酸枣仁皂苷A对乳腺癌细胞生物学特性及磷酸化磷脂肌醇3激酶/磷酸化蛋白激酶B/磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路的影响

Effect of jujuboside A on the biological characteristics of breast cancer cells and the phospho-phosphatidylinositol 3-kinase/phospho-protein kinase B/phospho-mammalian target of rapamycin signaling pathway

摘要

目的 探究酸枣仁皂苷A对乳腺癌细胞生物学特性的影响及其作用机制。 方法 选取小鼠源乳腺癌细胞系EO771为实验对象，采用二甲基亚砜配制酸枣仁皂苷A溶液，分别采用25、50、100 μmol·L^－1酸枣仁皂苷A溶液处理细胞；采用细胞计数试剂盒检测细胞活性；采用流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期水平；通过划痕实验、Transwell小室实验及侵袭实验检测细胞的迁移和侵袭能力；利用定量聚合酶链式反应（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）技术检测相关基因表达水平；采用Western blotting实验检测相关蛋白表达水平。 结果 经酸枣仁皂苷A处理后的乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力均降低，细胞凋亡率升高，B细胞淋巴瘤-2基因（B-cell lymphoma-2 protein，Bcl-2）的蛋白表达量降低，Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）和裂解的半胱氨酸蛋白酶-3（cleaved caspase-3，c-caspase 3）的蛋白表达量升高；酸枣仁皂苷A可将乳腺癌细胞周期阻滞于G0/G1期；经酸枣仁皂苷A处理后的乳腺癌细胞磷酸化磷脂肌醇3激酶（phospho-phosphotylinosital 3 kinase，p-PI3K）、磷酸化蛋白激酶B（phospho-protein kinase B，p-Akt）和磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（phospho-mammalian target of rapamycin，p-mTOR）的蛋白表达量均降低。 结论 酸枣仁皂苷A可通过调控PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，并诱导乳腺癌细胞凋亡。

Abstract

Objective To investigate the effect and mechanism of jujuboside A on the biological characteristics of breast cancer cells. Methods Experiments were performed using the mouse breast cancer cell line EO771. Jujuboside A was dissolved in dimethyl sulfoxide （DMSO）， and cells were treated with different concentrations of Jujuboside A （25， 50， and 100 μmol·L⁻¹）. Cell viability was assessed using the cell counting kit-8 （CCK-8） assay. Cell apoptosis and cell cycle distribution were analyzed by flow cytometry. Cell migration and invasion capacities were evaluated by wound healing， Transwell， and matrigel invasion assays. The messenger RNA （mRNA） levels of relevant genes were quantified by quantitative polymerase chain reaction （qPCR）. The levels of relevant proteins were detected by Western blotting. Results Jujuboside A treatment significantly inhibited the proliferation， migration， and invasion of breast cancer cells， while promoting apoptosis. The protein expression of B-cell lymphoma-2 （Bcl-2） was downregulated， whereas the protein levels of Bcl-2-associated X protein （Bax） and cleaved caspase-3 （c-caspase 3） were upregulated. Jujuboside A induced cell cycle arrest at the G0/G1 phase. The protein levels of phospho-phosphatidylinositol 3-kinase （p-PI3K）， phospho-protein kinase B （p-Akt）， and phospho-mammalian target of rapamycin （p-mTOR） were significantly reduced in jujuboside A-treated breast cancer cells. Conclusion Jujuboside A inhibits the proliferation， migration， and invasion of breast cancer cells and promotes apoptosis through suppression of the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

酸枣仁皂苷A / 乳腺癌 / 细胞生物学行为 / 磷酸化磷脂肌醇3激酶/磷酸化蛋白激酶B/磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路

Key words

jujuboside A / breast cancer / cellular biological behaviors / phospho-phosphatidylinositol 3-kinase/phospho-protein kinase B/phospho-mammalian target of rapamycin signaling pathway

