基于秀丽隐杆线虫模型探究拉萨小檗的抗衰老作用

Study on the anti-aging effect of Berberis hemsleyana Ahrendt based on Caenorhabditiselegans model

摘要

目的 以秀丽隐杆线虫（Caenorhabditiselegans，C. elegans）为模式生物，探究拉萨小檗在体内延缓衰老的活性。 方法 将秀丽隐杆线虫随机分为对照组和拉萨小檗低、中、高质量浓度组（L、M、H组，分别给予0.01、0.05、0.25 mg·mL^-1拉萨小檗），测定各组秀丽隐杆线虫的寿命、繁殖能力、体长、运动能力、抗应激能力及体内脂褐素含量变化。 结果 拉萨小檗可显著提升秀丽隐杆线虫的运动能力和抗应激水平，降低体内脂褐素积累，且不影响线虫的正常繁殖功能；与对照组比较，M组和H组线虫的寿命均有不同程度延长，寿命延长幅度为4.76%~9.52%。 结论 拉萨小檗具有良好的抗衰老药理活性，可为研发延缓衰老、延长健康寿命的天然药物提供实验依据与物质基础。

Abstract

Objective To investigate the anti-aging effect of Berberis hemsleyana Ahrendt using the model organism Caenorhabditis elegans （C. elegans）. Methods C. elegans were randomly divided into a control group and low-， medium-， and high-concentration Berberis hemsleyana Ahrendt groups （L， M， and H groups， treated with 0.01， 0.05， and 0.25 mg·mL^-¹ of Berberis hemsleyana Ahrendt， respectively）. The lifespan， reproductive capacity， body length， locomotor ability， stress resistance， and in vivo lipofuscin accumulation of C. elegans in each group were measured. Results Berberis hemsleyana Ahrendt significantly improved the locomotor ability and stress resistance of C. elegans， and markedly reduced in vivo lipofuscin accumulation， without affecting the normal reproductive function of the nematodes. Compared with the blank control group， the lifespans of nematodes in groups M and H were prolonged to varying degrees， with an extension rate ranging from 4.76% to 9.52%. Conclusion Berberis hemsleyana Ahrendt exhibits potent anti-aging pharmacological activity， which can provide an experimental basis and material foundation for the development of natural medicines aimed at delaying aging and improving healthspan.

Graphical abstract

关键词

秀丽隐杆线虫 / 拉萨小檗 / 抗衰老 / 脂褐素 / 寿命

Key words

Caenorhabditis elegans / Berberis hemsleyana Ahrendt / anti-aging / lipofuscin / lifespan

随着全球人口老龄化程度不断加深，抗衰老研究已成为生命科学领域的热门研究方向。衰老属于进程复杂且进展缓慢的生理变化，机体各组织器官的结构和功能逐步出现退行性改变，同时伴随基础代谢水平下降，免疫功能及抗氧化能力降低^［1-2］。依据第七次全国人口普查数据统计，西藏高原居民人均寿命为67岁，相较全国77.3岁的人均寿命低10岁^［3］。此外，人均寿命会随海拔高度的升高而缩减，海拔每增高100米，人均寿命便减少0.2岁，并且高原居民普遍存在早衰现象^［4-5］。

现阶段具备临床应用前景的抗衰老药物包括雷帕霉素靶蛋白抑制剂、二甲双胍等，这类药物在抗衰老相关研究中均表现出了一定作用效果，但长期服用往往会引起较为明显的不良反应^［6］。含有各类天然生物活性成分的药用植物，在传统医学体系中具备药用价值，且普遍不良反应较小，可为新型抗衰老药物的研发提供优质资源。

拉萨小檗（Berberis hemsleyana Ahrendt）归属于小檗科小檗属，是生长在青藏高原区域的特色植物。该物种为落叶灌木，植株高达2 m，大多生长在海拔3 600~4 400 m的灌木丛、草坡以及山石缝隙处^［7］。目前针对拉萨小檗的国内外相关研究较少，但其同科属药用植物常用于赤痢、黄疸、咽喉肿痛、目赤、跌打损伤等病症的治疗，植株内部主要含有小檗碱、木兰花碱、药根碱等生物碱类有效成分^［8］。小檗碱也常被称为黄连素，是常见的异喹啉生物碱，作为天然提取物具有多种药理活性，也是临床治疗肠道感染、腹泻病症的经典药物^［9-11］。现代药学研究证实，小檗碱对动脉粥样硬化、心血管疾病、糖尿病等病症均有良好的干预效果，同时该成分不良反应少，应用前景广阔，因此富含小檗碱的拉萨小檗具有较高的药学研究价值^［12-14］。

秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans，C. elegans）作为经典模式生物，因其生命周期简单、易于培养、遗传背景清晰，在生物学研究领域扮演着重要角色^［15］。特别是秀丽隐杆线虫的衰老过程与人类相似性较高，使其成为研究衰老机制、研发抗衰老手段的理想模型^［16］。

本研究以秀丽隐杆线虫为模型生物，探究拉萨小檗的抗衰老作用，分析拉萨小檗醇提取物对线虫生理功能、寿命延长以及衰老相关病理变化的影响，以期为人类健康养护和抗衰老领域研究提供新思路和新材料。

1 仪器与材料

1.1 仪器

KM-615C型超声清洗机（广州市科洁盟实验仪器有限公司）；Buchir R-300型旋转蒸发仪（瑞士BÜCHI公司）；DGG-9420A型鼓风干燥箱（上海济欣科学仪器有限公司）；RB-CJ-IND型超净工作台（北京瑞邦精控科技有限公司）；HWS-150B型恒温恒湿培养箱（绍兴市昇辉仪器有限公司），XP205型天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；LDZX-50L型高压灭菌锅（上海东亚压力容器制造有限公司）；GL0650R型离心机（莫纳生物科技有限公司）；LEICA ICC50型光学显微镜（德国徕卡公司）；DYS-880型倒置荧光显微镜（上海点应光学仪器有限公司）；EG7XCG3-NA型微波炉（广东美的厨房电器制造有限公司）。

1.2 试药

琼脂糖（批号202331113）、TAE（批号20220314），均购自北京索莱宝科技有限公司；5-氟尿嘧啶（批号20230703，上海毕得医药科技有限公司）；线虫生长培养基（nematode growth medium，NGM，批号20240301）、M9线虫缓冲液（批号HP20231129a），均购自山东拓普生物工程有限公司；LB培养基（批号20230925，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司）。盐酸四咪唑（批号B23703）、次氯酸钠（批号W13572），均购自上海源叶生物科技有限公司。

拉萨小檗（Berberis hemsleyana Ahrendt）采自西藏自治区拉萨市当雄县，经西藏大学卓玛东智副教授鉴定为小檗科小檗属的拉萨小檗。

1.3 线虫与细菌

野生型秀丽隐杆线虫N2株、尿嘧啶缺陷型大肠埃希氏菌OP50（Escherichia coli OP50，E.coli OP50）株，由中国药科大学戴文玲老师惠赠。

2 方法

2.1 线虫培养及虫体同期化处理

采用NGM培养基培育野生型秀丽隐杆线虫N2，待虫卵数量充足时，使用M9缓冲液冲洗培养皿收集虫体，将虫体混合液移入离心管，静置等待虫体自然沉降，去除上层清液，将液体体积调整为3.5 mL，加入1.5 mL线虫裂解液，快速振荡8 min后，以1 000 r·min^-1离心2 min，弃去上清液，使用M9缓冲液重复清洗3次，清洗后吸去上清，留存约0.5 mL液体并混匀，将虫卵混悬液均匀涂布在NGM平板表面，置于20 ℃恒温恒湿环境中培养。

2.2 拉萨小檗醇提物的制备与给药方式

2.2.1 拉萨小檗醇提物的制备

将拉萨小檗外皮剥离并充分阴干，粉碎后过2号筛，称取粉末样品2.01 g，加入200 mL甲醇溶液超声提取30 min，减压旋蒸直至体系无醇味，最终得到粗提浸膏，本次提取率为12.16%。

2.2.2 给药方式

将线虫随机划分组别，分别置于对照组培养基（0 mg·mL^-1）和含有不同质量浓度（0.01、0.05、0.25、1.25 mg·mL^-1）拉萨小檗药液，且涂布E. coli OP50菌液的NGM板上，每隔2 d更换同等质量浓度、接种E. coli OP50的全新NGM培养平板。

2.3 E. coli OP50生长曲线的测定

将配置完成的菌悬液按照1%接种量，分别加入添加不同质量浓度（0.01、0.05、0.25、1.25 mg·mL^-1）拉萨小檗药液的培养液中作为阳性组，对照组不添加拉萨小檗药液，阴性组不加入菌液，所有组别均置于37 ℃条件下培养24 h，每2 h取样一次，测定600 nm波长处的吸光度值（A₆₀₀）。绘制菌株生长变化曲线。

2.4 毒性的检测

将同期化处理后的L4期野生型N2线虫，转移到含有不同质量浓度（0.01、0.05、0.25、1.25 mg·mL^-1）的拉萨小檗药液和不含药液的含菌培养皿中常规培养。分别培养48、72 h后观察线虫的存活状态。以铂丝轻碰秀丽线虫躯体，10 s内无活动反应即判断线虫死亡，实验过程剔除意外死亡、爬壁失水死亡以及囊袋虫个体。

