入稀释后的一抗，其中AMPK（1∶2 000）、mTOR（1∶1 000）、p-mTOR（1∶1 000）、ULK1（1∶2 000）、p-ULK1（1∶10 000）、Bcl-2（1∶2 000）、LC3（1∶3 000）、p62（1∶1 000），4 ℃条件下孵育过夜。洗膜后加入二抗（1∶2 000），室温孵育1 h，使用ECL化学发光系统显影，以GAPDH（1∶10 000）作为内参校正蛋白质表达水平，凝胶成像系统采集图像并拍照。采用Image J软件对蛋白条带灰度值进行定量分析。

2.9 统计学方法

采用SPSS 25.0对数据进行处理。符合正态分布的计量资料以（\overline{x}±s）表示，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 SHI浓度的筛选

实验结果显示，SHI处理24 h时，IC₅₀为1.8 μmol·L^-1。因此，选取0.5、1.0、2.0 μmol·L^-1分别作为SHI-L组、SHI-M组、SHI-H组的药物干预浓度。见图1。

3.2 SHI对TE-1细胞增殖的影响

与对照组比较，SHI-L组、SHI-M组、SHI-H组的A₄₉₀、克隆形成数量均显著降低（P<0.05）。与SHI-H组比较，SHI-H+Compound C组细胞的A₄₉₀、克隆形成数量均显著升高（P<0.05）。见图2、表1。

3.3 SHI对TE-1细胞迁移、侵袭的影响

与对照组比较，SHI-L组、SHI-M组、SHI-H组的细胞迁移数量、侵袭数量均降低（P<0.05），与SHI-H组比较，SHI-H+Compound C组的细胞迁移数量、侵袭数量均升高（P<0.05）。见图3、表2。

3.4 SHI对TE-1细胞自噬的影响

与对照组比较，SHI-L组、SHI-M组、SHI-H组细胞自噬小体数量均显著增加（P<0.05）。与SHI-H组比较，SHI-H+Compound C组细胞自噬小体数量显著减少（P<0.05）。见图4。

3.5 SHI对TE-1细胞凋亡的影响

与对照组比较，SHI-L组、SHI-M组、SHI-H组细胞凋亡率均显著升高（P<0.05）；与SHI-H组比较，SHI-H+Compound C组细胞凋亡率显著降低（P<0.05）。见图5、表3。

3.6 SHI对TE-1细胞中IL-6、TNF-α表达的影响

与对照组比较，SHI-L组、SHI-M组、SHI-H组的IL-6、TNF-α表达水平均显著降低（P<0.05）。与SHI-H组比较，SHI-H+Compound C组的IL-6、TNF-α表达水平显著升高（P<0.05）。见表4。

3.7 SHI对TE-1细胞AMPK、mTOR、ULK1、Bcl-2、LC3、p62蛋白表达的影响

与对照组比较，SHI-L组、SHI-M组、SHI-H组AMPK、LC3蛋白表达水平均显著升高（P<0.05），p-mTOR/mTOR、p-ULK1/ULK1、Bcl-2、p62蛋白表达水平均显著降低（P<0.05）；与SHI-H组比较，SHI-H+Compound C组AMPK、LC3蛋白表达水平均显著降低（P<0.05），p-mTOR/mTOR、p-ULK1/ULK1、Bcl-2、p62蛋白表达水平均显著升高（P<0.05）。见图6、表5。

4 讨论

食管癌是临床较高发的恶性消化系肿瘤，严重影响患者的生存质量与生命安全。现有研究表明，该病发病与遗传、饮食习惯等多种因素相关，发病机制复杂，临床防治难度较大^［11］。随着细胞自噬相关研究逐渐深入，自噬被证实与肿瘤进展密切相关，可作为肿瘤治疗的潜在靶点，通过调控细胞自噬可有效抑制肿瘤发展^［12］。食管癌细胞的增殖、凋亡等恶性生物学行为是疾病发生、发展的核心环节^［13］。本研究探讨SHI通过调控AMPK/mTOR/ULK1通路对食管癌细胞自噬、凋亡的影响，可为食管癌的临床治疗提供新靶点，对优化治疗策略具有重要意义。