乳腺癌是女性极具侵袭性的恶性肿瘤之一，随着医疗水平的不断进步，乳腺癌患者的总体死亡率有所下降，但该病仍是威胁女性身心健康的重大疾病^［1］。目前，手术治疗是乳腺癌的首选治疗方式，化疗和放疗也可有效抑制肿瘤生长，上述治疗手段在一定程度上能延长患者的生存期^［2］。但由于乳腺癌具有较高的转移、扩散及复发率，且多数患者易出现化疗药物耐药的问题，因此寻找高效、安全的靶向治疗药物具有重要的研究意义^［1-2］。近年来，多项研究证实，传统中药材酸枣仁能够抑制肝癌、结直肠癌、卵巢癌等多种肿瘤的增殖与生长^［3-5］。酸枣仁皂苷A是酸枣仁的主要活性成分，目前尚未见该活性成分作用于乳腺癌的相关研究报道。本研究通过细胞学实验，探究酸枣仁皂苷A对乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡等生物学特性的影响及其作用机制，以期为酸枣仁皂苷A应用于乳腺癌的临床治疗提供实验基础和理论依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

BS-1101型微孔板酶标仪（南京德铁生物科技有限公司）；Optima XPN-100型低温高速离心机、CytoFLEX SRT型流式细胞仪，均购自美国贝克曼库尔特有限公司；CKX31型倒置光学显微镜（日本奥林巴斯公司）；BC-J80型细胞培养箱（上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）；L96G/Y型聚合酶链式反应（polymerase chain reaction， PCR）仪（杭州朗基科学仪器有限公司）；Trans-Blot Turbo型垂直电泳系统和蛋白转印系统（美国伯乐公司）。

1.2 试药

酸枣仁皂苷A（批号17102021，质量分数≥98.0%，成都德思特生物技术有限公司）；二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，批号240911107Y，南京化学试剂股份有限公司）；细胞计数试剂盒（cell counting kit，CCK-8，批号ml095229，上海酶联生物科技有限公司）；划痕实验试剂盒（批号CBA-120，武汉艾美捷科技有限公司）；Transwell实验及侵入实验试剂盒（批号G4740，北京索莱宝科技有限公司）；核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）提取、反转录及扩增试剂盒［批号6210B，宝生物工程（大连）有限公司］；凋亡检测相关试剂膜联蛋白（Annexin-V，批号E-CK-A229）、碘化丙锭（propyl iodide，PI，批号E-CK-A229），均购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；B淋巴细胞瘤-2基因蛋白（B-cell lymphoma-2 protein，Bcl-2）抗体（批号ab59348）、Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）抗体（批号ab32503）、裂解的半胱氨酸蛋白酶-3（cleaved caspase-3，c-caspase 3）抗体（批号ab2302）、磷脂肌醇3激酶（phosphotylinosital 3 kinase，PI3K）抗体（批号ab191606）、p-PI3K抗体（批号ab182651）、蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）抗体（批号ab8805）、p-Akt抗体（批号ab38449）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）抗体（批号ab32028）、p-mTOR抗体（批号ab109268）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体（批号ab181602）和二抗（批号ab109862），均购自美国Abcam公司；细胞培养基（批号11965-092）、血清（批号10099141）、抗生素（批号15140-122），均购自美国Gibco公司。

1.3 细胞

小鼠源乳腺癌细胞系EO771购自上海国家细胞库。

2 方法

2.1 CCK-8实验

利用CCK-8试剂盒检测细胞活性，将5×10³个EO771细胞接种于96孔板中，采用DMSO配制不同浓度酸枣仁皂苷A，设置浓度梯度为0、25、50、100 μmol·L^-1，在37 ˚C细胞培养箱中分别孵育24、36、48 h。每孔加入10 μL CCK-8溶液，继续孵育1.5 h。使用酶标仪测量450 nm波长处的吸光度，以此反映细胞活力^［6］。