2.5 线虫寿命的检测

参照2.1项下方法培育线虫，将同期化虫体置于20 ℃恒温环境培养至L4期，挑选30条健康线虫，转移至添加5-氟尿嘧啶、涂布E.coli OP50菌液的NGM培养皿中培养。每日统计死亡个体和存活个体的数量，每组检测30条线虫，重复3次。

2.6 线虫体长的检测

按照2.1项下方法完成线虫同期化培育，在20 ℃恒温条件下培养至L4期，实验过程每隔2 d将给药线虫转移至新平板，避免子代虫体干扰检测结果。给药培养第5天，将培养皿放入60 ℃烘箱中固定10 min，借助显微镜拍摄虫体图像，运用Image J软件测量单条线虫体长。每组检测30条线虫，重复3次。

2.7 运动能力的检测

按照2.1项下方法完成线虫同期化培育，在20 ℃恒温条件下培养至L4期，分组给药，培养期间每2 d更换新培养基，避免子代干扰。在给药第5天观察线虫运动状态，统计30 s内虫体咽泵蠕动频次、头部摆动次数及躯体弯曲次数3项运动指标。每组检测30条线虫，重复3次。

2.8 繁殖能力的检测

按照2.1项下方法完成线虫同期化培育，在20 ℃恒温条件下培养至L4期，分组给药，每隔24 h将单条线虫转移到全新平板上，待子代生长至L2、L3幼虫阶段并统计后代数量，以5 d内繁育总个体数量代表单条线虫的繁殖能力。每组检测5条线虫，重复3次。

2.9 抗应激能力的检测

2.9.1 抗紫外应激能力的检测

按照2.1项下方法完成线虫同期化培育，在20 ℃恒温条件下培养至L4期，分组给药，每隔2 d将给药线虫转移至全新平板上，避免子代干扰。给药第5天对虫体进行紫外照射处理，每小时统计线虫的存活数量，直至线虫全部死亡。每组检测60条线虫，重复3次。

2.9.2 抗热应激能力的检测

按照2.1项下方法完成线虫同期化培育，在20 ℃恒温条件下培养至L4期，分组给药，每隔2 d将给药线虫转移至全新平板上，避免子代干扰。给药第5天将线虫置于37 ℃培养箱内培养，每小时统计线虫的存活数量，直至线虫全部死亡。每组检测60条线虫，重复3次。

2.10 线虫体内脂褐素含量的测定

按照2.1项下方法完成线虫同期化培育，在20 ℃恒温条件下培养至L4期后，挑选30条健康线虫个体，放置于添加5-氟尿嘧啶、涂布E.coli OP50菌液的NGM培养皿中给药培养。培养第10天使用M9缓冲液收集线虫，反复清洗3次，采用盐酸四咪唑溶液麻醉线虫2 min后离心富集，去除上清液，使用M9缓冲液调节线虫密度。吸取20 µL麻醉后的线虫样本滴加到体积分数2%琼脂糖垫片上，加盖玻片后通过荧光显微镜观察并拍摄成像，使用Image J软件分析线虫体内脂褐素自发荧光强度。每组检测30条线虫，重复3次。

2.11 统计学方法

采用Graphpad Pism 8软件对实验数据进行处理。2组数据比较采用t检验分析，所有实验均设置 3 次重复实验。

3 结果

3.1 拉萨小檗醇提物对E.coli OP50生长的影响

E.coli OP50作为线虫的主要食物来源，其生长受到抑制可能会干扰药物抗逆性相关检测结果的判定^［17］。为排除拉萨小檗醇提取物对E.coli OP50生长的潜在影响，确保后续线虫实验数据的可靠性，本研究对比分析了用不同质量浓度拉萨小檗醇提取物处理后的细菌菌株生长曲线。结果显示，各组细菌培养4 h后进入对数生长期，14 h后达到稳定期，A₆₀₀值维持在0.9~1.3。上述结果表明，实验所设质量浓度（0.01、0.05、0.25、1.25 mg·mL^-1）的拉萨小檗醇提取物对E. coli OP50生长无抑制效应，该质量浓度范围可用于后续线虫实验。见图1。

3.2 拉萨小檗醇提取物对线虫的毒性实验

毒性检测结果显示，质量浓度≤0.25 mg·mL^-1的拉萨小檗醇提取物对线虫未表现出明显的毒性损伤；当质量浓度升至1.25 mg·mL^-1并作用72 h后，线虫存活率出现显著下降，表明该质量浓度具有明显毒性作用。见图2。因此，选取0.01、0.05、0.25 mg·mL^-1 3个安全质量浓度开展后续实验，并依次设定为低、中、高质量浓度组（L、H、M组，分别给予0.01、0.05、0.25 mg·mL^-1拉萨小檗醇提取物），同时设置对照组（C组）。