既往研究表明，SHI可参与调控肿瘤细胞凋亡、自噬等生物学过程，在抗肿瘤领域展现出良好应用前景^［14］。张欣等^［15］研究发现，SHI可能通过抑制磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B，PI3K/AKT）信号通路，阻滞细胞周期进程，诱导肿瘤细胞凋亡与自噬，进而起到抗肿瘤作用。Huang J等^［16］研究发现，SHI在食管癌的治疗中发挥重要作用，该成分可下调肿瘤坏死因子受体相关蛋白1（tumor necrosis factor receptor-associated protein 1，TRAP1）表达，抑制肿瘤细胞增殖并激活凋亡信号通路，有望成为食管癌新型治疗药物。本研究结果显示，经不同浓度SHI干预后，TE-1细胞的A₄₉₀、克隆形成数量、迁移数量、侵袭数量均降低，细胞凋亡率升高，炎性因子IL-6、TNF-α表达水平下降；自噬相关蛋白LC3表达上调，p62蛋白表达下调。表明SHI可抑制食管癌细胞增殖、迁移与侵袭，同时诱导细胞自噬与凋亡，进而阻滞肿瘤进展。

AMPK/mTOR/ULK1通路是调控细胞自噬的经典信号通路，自噬性细胞死亡是肿瘤干预的重要途径。AMPK作为通路上游关键调控分子，其表达上调可逐级抑制下游mTOR磷酸化，进一步降低ULK1磷酸化水平，最终诱导细胞自噬，广泛参与肿瘤发生、发展进程^［17］。Xiang X等^［18］在结直肠癌研究中发现，防己诺碱可通过激活AMPK/mTOR/ULK1通路，诱导肿瘤细胞自噬与凋亡，阻滞细胞周期，抑制肿瘤进展。Heng Y等^［19］研究发现，喜树碱（camptothecin，CPT）为经典抗肿瘤药物，可诱导细胞凋亡与自噬，其作用机制尚未完全阐明，现有研究证实CPT可靶向调控核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路，进而介导AMPK/mTOR/ULK1通路活化，诱导细胞保护性自噬，为肿瘤治疗提供新思路。本研究结果显示，SHI可上调AMPK蛋白表达，降低p-mTOR/mTOR、p-ULK1/ULK1比值，进而激活AMPK/mTOR/ULK1通路，诱导细胞自噬与凋亡，抑制细胞增殖、迁移及侵袭。采用AMPK抑制剂阻断通路后，SHI对食管癌细胞凋亡、自噬的调控效应出现明显逆转，证实SHI主要通过激活AMPK/mTOR/ULK1通路调控食管癌细胞增殖、自噬及凋亡生物学行为，具有治疗食管癌的潜力。

综上所述，SHI可通过激活AMPK/mTOR/ULK1通路，促进食管癌细胞自噬与凋亡，抑制食管癌进展。但本研究仍存在一定局限性：仅开展体外细胞实验，尚未进行体内动物实验与临床样本验证；同时，食管癌细胞自噬与凋亡还可能受其他信号通路协同调控，后续将围绕上述方向开展深入探究。

参考文献

[1] Lander S， Lander E， Gibson M K.Esophageal cancer：Overview，risk factors，and reasons for the rise［J］.Curr Gastroenterol Rep，2023，25（11）：275-279．

[2] Xin Z， Liu Q， Ai D，et al.Radiotherapy for advanced esophageal cancer：From palliation to curation［J］.Curr Treat Options Oncol，2023，24（11）：1568-1579．

[3] 陈婷，秦永辉，刘凯.血清DKK1、TK1水平预测老年胸段食管癌患者根治术后复发、转移的研究［J］.国际检验医学杂志，2022，43（2）：239-243．

[4] Chen Ting， Qin Yonghui， Liu Kai.Research on serum DKK1 and TK1 levels in predicting recurrence and metastasis after radical resection in elderly patients with thoracic esophageal cancer［J］.International Journal of Laboratory Medicine，2022，43（2）：239-243．

[5] Peng Y， Zhou T， Wang S，et al.Dehydrocostus lactone inhibits the proliferation of esophageal cancer cells in vivo and in vitro through ROS-mediated apoptosis and autophagy［J］. Food Chem Toxicol，2022，170：113453．

[6] 殷星，侯永超，杨利姣，等.银杏内酯B调控JAK2/STAT3信号通路对食管癌细胞增殖及凋亡的影响［J］．激光生物学报，2024，33（2）：185-192．

[7] Yin Xing， Hou Yongchao， Yang Lijiao，et al.Effects of ginkgolide B on proliferation and apoptosis of esophageal cancer cells by regulating JAK2/STAT3 signaling pathway［J］.Acta Laser Biology Sinica，2024，33（2）：185-192．

[8] Zhang Q， Liu Q， Zheng S，et al.Shikonin inhibits tumor growth of ESCC by suppressing PKM2 mediated aerobic glycolysis and STAT3 phosphorylation［J］.J Cancer，2021，12（16）：4830-4840．