2.2 流式细胞实验

利用Annexin-V/PI双染凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡。酸枣仁皂苷A处理细胞24 h后，用胰蛋白酶消化细胞并收集细胞，在37 ˚C下，以2 000 r·min^-1离心5 min，弃去上清液后重悬细胞，再次离心5 min，沉淀重悬在300 μL结合缓冲液中；将5 μL样品与5 μL Annexin-V荧光染液混匀，在上机检测前5 min将5 μL PI染液加入至上述结合缓冲液中，利用流式细胞仪检测细胞凋亡比例^［6-7］。

细胞周期检测取样流程同凋亡实验，将收集到的细胞置于体积分数70%乙醇中，4 ˚C固定过夜。弃去固定液后，将细胞重悬在500 μL PI染色液中，37 ˚C避光孵育30 min后，上机检测，配套软件分析细胞周期分布^［7］。

2.3 划痕实验

将1×10⁴个EO771细胞接种到6孔培养板中，常规培养至细胞密度达到90%。使用无菌100 μL吸头在培养板上匀速划痕，利用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）洗涤去除脱落细胞碎片，于0 h时采用倒置光学显微镜80倍镜下拍照记录。每孔加入3 mL无血清培养基，分别加入25、50、100 μmol·L^-1酸枣仁皂苷A干预，继续培养24 h。使用Image J软件分析划痕愈合率^［6］，每组实验重复3次。

2.4 细胞迁移及侵袭实验

采用Transwell小室实验检测细胞迁移与侵袭能力。用不同浓度酸枣仁皂苷A处理细胞后，胰酶消化并收集细胞，重悬于无血清培养基中，调整细胞密度至5×10⁵个·mL^-1。24孔板下室加入500 μL含体积分数10%胎牛血清的培养基，将Transwell小室置于孔板中，上室加入100 μL细胞悬液，37 ℃培养箱孵育24 h。

取出小室，吸弃孔内培养基，24孔板中加入600 μL体积分数4%多聚甲醛，室温固定细胞20 min。弃固定液，采用质量分数0.2%结晶紫溶液37 ˚C染色10 min；利用PBS洗涤3次去除游离染液，无菌棉签轻柔擦除小室上表面未迁移细胞。室温干燥后，于倒置光学显微镜80倍镜下随机选取5个视野拍照并计数穿膜细胞。

细胞侵袭实验操作步骤与迁移实验基本一致，仅提前在Transwell上室铺制基质胶^［5］，其余操作同迁移实验。

2.5 q-PCR实验

采用RNAiso试剂提取细胞总RNA，取2 μg总RNA反转录合成互补脱氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid，cDNA）。以SYBR-Green为荧光染料，配制总体积20 μL的反应混合物进行qPCR反应。采用2^-ΔΔCt法分析目的基因的相对表达量。qPCR反应条件：95 ˚C预变性15 min；随后40个循环：95 ˚C变性10 s，60 ˚C退火30 s，72 ˚C延伸20 s^［7］。引物序列见表1。

2.6 Western blotting实验

经酸枣仁皂苷A处理EO771细胞24 h后，收集细胞并利用PBS洗涤2次，加入蛋白裂解缓冲液置于冰上裂解30 min。检测蛋白质浓度后，加入蛋白上样缓冲液，95 ℃水浴煮沸10 min使蛋白质充分变性。取20 μg蛋白质样品上样，采用体积分数12%分离胶，120 V恒压进行电泳，电泳完成后转膜。转膜结束后，用质量分数5%脱脂牛奶室温封闭膜1 h；弃去封闭液，加入一抗4 ℃孵育过夜。利用PBS洗涤膜3次后，加入对应二抗室温孵育1 h，洗涤3次。最后采用化学发光成像系统采集蛋白条带图像^［6-7］。

