单采血小板中囊泡亚型的蛋白质组学特征与功能调控研究

摘要

目的 检测单采血小板在储存过程中释放的胞外囊泡—微囊泡(MVs)与外泌体(EXOs)的不同蛋白质组学特征，并探究其介导血小板储存损伤(PSL)的关键分子机制。方法 从留样袋中收集储存d3的单采血小板标本，通过差速离心技术分离MVs及EXOs。分别提取血小板、MVs与EXOs 3组蛋白标本，进行定量蛋白质组学技术检测差异表达蛋白。进一步采用MVs、EXOs与新鲜血小板共孵育模型评估胞外囊泡对PSL的影响：通过光学比浊法评估血小板对胶原激动剂的聚集反应和ATP释放率的变化；流式细胞术评估血小板早期活化指标(P-selectin和PAC-1)和线粒体膜电位的变化；Western blot检测血小板活化与凋亡关键蛋白(P-selectin、Integrin β3和Bcl-xl)表达的变化。结果 蛋白质组学分析显示血小板、MVs与EXOs 3组标本的蛋白表达谱在潜变量空间呈现显著分离，MVs特异性富集线粒体呼吸链复合物、氧化磷酸化等能量代谢相关蛋白，EXOs则富集炎症相关蛋白。共孵育实验证实胞外囊泡能显著诱导血小板对激动剂的反应(MVs组最大聚集率提高187.36%,P<0.001;EXOs组提高71.26%,P=0.002);血小板最大ATP释放率提高(MVs组275.44%,P<0.001,EXOs组70.18%,P=0.015)。流式细胞术检测P-selectin表达增加(MVs组119.33%,P<0.001;EXOs组37.95%,P=0.013)。PAC-1结合率提升(MVs组132.18%,P<0.001;EXOs组21.41%,P=0.043)。线粒体膜电位下降(MVs组20.49%,P<0.001;EXOs组9.73%,P=0.044)。MVs组血小板P-selectin和Integrin β3显著升高(100.83%和395.64%,P<0.001),Bcl-xl较对照组降低(83.94%,P<0.001);EXOs组P-selectin和Integrinβ3较对照组升高(27.89%和181.91%,P=0.007和P=0.002),Bcl-xl较对照组降低(36.52%,P<0.001)。结论 储存血小板来源的MVs和EXOs表现出不同的蛋白质组学特征。相较于EXOs, MVs在诱导线粒体功能障碍方面作用更强，并能促进包括血小板活化和凋亡在内的PSL反应。

关键词

单采血小板 / 外泌体 / 微囊泡 / 储存损伤 / 线粒体膜电位