3.3 拉萨小檗醇提取物对线虫寿命的影响

线虫自然寿命是对抗衰老研究中最直观的评价指标^［18］。结果显示，拉萨小檗醇提取物可显著影响线虫寿命。与C组比较，M组和H组线虫寿命均有不同程度延长，增幅为4.76%~9.52%，表明其具有潜在的延缓衰老作用。见图3。

3.4 拉萨小檗醇提物对线虫运动能力的影响

运动能力和吞咽频率是反映线虫活力的重要指标，其中身体弯曲频率和头部摆动频率为运动能力的基本参数，而吞咽频率随着年龄增长呈下降趋势^［19］。与C组比较，L组、M组、H组的头部摆动频率均显著提高，其中H组的身体弯曲频率和吞咽频率均显著提高（P<0.05）。见图4。

3.5 拉萨小檗醇提取物对线虫体长的影响

线虫体长可反映其生长发育状况，用以评估受试物是否具有发育毒性。与C组比较，L组、M组、H组线虫体长比较差异均无统计学意义，表明该提取物在实验质量浓度范围内对线虫的生长发育无不良影响。见图5。

3.6 拉萨小檗醇提取物对线虫生殖能力的影响

生殖能力是研究线虫衰老的重要指标之一，部分延长寿命的活性物质可能并不影响其生殖能力。与C组比较，L组、M组、H组线虫产卵数量比较差异均无统计学意义。见图6。

3.7 拉萨小檗醇提取物对线虫抗应激的影响

延长寿命通常与应激抵抗力增强相关，因此本研究进一步观察了热应激和紫外应激条件下拉萨小檗醇提取物对线虫的影响^［20］。高温环境可诱发线虫代谢紊乱并缩短寿命。结果显示，在37 ℃培养条件下，各组线虫的存活率均随时间下降；与C组比较，L组、M组、H组线虫的生存曲线均右移，提示线虫存活率升高。紫外应激实验结果显示，与C组比较，L组、M组、H组线虫的生存曲线右移，表明拉萨小檗醇提取物可提高线虫抵抗紫外损伤的能力。综上所述，拉萨小檗醇提取物能够增强线虫对热应激和紫外应激的抵抗力，提高线虫在应激状态下的存活率，对应激条件下的线虫具有保护作用。见图7。

3.8 拉萨小檗醇提取物对线虫体内脂褐素的影响

脂褐素具有自发荧光特性，其在线虫体内的积累量随年龄增长而逐渐增加，荧光强度可反映衰老的进程。与C组比较，L组、M组、H组线虫体内脂褐素荧光强度均降低，其中M组和H组显著降低（P<0.05），表明该提取物可通过增强线虫抗氧化能力，减少体内脂褐素的形成和积累。见图8。

4 讨论

秀丽隐杆线虫作为模式生物，其寿命调控机制与人类衰老过程具有一定相似性，因此，基于该模型的抗衰老研究结果可为高原环境下人类抗衰老策略提供实验依据^［21-24］。

实验结果表明，质量浓度为0.05、0.25 mg·mL^-1时拉萨小檗醇提取物可使线虫寿命延长4.76%~9.52%。质量浓度为0.25 mg·mL^-1时可显著提高线虫的运动能力及抗应激能力，并降低脂褐素荧光强度。上述发现提示拉萨小檗可能具有抗衰老活性。已有研究表明，应激抵抗能力的提高与生物体寿命延长密切相关。赵丹丹等^［25］研究发现，梓醇可通过调节daf-2和daf-16基因，促进下游抗氧化基因表达，进而延长线虫寿命。刘泽坤等^［26］通过转录组学京都基因和基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析发现，山药多糖可通过调节自噬、mTOR及胰岛素信号通路延缓线虫衰老。基于此，后续研究可进一步探讨拉萨小檗醇提取物抗衰老的可能机制，包括抑制氧化应激、调控基因表达及诱导自噬等多方面。此外，高原特殊环境可能影响拉萨小檗的活性成分构成及其生物学效应，值得深度关注。未来应重点研究拉萨小檗抗衰老作用的分子机制，尤其聚焦其对线虫基因表达谱及代谢通路的影响。尽管线虫与人类存在生理差异，但拉萨小檗对线虫的抗衰老效果为发掘潜在抗衰老候选药物提供了实验依据。后续还需在哺乳动物模型中验证拉萨小檗的抗衰老活性，为其临床转化提供更充分的实验依据。

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基金资助

西藏自治区科技厅中央引导地方科技发展资金项目(XZ202301YD0016C)

西藏自治区拉萨市科技计划项目(LSKJ202321)

西藏大学高水平人才项目(GSP-S124)