2.7 统计学方法

采用SPSS 19.0软件对数据进行处理。计量资料以（\overline{x}±s）表示，使用单因素方差分析和Dunnett’s post hoc分析多组间的差异。P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 酸枣仁皂苷A抑制乳腺癌细胞增殖

酸枣仁皂苷A可显著抑制EO771细胞活力，且该抑制效应呈时间-剂量依赖性，且组间差异有统计学意义（P<0.05）。见图1。

3.2 酸枣仁皂苷A抑制乳腺癌细胞迁移和侵袭

酸枣仁皂苷A可显著抑制乳腺癌EO771细胞迁移能力，迁移抑制率随药物浓度升高而增大（P<0.05）。Transwell实验进一步证实，酸枣仁皂苷A以浓度依赖方式抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭（P<0.05）。MMP2、MMP9和VEGF-A是调控肿瘤迁移和侵袭的关键标志物。qPCR结果表明，酸枣仁皂苷A可下调MMP2、MMP9、VEGF-A的表达，且抑制作用呈浓度依赖性（P<0.05）。见图2。

3.3 酸枣仁皂苷A诱导乳腺癌细胞凋亡

流式细胞实验结果表明，酸枣仁皂苷A诱导乳腺癌细胞的凋亡比例增加，抑制作用与干预浓度成正比（P<0.05）。Western blotting实验结果表明，酸枣仁皂苷A增加促凋亡蛋白c-caspase 3和Bax的表达，减少抑凋亡蛋白Bcl-2的表达，上述作用与干预浓度成正比（P<0.05）。见图3。

3.4 酸枣仁皂苷A诱导癌细胞G0/G1期阻滞

流式细胞实验结果表明，酸枣仁皂苷A诱导EO771细胞发生G0/G1期阻滞，且上述作用与干预浓度成正比（P<0.05）。qPCR结果表明，酸枣仁皂苷A抑制了细胞周期相关基因cyclin D1、CDK4和CDK6的表达，且上述作用与干预浓度成正比（P<0.05）。见图4。

3.5 酸枣仁皂苷A抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路

PI3K/Akt/mTOR信号通路在多种肿瘤的发生中起着重要作用。Western blotting实验结果显示，酸枣仁皂苷A干预显著降低了p-PI3K、p-Akt和p-mTOR的蛋白质含量，且该抑制作用与干预浓度成正比（P<0.05）。见图5。

4 讨论

目前乳腺癌临床治疗以化疗、放疗为主，但存在明显不良反应，是制约临床疗效的主要问题^［1-2］。天然活性化合物因疗效确切、低毒的优点，成为抗肿瘤药物研发的热点。酸枣仁皂苷A是酸枣仁的核心活性成分，已有研究证实酸枣仁提取物具有抗肿瘤活性^［3-5］。但酸枣仁皂苷A对乳腺癌的作用及分子机制尚未见系统报道。本研究经体外实验证实，酸枣仁皂苷A可显著抑制乳腺癌EO771细胞的增殖、迁移和侵袭。既往研究结果显示，酸枣仁提取物能抑制肝癌、结直肠癌细胞的生长^［3，5］，与本研究的结果一致。

肿瘤细胞的迁移和侵袭依赖于细胞外基质降解及新生血管生成。MMP可降解细胞外基质，破坏肿瘤细胞侵袭的组织屏障，是肿瘤侵袭和转移的核心介质^［8-9］；VEGF-A可介导肿瘤新生血管形成，在乳腺癌进展中异常高表达^［10］。本研究结果显示，酸枣仁皂苷A可显著下调MMP2、MMP9和VEGF-A的表达，这也是其抑制乳腺癌细胞迁移、侵袭的重要分子机制。

