全血来源NK细胞分离纯化技术体系的初步构建

摘要

目的 探索全血为同种异体CAR NK细胞疗法与激活NK细胞回输疗法提供NK原料细胞的可行性，初步构建全血来源NK细胞分离纯化技术体系。方法 分别采用手工分离和机器分离从400 mL全血中富集全部外周血单个核细胞(PBMCs),比较2种方式的红细胞损耗率、PBMCs细胞数量、NK细胞纯度，分别采用3种分离富集方法(免疫磁珠阴性选择法、血小板裂解液培养扩增法、PERCOLL密度梯度分离法)从PBMCs中分选NK细胞，比较3种分离富集方法的NK细胞纯度与得率、NK细胞的活性、肿瘤杀伤能力。结果 从全血中富集PBMCs, NK细胞占淋巴细胞群的比例手工分离法高于机器分离法[(13.16±5.16)%vs(8.56±3.92)%,P<0.05],PBMCs细胞数量手工分离法低于机器分离法[(4.09±1.80)×10～8vs(6.49±2.16)×10～8,P<0.05],红细胞损耗率2种方法无差异(P>0.05)。采用免疫磁珠阴性选择法从手工分离的PBMCs中分离富集的NK细胞纯度为(96.77±2.31)%,得率为(56.27±10.47)%,NK细胞肿瘤增殖抑制率为(38.67±14.05)%,肿瘤杀伤率为(19.90±8.05)%。采用血小板裂解液培养扩增法从手工分离的PBMCs中分离富集的NK细胞在d7时纯度最高，为(54.84±15.80)%,细胞扩增倍数在d7可达16.92±6.28,NK细胞体外肿瘤杀伤率为(15.83±5.5)%,肿瘤增殖抑制率为(44.33±13.5)%,上述2种方法的NK细胞毒性及活性无差异(P>0.05)。采用PERCOLL密度梯度分离法分离富集的NK细胞纯度为(15.83±5.82)%,得率为(14±6.25)%,显著低于另2种方法。结论 通过手工分离从全血中提取PBMCs,采用免疫磁珠阴性选择法分离富集的NK细胞具备为CAR-NK细胞疗法提供NK细胞原料的潜力，采用血小板裂解液条件培养基法分离富集的NK细胞具备为大量NK细胞激活回输疗法提供NK细胞的潜力。

关键词

NK细胞 / 全血 / 分离纯化 / 细胞免疫治疗