[9] Hsu C C， Peng D， Cai Z，et al.AMPK signaling and its targeting in cancer progression and treatment［J］.Semin Cancer Biol，2022，85：52-68．

[10] Bu H， Liu D， Zhang G，et al. AMPK/mTOR/ULK1 axis-mediated pathway participates in apoptosis and autophagy induction by oridonin in colon cancer DLD-1 cells［J］.Onco Targets Ther，2020，13：8533-8545．

[11] 杨双，俞思全.紫草素促进食管癌细胞凋亡及细胞周期阻滞的作用机制研究［J］.安徽医药，2023，27（1）：79-82．

[12] Yang Shuang， Yu Siquan.Effect and mechanism of shikonin on apoptosis and cell cycle arrest of esophageal cancer cells［J］.Anhui Medical and Pharmaceutical Journal，2023，27（1）：79-82．

[13] 毛治尉，王东伟，武永新，等.白桦脂酸调节AMPK/mTOR/ULK1信号通路对冠心病大鼠血管平滑肌细胞自噬和凋亡的影响［J］.实用药物与临床，2023，26（8）：679-686．

[14] Mao Zhiwei， Wang Dongwei， Wu Yongxin，et al ．Impacts of betulinic acid on autophagy and apoptosis of vascular smooth muscle cells in rats with coronary heart disease by regulating AMPK/mTOR/ULK1 signaling pathway［J］.Practical Pharmacy and Clinical Remedies，2023，26（8）：679-686．

[15] Hou G， Jia A， Yang L，et al.OP16 induces deadly autophagy and apoptosis of cells by inhibiting Akt in esophageal squamous cell carcinoma［J］.Mol Cell Biochem，2020，472（1/2）：219-230．

[16] 马永超，任丽平，金少举，等.石蒜碱通过TGF-β/Smad 信号通路调控自噬抑制食管癌细胞增殖［J］.现代肿瘤医学，2023，31（10）：1799-1804．

[17] Ma Yongchao， Ren Liping， Jin Shaoju，et al.Lycorine regulates autophagy and inhibits the proliferation of esophageal cancer cells through TGF-β/Smad signal pathway［J］. Journal of Modern Oncology，2023，31（10）：1799-1804．

[18] 苏培渊，杨清，付兵，等.miR-30a通过靶向调控Beclin-1、ATG5影响食管癌细胞自噬及增殖过程［J］.中国免疫学杂志，2022，38（24）：3013-3019，3024．

[19] Su Peiyuan， Yang Qing， Fu Bing，et al.miR-30a affects autophagy and proliferation of esophageal cancer cells through targeted regulation of Beclin-1 and ATG5［J］.Chinese Journal of Immunology，2022，38（24）：3013-3019，3024．

[20] Yadav S， Sharma A， Nayik G A，et al. Review of shikonin and derivatives：Isolation，chemistry，biosynthesis，pharmacology and toxicology［J］.Front Pharmacol，2022，13：905755．

[21] 张欣，霍浩然，张振翼，等.紫草素调控PI3K/Akt/mTOR通路对人胃癌MGC803细胞自噬和凋亡的影响［J］.中国现代普通外科进展，2023，26（7）：511-515．

[22] Zhang Xin， Huo Haoran， Zhang Zhenyi，et al.Effect of Shikonin on autophagy and apoptosis of human gastric cancer MGC803 cells by regulating PI3K/Akt/mTOR［J］.Chinese Journal of Current Advances in General Surgery，2023，26（7）：511-515．

[23] Huang J， Zhao L， Gong C，et al.Shikonin promotes apoptosis and attenuates migration and invasion of human esophageal cancer cells by inhibiting tumor necrosis factor receptor-associated protein 1 expression and AKT/mTOR signaling pathway［J］.Evid Based Complement Alternat Med，2021，2021：5386050．

[24] Zhou X， Chen Y， Wang F，et al.Artesunate induces autophagy dependent apoptosis through upregulating ROS and activating AMPK-mTOR-ULK1 axis in human bladder cancer cells［J］.Chem Biol Interact，2020，331：109273．

[25] Xiang X， Tian Y， Hu J，et al.Fangchinoline exerts anticancer effects on colorectal cancer by inducing autophagy via regulation AMPK/mTOR/ULK1 pathway［J］. Biochem Pharmacol，2021，186：114475．

[26] Heng Y， Liang Y， Zhang J，et al.Camptothecin inhibits neddylation to activate the protective autophagy through NF-κB/AMPK/mTOR/ULK1 axis in human esophageal cancer cells［J］.Front Oncol，2021，11：671180．

基金资助

张家口市重点研发计划项目(2021037D)

河北省2021年度医学科学研究课题(20210617)