c-caspase 3是细胞凋亡执行阶段的关键效应蛋白^［11］；抗凋亡蛋白Bcl-2在淋巴结和免疫系统其他器官中发生的癌症细胞中高度表达，可抑制细胞凋亡^［12］；而Bax和Bcl-2蛋白之间的平衡决定了细胞凋亡的发生率^［13］。本研究结果显示，酸枣仁皂苷A促进乳腺癌细胞的凋亡，且酸枣仁皂苷A干预后促凋亡蛋白Bax和c-caspase 3表达升高，而抑凋亡蛋白Bcl-2的含量下降。细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶是一组丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可以驱动细胞周期^［14］。在大多数癌症细胞中，CDK和细胞周期蛋白表达增加，CDK活性的增加可能与不受控制的细胞增殖有关^［15］。因此，靶向细胞周期障碍被认为是乳腺癌治疗的有效靶点^［14-17］。本研究证实，经酸枣仁皂苷A干预后，乳腺癌细胞G0/G1期细胞数量增加，而S期细胞数量减少；且酸枣仁皂苷A 干预后乳腺癌细胞周期相关蛋白cyclin D1、CDK4和CKD6的mRNA表达水平降低，最终诱导细胞发生G0/G1期周期阻滞。

为了进一步探究酸枣仁皂苷A抑制乳腺癌细胞的作用机制，课题组开展对PI3K/Akt/mTOR信号通路中关键分子表达量的检测。研究发现，酸枣仁皂苷A降低了PI3K、Akt和mTOR蛋白的磷酸化，抑制了PI3K/Akt/mTOR信号通路活化。大量研究证实，PI3k/Akt/mTOR通路作为治疗靶点，可以有效抑制肿瘤的进一步发展，包括乳腺癌、非小细胞肺癌^［17-20］。黄芪提取物通过下调PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制乳腺癌细胞转移^［21］。苦参碱和吉非替尼联合应用可抑制PI3K/Akt/mTOR通路从而促进肿瘤细胞凋亡^［22］。本研究还存在一些不足之处，例如未能在体验证酸枣仁皂苷A抑制乳腺癌的作用；在信号通路研究中仅观察了PI3K/Akt/mTOR通路蛋白的含量变化，未通过通路干预实验验证该通路的功能参与作用。后续课题组将进行进一步验证。

综上所述，酸枣仁皂苷A可能通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路活化抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，促进其凋亡，并诱导细胞发生G0/G1期阻滞。

参考文献

[1] Park M， Kim D， Ko S，et al ．Breast cancer metastasis：Mechanisms and therapeutic implications［J］．Int J Mol Sci，2022，23（12）：6806．

[2] 陈艳丽，李海平，姜丽娜，等 ．甘草多糖对乳腺癌细胞恶性生物学行为的影响及机制［J］．西北药学杂志，2022，37（5）：64-69．

[3] Chen Yanli， Li Haiping， Jiang Lina，et al ．Effects of Glycyrrhiza polysaccharide on malignant bioethology of breast cancer cells and its specific mechanism［J］．Northwest Pharmaceutical Journal，2022，37（5）：64-69．

[4] 徐吉敏，张世安，黄艳，等 ．MTT法研究酸枣仁皂苷A对肝细胞、肝星状细胞和肝癌细胞增殖的影响［J］．西北药学杂志，2013，28（3）：281-284．

[5] Xu Jimin， Zhang Shian， Huang Yan，et al ．Inhibitory effect of jujuboside A on proliferation of human normal liver cells，hepatic stellate cells and human hepatoma cells by MTT assay［J］．Northwest Pharmaceutical Journal，2013，28（3）：281-284．

[6] 陈霖，陈泉瑛，杜园，等 ．酸枣仁皂苷A对U251细胞凋亡的影响［J］．中国兽医杂志，2022，58（1）：70-74．

[7] Chen Lin， Chen Quanying， Du Yuan，et al ．Effects of jujuboside A on apoptosis of U251 cells［J］．Chinese Journal of Veterinary Medicine，2022，58（1）：70-74．

[8] Zhang P， Lai X， Zhu M H，et al ．Jujuboside B suppresses angiogenesis and tumor growth via blocking VEGFR2 signaling pathway［J］．Heliyon，2023，9（6）：e17072．

