Q层析的加入对人纤维蛋白溶酶原亲和层析回收率的影响

摘要

目的 通过比较人纤维蛋白溶酶原(plasminogen, Pg)全层析工艺加入Q层析步骤前后的过程，样品的质量控制(相对纯度和比活性)和工艺控制(Pg抗原回收率和效价回收率)指标，确定该步骤的加入能否提高Pg亲和层析的回收率。方法 在原有的Pg全层析纯化工艺中的Pg亲和层析前加入Q层析步骤，收集Q层析和Pg亲和层析的上样液、流穿液和洗脱液，用凝固法进行凝血因子Ⅱ((FactorⅡ,FⅡ)、凝血因子Ⅶ(FactorⅦ,FⅦ)、凝血因子Ⅷ(FactorⅧ,FⅧ)、凝血因子Ⅸ(FactorⅨ,FⅨ)、凝血因子Ⅹ(FactorⅩ,FⅩ)效价检测，用BCA法进行总蛋白含量检测，用发色底物法进行Pg效价检测，用免疫比浊法进行特定血浆蛋白的含量检测，计算凝血因子的效价回收率，分析凝血因子的流向；计算不同血浆蛋白抗原含量的回收率，分析杂蛋白的分布；计算目标组分中Pg相对纯度和比活性，抗原含量和效价回收率，与原始工艺指标进行比较，判断Q层析步骤的加入对原始工艺的影响，并考察工艺变更后的重复性。结果 Q层析去除了过滤后血浆中100%的FⅡ、FⅩ、FⅨ,87.81%的FⅧ、40.44%的FⅦ,其流穿液中残留的FⅦ(53.26%)和FⅧ(13.30%),被Pg亲和层析完全去除。未加Q层析的原始工艺和加Q层析的变更工艺中能检测出的非目标血浆蛋白均主要存在于Pg亲和层析的流穿液中；Q层析流穿液中除了IgM、CER、FNC的抗原回收率稍低外，其它血浆蛋白(IgG、IgA、Pg、AlB、AAT、Fg)的抗原回收率均>90%,与原始工艺的亲和层析上样液的蛋白组成和比例基本一致；与原始工艺中Pg亲和洗脱液的Pg抗原回收率(74.4%)相比，变更工艺中Pg亲和洗脱液的Pg抗原总回收率明显升高(89.97%),与原始工艺中Pg亲和流穿液中IgG(97.48%)和Fg(95.32%)的回收率相比，变更工艺中的Pg亲和流穿液中IgG回收率略有减少(94.60%),Fg回收率不受影响(95.05%)。血浆Pg经过Q层析后流穿液的效价回收率为99.3%,其比活性为0.016 U/mg,相对纯度为0.15%,与原始工艺的Pg亲和层析上样液的指标基本一致，说明Q层析对Pg后续的亲和层析无影响；与3批原始工艺的Pg抗原回收率(66.49±1.02)%相比，加入Q层析后5次变更工艺批的亲和层析洗脱液中Pg抗原回收率(77.43±4.43)%有明显提高，效价回收率为(86.80±4.28)%,相对纯度为(81.99±1.25)%,比活性为(8.679±1.073)U/mg,工艺重复性好。结论 Q层析的加入，能提高全层析工艺中Pg亲和层析的回收率。

关键词

人纤维蛋白溶酶原 / 全层析工艺 / 相对纯度 / 效价回收率 / 抗原回收率 / 比活性