[9] Ruan Y， Zhu X， Shen J，et al ．Mechanism of Nicotiflorin in San-Ye-Qing rhizome for anti-inflammatory effect in ulcerative colitis［J］．Phytomedicine，2024，129：155564．

[10] Zhao W， Zhang L， Zhang Y，et al ．The CDK inhibitor AT7519 inhibits human glioblastoma cell growth by inducing apoptosis，pyroptosis and cell cycle arrest［J］．Cell Death Dis，2023，14（1）：11．

[11] Bassiouni W， Ali M A M， Schulz R ．Multifunctional intracellular matrix metalloproteinases：Implications in disease［J］．FEBS J，2021，288（24）：7162-7182．

[12] Knapinska A M， Fields G B ．The expanding role of MT1-MMP in cancer progression［J］．Pharmaceuticals （Basel），2019，12（2）：77．

[13] Liu Z Z， Duan X X， Yuan M C，et al ．Glucagon-like peptide-1 receptor activation by liraglutide promotes breast cancer through NOX4/ROS/VEGF pathway［J］．Life Sci，2022，294：120370．

[14] Bhat A A， Thapa R， Afzal O，et al ．The pyroptotic role of Caspase-3/GSDME signalling pathway among various cancer：A review［J］．Int J Biol Macromol，2023，242（Pt 2）：124832．

[15] Kaloni D， Diepstraten S T， Strasser A，et al ．BCL-2 protein family：Attractive targets for cancer therapy［J］．Apoptosis，2023，28（1）：20-38．

[16] McHenry M W， Shi P， Camara C M，et al ．Covalent inhibition of pro-apoptotic BAX［J］．Nat Chem Biol，2024，20（8）：1022-1032．

[17] Matthews H K， Bertoli C， de Bruin R A M ．Cell cycle control in cancer［J］．Nat Rev Mol Cell Biol，2022，23（1）：74-88．

[18] Wang Z ．Cell cycle progression and synchronization：An overview［M］//Cell-Cycle Synchronization．New York，NY：Springer，2022：3-23．

[19] Liu J， Peng Y， Wei W ．Cell cycle on the crossroad of tumorigenesis and cancer therapy［J］．Trends Cell Biol，2022，32（1）：30-44．

[20] Lin J， Liu G， Chen L，et al ．Targeting lactate-related cell cycle activities for cancer therapy［J］．Semin Cancer Biol，2022，86：1231-1243．

[21] Peng Y， Wang Y， Zhou C，et al ．PI3K/Akt/mTOR pathway and its role in cancer therapeutics：Are we making headway？［J］．Front Oncol，2022，12：819128．

[22] Yu L， Wei J， Liu P ．Attacking the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway for targeted therapeutic treatment in human cancer［J］．Semin Cancer Biol，2022，85：69-94．

[23] Alves C L， Ditzel H J ．Drugging the PI3K/AKT/mTOR pathway in ER+ breast cancer［J］．Int J Mol Sci，2023，24（5）：4522．

[24] Zhang X Q， Yao C， Bian W H，et al ．Effects of Astragaloside IV on treatment of breast cancer cells execute possibly through regulation of Nrf2 via PI3K/AKT/mTOR signaling pathway［J］．Food Sci Nutr，2019，7（11）：3403-3413．

[25] Zhang J， Qu Z， Yao H，et al ．An effective drug sensitizing agent increases gefitinib treatment by down regulating PI3K/Akt/mTOR pathway and up regulating autophagy in non-small cell lung cancer［J］．Biomed Pharmacother，2019，118：109169．

基金资助

国家自然科学基金项目(81901890)

昆山市重点研发计划项目(KSZ2224)

昆山市重点发展计划项目(KSF202104)

江苏省肿瘤小分子靶向治疗及伴随诊断工程研究中心开放课题(SGK1202415)